高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方桐葉燒傷油中熊果酸和齊墩果酸的含量

楊德泉，徐玉輝，覃愛(ài)桃，韓湘云

1.湘西土家族苗族自治州食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 吉首 416000；2.湘西宏成制藥有限責(zé)任公司，湖南 吉首 416000

復(fù)方桐葉燒傷油收載于《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》第77 冊(cè)［1］，由桐葉和麻油組成，具有清熱解毒，消腫止痛，祛腐生肌的功效，用于面積小于29%的燒燙傷。其中，桐葉為玄參科植物白花泡桐Paulownia fortunei（Seem.）Hemsl.的干燥葉。桐葉含有熊果酸、3α-羥基-熊果酸、23-羥基-烏蘇酸、2α,3β,19,23-四羥基-12-烯-28-烏蘇酸、2α,3α,23-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸、2α,3β,19,23-四羥基-12-烯-28-烏蘇酸、齊墩果酸、2α-羥基-齊墩果酸（山楂酸）、19α-羥基-烏鴿蘇酸、木樨草素、洋芹素、β-谷甾醇、棕櫚酸、落葉酸、胡蘿卜苷、2α,3β,19β-三羥基-烏蘇酸-28-O-β-D-吡喃半乳糖苷、3β,28-二羥基-烏蘇烷等成分［2-6］。其中熊果酸含量居首［7］。麻油為脂麻科植物脂麻Sesamum indicumL.的成熟種子用壓榨法得到的脂肪油，主要為不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、木脂素類等成分。熊果酸和齊墩果酸為一對(duì)物理、化學(xué)性質(zhì)極為相近的同分異構(gòu)體，常同時(shí)存在于某一植物中。嚴(yán)華等［8］建立了原位預(yù)處理-薄層色譜法，成功分離了熊果酸和齊墩果酸。楊德泉等［9］應(yīng)用原位預(yù)處理-薄層色譜法，分離了桐葉中的熊果酸、齊墩果酸。復(fù)方桐葉燒傷油標(biāo)準(zhǔn)中的含量測(cè)定采用薄層色譜掃描方法測(cè)定熊果酸的含量，所測(cè)定的熊果酸實(shí)際為熊果酸與齊墩果酸的混合物。由于薄層色譜掃描法受環(huán)境的溫度、濕度以及個(gè)人的操作技能水平的影響較大，方法的重現(xiàn)性較差［10］，本研究在相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［11-19］及法定標(biāo)準(zhǔn)［20-21］的基礎(chǔ)上，建立了高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定復(fù)方桐葉燒傷油中熊果酸和齊墩果酸兩個(gè)成分的含量方法。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)定，可用于復(fù)方桐葉燒傷油的質(zhì)量控制。

1 儀器、試藥和樣品

1.1 儀器

島津LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司），色譜柱YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，編號(hào)HS12S05-2546WT，YMC 公司）；安捷倫液相色譜儀Agilent 1260［Agilent 科技（中國(guó)）有限公司］，色譜柱Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，PN：588905-902，Agilent 公司）；CS-9301 型雙波長(zhǎng)薄層掃描儀（日本島津公司）；定量毛細(xì)管（美國(guó)Orunond Scientigic Co）；電子天平：AB135-S（METTLER TOLEDO，十萬(wàn)分之一）；超聲波清洗器（型號(hào)：KQ-3008，昆山美美超聲儀器有限公司）；多試管渦旋混合器（Multi-Tube Vortexer UMV-2)；離心機(jī)（Centrifuge 5810R，Eppendorf AG）。

1.2 試藥和樣品

熊果酸（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110742-201823，使用前不需要干燥處理，供含量測(cè)定用，含量以99.9%計(jì)），齊墩果酸（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110709201808，使用前不需要干燥處理，供含量測(cè)定用，含量以91.1%計(jì)）。乙腈、甲醇為色譜純，水為純凈水，其余試劑為分析純。7 批復(fù)方桐葉燒傷油樣品，由湘西宏成制藥有限責(zé)任公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（61∶18∶21）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取熊果酸對(duì)照品49.81 mg、齊墩果酸對(duì)照品13.85 mg，置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為熊果酸和齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，濃度分別為0.995 2 mg/mL 和0.252 3 mg/mL。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取樣品5 mL，置50 mL 離心管中，加入10 mL 甲醇，渦旋混勻5 min，超聲（200 W、40 kHz）5 min，5 000 r/min 離心5 min，取上層甲醇液；下層液另加10 mL 甲醇，如前操作；下層液再加甲醇5 mL，如前操作。合并上層甲醇液于25 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。置-18 ℃放置30 min，取出，過(guò)0.22 μm 濾膜，為供試品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下溶液，按“2.1”色譜條件測(cè)定，色譜峰的理論板數(shù)和分離度均符合要求。取“2.3”項(xiàng)下溶液測(cè)定，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)位置上檢出色譜峰。對(duì)照品、供試品色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 混合對(duì)照品色譜圖：

