腎衰泄?jié)釡捌洳鸱綄?duì)UUO大鼠VEGF/VEGFR信號(hào)通路的影響

萬鳴宏 羅富里 江堅(jiān)青 魏志鑫 晏子友▲

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌 330000；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，江西南昌 330004

腎間質(zhì)纖維化（RIF）是大部分慢性腎臟病發(fā)展到尿毒癥時(shí)均會(huì)出現(xiàn)的病理表現(xiàn)。其形成與周細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（PMT）有關(guān)，腎臟損傷使血小板衍生生長因子、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號(hào)通路被激活，周細(xì)胞持續(xù)向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，形成腎間質(zhì)纖維化[1]。其中，血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）主要見于腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中，而血管內(nèi)皮生長因子受體A（VEGFA）則可刺激內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞遷移[2]。PMT過程使細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）持續(xù)累積，最終結(jié)果導(dǎo)致正常腎臟結(jié)構(gòu)被破壞[3]。α-平滑肌激動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)與ECM的增多呈正相關(guān)，且為周細(xì)胞的標(biāo)志性分子[4]。慢性腎臟病的中醫(yī)病因可歸結(jié)于虛、濕、瘀、毒[5]，腎衰泄?jié)釡且酝ǜ節(jié)峄鰹榉ǘ瞥傻闹兴帍?fù)方，可能通過抑制VEGF信號(hào)通路的激活，進(jìn)而改善腎功能。因此，本研究通過觀察腎衰泄?jié)釡捌洳鸱綄?duì)UUO大鼠模型中α-SMA及VEGF/VEGFR信號(hào)通路分子蛋白表達(dá)的影響，探究腎衰泄?jié)釡捌洳鸱綄?duì)RIF可能的治療途徑，為中藥治療腎纖維化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與造模

取144只SD雌性大鼠[SPF級(jí)，合格證號(hào)：SCSK（浙）20170001，購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心]，體重180～200g，適應(yīng)喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為 6組：（1）假手術(shù)組、（2）模型組、（3）腎衰泄?jié)釡M、（4）補(bǔ)虛方組、（5）袪邪方組、（6）貝那普利組，每組24只，常規(guī)分籠飼養(yǎng)。UUO動(dòng)物模型參考文獻(xiàn)[6]制作：實(shí)驗(yàn)大鼠于手術(shù)前12h 禁食、不禁水，術(shù)前稱重，然后腹腔注射5.0%水合氯醛（10 ml/kg體重），待大鼠麻醉后，俯臥固定于手術(shù)臺(tái)，行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，假手術(shù)組只作分離。

1.2 藥物及試劑

腎衰泄?jié)釡M[生大黃10 g（后下）、巴戟天10 g、生黃芪30 g、丹參15 g、蒲公英15 g、槐花10 g、生牡蠣 30 g]、補(bǔ)虛方組（生黃芪 30 g、巴戟天 10 g）、袪邪方組 [生大黃 10 g（后下）、丹參 15 g、槐花 10 g、蒲公英15 g、生牡蠣30 g]。所有三種中藥（均來自江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠）常規(guī)水煎，濃縮成如下劑量：每毫升含0.8 g生藥量，每袋150 ml，真空密封包裝，存于4℃冰箱。

福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供HE 染色試劑盒、Masson染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒；北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供磷酸緩沖液（PBS）。鹽酸貝那普利（洛丁新，北京諾華制藥有限公司，規(guī)格：10 mg/片，H2003014）。

1.3 治療方法

術(shù)后第3天，中藥治療組大鼠按10倍于臨床用藥劑量（即成人劑量10倍）折算為等效劑量給藥，即（3）（4）（5）組分別按 0.8 g/ml 腎衰泄?jié)釡?、補(bǔ)虛方、袪邪方濃縮劑給藥，劑量均為8.0 g/（kg·d）灌胃；（6）組大鼠貝那普利 1.5 mg/（kg·d）灌胃，假手術(shù)組、模型組予等量生理鹽水灌胃。術(shù)后第7、14、21天給藥，2 h后腹主動(dòng)脈取血并處死，將血液滴入含0.4 ml，4% EDTA-Na2抗凝管中，離心250 g×10 min并分離血清，于-20℃冰箱保存。

