一株特丁津降解菌(短小芽孢桿菌TDJ-ZJ03)的分離

彭邦良

(寧波至誠學(xué)校，浙江 寧波 315033)

1 引言

特丁津是一種重要的s-三嗪類除草劑，主要用于玉米、高粱和豆類等作物生產(chǎn)過程中落葉和闊葉雜草的防治。長期且廣泛的使用特丁津已經(jīng)導(dǎo)致其在土壤中有很高水平的殘留，并容易通過雨水徑流和滲漏進(jìn)一步造成水體污染[1]。此外，特丁津已被確定為一種內(nèi)分泌干擾物，它也不易于降解且對微生物有毒性。因此，將特丁津從污染場所中快速清除對于環(huán)境安全至關(guān)重要[2]。

近年來，已有利用微生物修復(fù)受特丁津污染的土壤的成功案例，微生物修復(fù)技術(shù)因其低成本和環(huán)境友好性已成為環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域的開發(fā)熱點[3]。然而，微生物修復(fù)方法需要獲得高效的純菌株或菌群，并有成熟的應(yīng)用方法；此外，許多因素通常會影響特丁津的生物降解，如溫度、pH值以及周圍基質(zhì)的含氧量等[4]。因此，除了篩選高效降解菌株或菌群外，還應(yīng)關(guān)注各種環(huán)境因素對特丁津生物降解的影響。本研究從土壤中分離到一株能高效降解特丁津的菌株，并對其降解潛力及在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用進(jìn)行了研究。

2 材料和方法

2.1 化學(xué)試劑與培養(yǎng)基

化學(xué)試劑：特丁津(99.1%)購自Sigma-Aldrich公司；所使用的其他化學(xué)試劑均為分析純級。

培養(yǎng)基：①無機(jī)鹽培養(yǎng)基：七水硫酸鎂 0.2 g，硫酸銨 0.1 g，磷酸氫二鉀0.1 g，硫酸鈣 0.05 g，七水硫酸亞鐵 0.01 g，蒸餾水1.0L，pH值7.0。②分離培養(yǎng)基：以含有特丁津的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(特丁津濃度為50 mg/L)作為分離培養(yǎng)基，用于分離特丁津降解菌。③富集培養(yǎng)基：蛋白胨7.0 g，酵母膏5.5 g，牛肉膏粉4.0 g，氯化鈉5 g，水1.0L，pH值7.0。

2.2 特丁津降解菌的分離與鑒定

土壤樣品取自寧波市農(nóng)田，取樣農(nóng)田有特丁津應(yīng)用史。將5.0 g土壤樣品溶入到100 mL分離培養(yǎng)基中，在30 ℃下振蕩培養(yǎng)(100 rpm)，每隔12 h測定特丁津濃度。若測得的3天降解效率>70%，則將5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到含有相同濃度特丁津的富集培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)移培養(yǎng)5次以上。再次確認(rèn)降解能力后，將上述富集培養(yǎng)基涂布在含特丁津的無機(jī)鹽培養(yǎng)平板上，在30 ℃下倒置培養(yǎng)，挑選生長旺盛的菌落，在培養(yǎng)平板上反復(fù)劃線，得到純培養(yǎng)物。應(yīng)用16S rRNA基因序列分析方法對新分離菌株進(jìn)行菌種鑒定(測序及其相關(guān)工作由上海生工公司完成)。

2.3 菌株TDJ-ZJ03對特丁津的降解

將菌株菌株TDJ-ZJ03接種到富集培養(yǎng)基中，在35 ℃下振蕩培養(yǎng)(100 r/min)。隔夜培養(yǎng)后通過離心收集細(xì)菌菌體，用無菌生理鹽水淋洗后進(jìn)行重懸，濃度約為5×105個/mL；此細(xì)菌懸液將作為后續(xù)實驗的接種體。將6 mL的菌株TDJ-ZJ03接種體接種到150 mL含有特丁津的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基中特丁津濃度為50 mg/L)，然后振蕩培養(yǎng)(100 r/min，35 ℃)。每隔12 h測定特丁津的濃度。

2.4 溫度對菌株TDJ-ZJ03生長的影響

將6 mL的菌株TDJ-ZJ03接種體接種到150 mL含有特丁津的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中(特丁津濃度為50 mg/L)，分別置于不同溫度下培養(yǎng)，每間隔12h測定OD600。

2.5 pH值對菌株TDJ-ZJ03生長的影響

將含有特丁津的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(特丁津濃度為50 mg/L)的pH值調(diào)至6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。然后，在不同pH值的培養(yǎng)基中接種菌株TDJ-ZJ03；在35 ℃下培養(yǎng)，定時測定OD600。

2.6 菌株TDJ-ZJ03對特丁津的耐受性

在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加特丁津，將特丁津的濃度分別調(diào)整為25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L和500 mg/L，接種菌株TDJ-ZJ03后在35 ℃下振蕩培養(yǎng)， 并定時測定OD600，用以評價菌株TDJ-ZJ03對特丁津的耐受性。

2.7 菌株TDJ-ZJ03對土壤中特丁津的降解

取農(nóng)場新鮮土壤，分為4組：①滅菌土壤(121 ℃滅菌30 min)；②新鮮土壤；③滅菌土壤中添加TDJ-ZJ03：每100 g滅菌土樣中加入8 mL接種液；④ 新鮮土壤中添加TDJ-ZJ03：每100 g新鮮土壤樣品中添加8 mL接種液。將無菌特丁津加入各組后(特丁津最終濃度為50 mg/kg)，將樣品置于35 ℃下孵育。在此過程中，土壤含水量控制在40%左右(v/v)，并定時測定土壤中特丁津的濃度。