圖2 復(fù)方桐葉燒傷油液相色譜圖：

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液0、0.5、1.0、3.0、4.0、6.0、10.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，制成為每mL 含熊果酸0、0.049 76、0.099 52、0.298 6、0.398 1、0.597 1、0.995 2 mg，含齊墩果酸0、0.012 61、0.025 23、0.075 69、0.100 9、0.151 4、0.252 3 mg 的溶液，搖勻，即得系列對(duì)照品溶液。

分別精密吸取上述系列對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣量X（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸處理，得熊果酸的回歸方程：Y=4 686.574 2X-6.525 9，r=0.999 9；齊墩果酸的回歸方程：Y=5 273.108 2X+1.175 9，r=0.999 9。結(jié)果表明，熊果酸在0.497 6～9.952 μg/mL、齊墩果酸在0.126 1～2.523 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

取同一濃度對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，熊果酸峰面積的RSD=0.21%，齊墩果酸峰面積的RSD=0.19%，表明儀器精密度好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)20201106 的樣品6 份，制備成供試液，分別按樣品測(cè)定法測(cè)定。熊果酸含量分別為1.166 4、1.151 3、1.141 3、1.120 7、1.143 2、1.158 6 mg/mL，平均含量為1.146 9 mg/mL，RSD=1.59%。齊墩果酸含量分別0.321 7、0.322 6、0.321 9、0.329 9、0.333 3、0.329 3 mg/mL，平均含量為0.326 4 mg/mL，RSD=0.50%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 耐用性試驗(yàn)

分別用液相色譜儀（1）Agilent 1260 Ⅱ，色譜柱Agilent C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm，編號(hào)588905-902，Agilent 公司）和（2）LC-20AT，色譜 柱YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，編 號(hào)HS12S05-2546WT，YMC 公司），理論塔板數(shù)按熊果酸計(jì)，均能達(dá)到5 000 以上，熊果酸含量測(cè)定值RSD 為0.20%，齊墩果酸含量測(cè)定值RSD 為0.30%。結(jié)果表明，本方法耐用性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào)：20180601），于0、1、2、4、8、12、24 h，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，結(jié)果熊果酸RSD=1.30%，齊墩果酸RSD=0.44%，表明在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品3 mL（批號(hào)：20201105，已測(cè)得3 mL中含熊果酸2.195 4 mg、齊墩果酸0.788 7 mg）6 份，分別按已測(cè)得含量的80%、100%、120%，對(duì)應(yīng)加入熊果酸對(duì)照品1.791 4、2.239 2、2.687 0 mg，齊墩果酸對(duì)照品0.451 4、0.557 7、0.681 2 mg，按供試液制備方法制備成為供試液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，平均加樣回收率結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 熊果酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表2 齊墩果酸加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.11 TLCS 法與HPLC 法測(cè)定樣品中熊果酸含量比較

取復(fù)方桐葉燒傷油樣品7 批，分別按復(fù)方桐葉燒傷油標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定方法（TLCS 法）和按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定熊果酸含量。表3 結(jié)果顯示，HPLC法測(cè)定樣品中熊果酸含量，高于TLCS 法所測(cè)含量2.8～5.6 倍。

表3 TLCS法與HPLC法測(cè)定樣品中熊果酸含量表

2.12 樣品含量測(cè)定

精密量取樣品5 mL，置50 mL 離心管中，加入10 mL 甲醇，渦旋混勻5 min，超聲5 min，5 000 r/min離心5 min，取上層甲醇液；下層液另加10 mL 甲醇，如前操作；下層液再加甲醇5 mL，如前操作。合并上層甲醇液于25 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。置-18 ℃放置30 min，取出，過(guò)0.22 μm 濾膜，為供試液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定熊果酸和齊墩果酸的峰面積，用回歸方程計(jì)算熊果酸、齊墩果酸的含量。7 批樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 復(fù)方桐葉燒傷油中熊果酸和齊墩果酸的含量

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

流動(dòng)相選擇乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21）和乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（61∶18∶21）。乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21）出峰時(shí)間較短，約11 min，但分離度小于1.5；乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（61∶18∶21）較為合適，熊果酸出峰時(shí)間約為13 min，分離度1.6，與其他成分完全分離。

3.2 供試品溶液的制備

復(fù)方桐葉燒傷油為油劑，在供試溶液的制備中除去麻油所含油脂、蛋白質(zhì)、甘油酯等成分是技術(shù)關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)用乙醇和甲醇為提取溶劑、用200 W/40 kHz 和300 W/40 kHz 超聲條件提取，比較了對(duì)熊果酸和齊墩果酸提取效率的影響，最終選擇甲醇為溶劑，超聲條件為200 W/40 kHz，經(jīng)渦旋混勻→超聲→離心提取處理后，將獲得的甲醇提取液定容，置-18 ℃放置30 min 以除去甘油酯等雜質(zhì)，取出，過(guò)0.22 μm 濾膜，制備為供試品溶液。HPLC 色譜圖顯示，在熊果酸峰和齊墩果酸峰部位無(wú)雜質(zhì)干擾，熊果酸與齊墩果酸的色譜峰分離效果好。

本研究中色譜條件的線性關(guān)系、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率、耐用性均良好，方法可行。復(fù)方桐葉燒傷油中熊果酸和齊墩果酸分離度均大于1.5，與其他成分完全分離，為控制該制劑質(zhì)量提供了可靠的方法。