1.4 檢測方法

1.4.1 腎組織學(xué)檢查 腎組織標(biāo)本經(jīng)4%福爾馬林液、石蠟處理后制成約4 μm 厚切片，行HE及Masson染色。取一塊經(jīng)2.5%戊二醛、1%鋨酸固定，Epon812、醋酸鈾-枸椽酸鉛處理后的0.5 mm3腎髓質(zhì)組織，電鏡（H-600 型）觀察腎組織每個(gè)時(shí)間段變化。

1.4.2 HE及Masson染色 腎臟組織行HE染色后，根據(jù)腎臟損傷指數(shù)觀察指標(biāo)（腎小管擴(kuò)張、腎小管萎縮、腎小管上皮空泡變性等）。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)互不重疊的皮質(zhì)處腎小管視野（×400倍），每只大鼠選5張組織切片，按參考文獻(xiàn)[7]Banff分級(jí)計(jì)分（0～3分），取平均值。腎臟組織行Masson 染色，每只大鼠選取5張組織切片，每張切片隨機(jī)選10個(gè)互不重疊的皮質(zhì)處腎小管間質(zhì)視野（×400倍），根據(jù)文獻(xiàn)[1]視野中膠原染色陽性面積占整個(gè)視野面積的百分比評(píng)分（0～4分），計(jì)分完成后取平均值。

1.4.3 腎組織蛋白表達(dá) Western blot 法測定術(shù)側(cè)腎臟組織勻漿α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（）表示，計(jì)數(shù)資料比較采用方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織病理變化

光鏡下，假手術(shù)組無明顯病理變化。術(shù)后第7天，觀察各組組織主要為炎癥和壞死病變；術(shù)后第21天，模型組組織較其他組纖維化、炎癥程度更嚴(yán)重，且正常腎臟結(jié)構(gòu)喪失，可見部分鈣化甚至壞死。中藥治療的三組及貝納普利組表現(xiàn)優(yōu)于模型組，可觀察到腎組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小球病變不明顯，可見不同程度炎癥細(xì)胞浸潤；其中腎衰泄?jié)釡M病變相對(duì)其他治療組較好。電鏡下，UUO大鼠造模后術(shù)側(cè)腎小管間質(zhì)出現(xiàn)成纖維細(xì)胞，且細(xì)胞核固縮、線粒體嵴消失、腎小管基底膜增厚，膠原纖維排列規(guī)則；第14天見少量膠原纖維，腎小管間質(zhì)膠原纖維明顯增多；第21天腎小管間質(zhì)開始出現(xiàn)大量膠原纖維，且腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞核固縮。經(jīng)治療后上述表現(xiàn)有所改善，腎衰泄?jié)釡M改善較其他組明顯。

2.2 各組大鼠術(shù)側(cè)腎臟HE評(píng)分和Masson評(píng)分

假手術(shù)組大鼠第7、14、21天HE評(píng)分、Masson評(píng)分無明顯變化。模型組大鼠第7、14、21天HE評(píng)分和Masson評(píng)分較假手術(shù)組升高明顯（P＜0.05），各治療組第14、21天 HE評(píng)分和Masson評(píng)分明顯低于模型組（P＜0.05），腎衰泄?jié)釡M第21天 HE評(píng)分和Masson評(píng)分明顯低于其他三個(gè)治療組，祛邪組第14、21天HE評(píng)分和Masson評(píng)分明顯低于補(bǔ)虛方組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠HE評(píng)分和Masson評(píng)分（±s，分）

表1 各組大鼠HE評(píng)分和Masson評(píng)分（±s，分）

注：與同時(shí)段模型組及各治療組比較，△P＜0.05；與同時(shí)段各治療組比較，#P＜0.05；與同時(shí)段不同治療組比較，*P＜0.05；與同時(shí)段祛邪方組比較，※P＜0.05