3 結(jié)果與討論

3.1 一株特丁津降解菌的特征描述以及菌株TDJ-ZJ03對特丁津的降解

從土壤中分離到一株能以特丁津為唯一碳源和能源的細(xì)菌，命名為TDJ-ZJ03。菌株TDJ-ZJ03為桿菌，大小0.4～0.5μm×1.5～2.0μm，革蘭氏陽性，有芽孢，運動型，兼性好氧，在營養(yǎng)肉湯平板上形成不透明的灰白色菌落。氧化酶和過氧化氫酶試驗呈陽性，而硝酸鹽還原、葡萄糖發(fā)酵、尿素酶和淀粉酶試驗呈陰性。依據(jù)16S rRNA序列分析，菌株TDJ-ZJ03被鑒定為短小芽孢桿菌(16S序列分析委托上海生工生物工程公司完成，GenBank登錄號MW131454)。圖1中的結(jié)果表明:菌株TDJ-ZJ03可以快速降解特丁津；菌株TDJ-ZJ03對特丁津(50 mg/L)的3 d降解率達(dá)到約84.6%。

3.2 溫度和pH值對菌株TDJ-ZJ03的影響

在35℃時，菌株TDJ-ZJ03的生長水平最高，其次是40 ℃，溫度過高或過低都會抑制菌株TDJ-ZJ03的生長(圖2)。在30 ℃時，菌株TDJ-ZJ03的生長略有下降，但仍處于較高水平。25 ℃或45 ℃時對菌株TDJ-ZJ03的生長影響較大，但也不會導(dǎo)致其生長停止。一般來說，溫度能直接影響微生物的生長和降解酶的活性；在適宜的溫度下，微生物能更有效地降解污染物。 基于以上實驗結(jié)果，認(rèn)為35～40 ℃是菌株TDJ-ZJ03生長的適宜溫度。

圖2 溫度對菌株TDJ-ZJ03生長的影響

環(huán)境pH值也是影響微生物生長的重要因素，圖3的實驗結(jié)果表明：菌株TDJ-ZJ03在pH值7.0～7.5下的生長狀況優(yōu)于在其他pH值條件下。因此，認(rèn)為菌株TDJ-ZJ03生長和降解特丁津的適宜pH值為7.0～7.5。一般而言，pH值不僅通過影響微生物生長而引起生物降解能力的變化，而且能直接影響相關(guān)降解酶的活性[5]。此外，pH值還與一些降解酶基因的表達(dá)密切相關(guān)。

圖3 pH值對菌株TDJ-ZJ03生長的影響

3.3 菌株TDJ-ZJ03對特丁津的耐受性

隨著特丁津濃度從25 mg/L增加到100 mg/L，菌株TDJ-ZJ03的OD600逐漸增加。但當(dāng)特丁津濃度增加到200 mg/L時，菌株TDJ-ZJ03的生長量較100 mg/L時有少許降低；如進(jìn)一步增加到500 mg/L，其生長則受到了顯著的抑制，但并不會導(dǎo)致生長停止(圖4)。菌株TDJ-ZJ03的OD600在特丁津濃度為25 mg/L或50 mg/L時會較濃度為100 mg/L時低，這可能是因為25 mg/L(或50 mg/L)的特丁津不能滿足菌株TDJ-ZJ03生長所需的碳源或能量需求。因此，初步認(rèn)為菌株TDJ-ZJ03在實驗條件下至少能耐受濃度為500 mg/L的特丁津。根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果，推測菌株TDJ-ZJ03對特丁津有很強(qiáng)的降解能力，有望用于降解較寬濃度范圍內(nèi)的特丁津。

圖4 不同濃度的特丁津?qū)闠DJ-ZJ03生長的影響

3.4 特丁津在土壤中的降解

圖5中的試驗數(shù)據(jù)表明，添加菌株TDJ-ZJ03到土壤中用以加速特丁津的降解是可行的。將菌株TDJ-ZJ03添加到土壤中，能顯著提高土壤中特丁津的降解效率；在新鮮土壤或滅菌土壤中添加菌株TDJ-ZJ03后，特丁津(50 mg/kg)在5 d內(nèi)的降解率能分別達(dá)到98.4%和94.4%。而在未添加菌株TDJ-ZJ03的土壤中，新鮮土壤和滅菌土壤在5 d內(nèi)的降解率分別僅為31.6%和4.8%。因此，也可認(rèn)為菌株TDJ-ZJ03在土壤中具有良好的生存和繁殖能力，并能有效發(fā)揮降解特丁津的功能。另外，圖5的數(shù)據(jù)還表明，新鮮土壤中特丁津的降解效率高于滅菌土壤中的降解效率，這可能是因為新鮮土壤中的某些天然微生物參與了特丁津的降解或?qū)到馄鸬搅艘恍┹o助作用[6]。

圖5 在不同處理的土壤中特丁津的降解曲線

4 結(jié)語

從土壤中分離得到的短小芽孢桿菌TDJ-ZJ03能高效降解特丁津，在培養(yǎng)基中對特丁津(50 mg/L)的3 d降解率約為84.6%。菌株TDJ-ZJ03生長的最適pH值為7.0～7.5、適宜溫度為35～40 ℃；另外，菌株TDJ-ZJ03對特丁津也有很高的耐受性，至少能夠耐受濃度為500 mg/L的特丁津。將菌株TDJ-ZJ03施用于土壤中能有效促進(jìn)特丁津的降解，推斷菌株TDJ-ZJ03可用于特丁津污染的治理。