組別 天數(shù) 只數(shù) HE評(píng)分 Masson評(píng)分假手術(shù)組 7 8 0.21±0.12△ 0.34±0.11△14 8 0.23±0.11△ 0.34±0.12△21 8 0.24±0.12△ 0.32±0.16△模型組 7 8 1.69±0.56# 1.61±0.42#14 8 2.42±0.53# 2.20±0.47#21 8 2.86±0.43# 3.46±0.33#腎衰泄?jié)釡M 7 8 1.11±0.23* 0.74±0.22*14 8 1.52±0.33* 1.02±0.32*21 8 1.06±0.18* 1.13±0.45*祛邪方組 7 8 1.32±0.29 0.83±0.18 14 8 1.59±0.34 1.22±0.39 21 8 1.22±0.28 1.35±0.28補(bǔ)虛方組 7 8 1.33±0.32 0.88±0.18 14 8 1.61±0.37※ 1.25±0.49※21 8 1.31±0.14※ 1.53±0.34※貝那普利組 7 8 1.34±0.33 0.87±0.19 14 8 1.67±0.32 1.23±0.42 21 8 1.22±0.31 1.37±0.41

2.3 各組大鼠腎組織α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白表達(dá)量比較

假手術(shù)組大鼠可見少量α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白表達(dá)。建立UUO模型后各組大鼠α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），并隨著時(shí)間增長逐漸上升。在第14天時(shí)各治療組蛋白表達(dá)較模型組稍有升高 （P＜0.05）；在第21天時(shí)，各治療組大鼠 α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白表達(dá)量較模型組均有不同程度下降，補(bǔ)虛方、祛邪方組VEGFA蛋白表達(dá)稍有提升（P＜0.05）；第21天時(shí)，補(bǔ)虛方組α-SMA蛋白表達(dá)較祛邪方組稍有下降（P＜0.05），腎衰泄?jié)釡M與其他治療組比較，α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白的表達(dá)量下降更明顯（P＜0.05），表明腎衰泄?jié)釡闹委熜Ч麅?yōu)于其他組。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白表達(dá)的比較

表2 各組大鼠UUO模型中Western blot檢測各個(gè)蛋白指標(biāo)相對(duì)表達(dá)量（±s）

表2 各組大鼠UUO模型中Western blot檢測各個(gè)蛋白指標(biāo)相對(duì)表達(dá)量（±s）

注： 與同時(shí)段模型組及各治療組比較，△P＜0.05；與同時(shí)段各治療組比較，#P＜0.05；與同時(shí)段不同治療組比較，*P＜0.05；與同時(shí)段祛邪方組比較，※P＜0.05

組別 天數(shù) 只數(shù) α-SMA VEGFA VEGFR2假手術(shù)組 7 8 9.38±0.05 7.92±0.06 4.17±0.05 14 8 8.82±0.07△ 8.32±0.06△ 2.93±0.07△21 8 8.62±0.04△ 10.12±0.05△ 7.32±0.06△模型組 7 8 9.03±0.04 9.53±0.06 3.46±0.07 14 8 16.32±0.04# 8.91±0.04# 5.73±0.08#21 8 25.08±0.06# 22.02±0.07# 13.93±0.07#貝那普利組7 8 9.47±0.05 9.22±0.06 4.37±0.06 14 8 17.87±0.06 10.24±0.04 12.67±0.07 21 8 24.59±0.04 20.32±0.07 13.11±0.07腎衰泄?jié)釡M7 8 9.61±0.04 9.53±0.06 4.82±0.05 14 8 16.56±0.06 12.42±0.06 13.19±0.05 21 8 24.08±0.06* 18.54±0.06* 12.29±0.08*補(bǔ)虛方組7 8 9.83±0.06 9.80±0.06 5.55±0.04 14 8 20.77±0.06 11.79±0.06 14.07±0.06 21 8 24.63±0.05※ 22.87±0.06 13.06±0.06袪邪方組7 8 9.81±0.05 10.61±0.06 5.18±0.05 14 8 20.22±0.07 11.37±0.05 13.63±0.06 21 8 24.74±0.06 23.28±0.06 13.84±0.07

3 討論

隨著慢性腎臟病發(fā)病率的提升，RIF患者的數(shù)量也在逐漸提升[8]。故如何延緩RIF進(jìn)程已成為當(dāng)代研究熱點(diǎn)。纖維化與數(shù)個(gè)生長因子及信號(hào)通路有關(guān)，如何抑制生長因子及信號(hào)通路的表達(dá)，是延緩纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵[9-10]。纖維化時(shí)，周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞分離，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、微血管裂解，導(dǎo)致組織缺氧以及ECM的沉積[11]。VEGF參與RIF的形成過程，其主要作用是調(diào)節(jié)血管的生成、通透性，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，內(nèi)皮功能受損、組織缺氧等因素均可能導(dǎo)致VEGF水平升高[12]。VEGF信號(hào)通路可為PMT產(chǎn)生的ECM及膠原纖維提供營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而加重腎纖維化[13]，同時(shí)表明，阻斷VEGF信號(hào)通路可減弱腎臟纖維化，限制周細(xì)胞的增殖和與毛細(xì)血管的分離，且VEGFR2 的阻斷對(duì)于防止周細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞有著更明顯的作用[14]。故通過研究腎衰泄?jié)釡捌洳鸱綄?duì)VEGF/VEGFR通路的影響有著重要意義。

本研究經(jīng)過多年臨床及實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為RIF病機(jī)為本虛（脾腎）、標(biāo)實(shí)（瘀、濕、毒）互相作用，最終導(dǎo)致RIF形成[15-16]。疾病早期，標(biāo)實(shí)為主，故以通腑泄?jié)峄鰹榉?，即用大黃、牡蠣泄?jié)岫?，丹參、槐花清瘀熱，蒲公英解毒利尿；疾病晚期，正氣耗傷，所謂“正氣存內(nèi)，邪不可干，邪之所湊，其氣必虛”，虛為本，故扶正以補(bǔ)虛，以助通絡(luò)，即用生黃芪利尿消腫、補(bǔ)氣升陽，巴戟天補(bǔ)腎陽、祛濕濁。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的治療優(yōu)勢，通過多種中藥配伍，標(biāo)本兼顧，能更好地發(fā)揮療效，延緩RIF病情發(fā)展[17-19]。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，第21天各治療組α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白表達(dá)較模型組明顯降低，腎衰泄?jié)釡M蛋白表達(dá)下降則優(yōu)于其他治療組（P＜0.05）。說明腎衰泄?jié)釡M可以有效降低相關(guān)蛋白表達(dá)，達(dá)到延緩纖維化進(jìn)程的作用。另外，第21天腎衰泄?jié)釡珜?duì)VEGF信號(hào)通路的干預(yù)效果要優(yōu)于貝納普利組，說明腎衰泄?jié)釡^貝納普利組有著多靶點(diǎn)治療上的優(yōu)勢。補(bǔ)虛方組在第21天降低α-SMA蛋白表達(dá)的效果優(yōu)于祛邪方組，說明補(bǔ)虛方對(duì)阻止ECM的形成較祛邪方更明顯；RIF后期主要以本虛為主，治療上應(yīng)以補(bǔ)虛為重。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)整祛邪方和補(bǔ)虛方的比例，也許可以影響VEGF/VEGFR信號(hào)通路相關(guān)的蛋白表達(dá)，但具體影響機(jī)制仍不清楚。各治療組第21天雖能降低相關(guān)蛋白表達(dá)，但纖維指數(shù)及蛋白表達(dá)量、相對(duì)表達(dá)量仍高于假手術(shù)組，說明RIF進(jìn)程的不可逆性，但腎衰泄?jié)釡拇_能延緩RIF進(jìn)程。

綜上所述，腎衰泄?jié)釡_實(shí)能夠抑制α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白表達(dá)，且效果相對(duì)優(yōu)于其他治療組。其治療機(jī)制可能是通過標(biāo)本兼治、補(bǔ)虛通腑泄?jié)岱▉硪种艵CM的積累及VEGF信號(hào)通路的激活，進(jìn)而降低α-SMA、VEGFA、VEGFR2蛋白的表達(dá)，改善腎功能，延緩RIF發(fā)展。