低氧訓(xùn)練對(duì)肥胖大鼠脂肪組織miRNA-27b/PPARγ脂代謝通路的影響

徐建方, 路瑛麗, 馮連世

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低氧訓(xùn)練對(duì)肥胖大鼠脂肪組織miRNA-27b/PPARγ脂代謝通路的影響

徐建方, 路瑛麗, 馮連世

國家體育總局體育科學(xué)研究所, 北京 100061

目的：通過建立高脂飲食單純營養(yǎng)性肥胖大鼠模型，結(jié)合脂肪組織中脂肪酸結(jié)合蛋白AFABP1、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FATP4和膽固醇反轉(zhuǎn)物ABCA1的表達(dá)水平變化，從脂類物質(zhì)結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)的角度探討低氧訓(xùn)練對(duì)miRNA-27b/PPARγ調(diào)節(jié)通路及其下游相關(guān)靶基因表達(dá)的影響。方法：SD大鼠肥胖模型驗(yàn)證成功后，隨機(jī)分為常氧安靜組（NC）、常氧訓(xùn)練組（NT）、低氧安靜組（HC）和低氧訓(xùn)練組（HT）。NT和HT組分別以20 m/min、25 m/min進(jìn)行水平跑臺(tái)訓(xùn)練，持續(xù)訓(xùn)練4周，1 h/天，6天/周；NC和HC組不運(yùn)動(dòng)；低氧氧濃度為13.6%（相當(dāng)于海拔3 500 m）。4周后取血清進(jìn)行血脂測(cè)試，腎周脂肪采用qRT-PCR進(jìn)行miRNA-27b、PPARγ、AFABP1、FATP4、ABCA1基因表達(dá)檢測(cè)。結(jié)果：1）HT、HC和NT組大鼠體重低于NC組（＜0.01），NT組脂肪重量低于NC組（＜0.05），HT組脂肪重低于NC、HC組（＜0.01）；2）HT、HC組的TC值低于NC組（＜0.05），HC、HT組的TG值高于NT組（＜0.01），HT、HC組的HDL-C值低于NC、NT組（＜0.05）；3）HT組的miRNA-27b表達(dá)較NC、NT和HC組下調(diào)（＜0.01）；4）HT組的PPARγ mRNA表達(dá)較NC、HC組上調(diào)（＜0.01）；5）NT組的FABP1 mRNA表達(dá)較NC組上調(diào)（＜0.01），HC組較NC組下調(diào)（＜0.01），HT組較NC、HC組上調(diào)（＜0.01），HT組較NT組下調(diào)（＜0.01），HT組的FATP4 mRNA較NC組上調(diào)（＜0.01），HT、HC組的ABCA1 mRNA表達(dá)較NC、NT組下調(diào)（＜0.01）。結(jié)論：1）低氧訓(xùn)練較常氧訓(xùn)練和單純低氧暴露降低肥胖大鼠體重和脂肪重量更有效；2）低氧訓(xùn)練通過抑制脂肪組織miRNA-27表達(dá)，上調(diào)PPARγ表達(dá)，影響下游靶基因AFABP1和FATP4的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸的結(jié)合與轉(zhuǎn)運(yùn)，但卻抑制ABCA1表達(dá)，引起HDL-C水平下降。

低氧訓(xùn)練；肥胖；miRNA-27b； PPARγ；脂代謝

肥胖問題一直是研究熱點(diǎn)，針對(duì)脂代謝的不同調(diào)節(jié)通路，研究人員進(jìn)行了大量探索。低氧對(duì)肥胖的影響也見到諸多報(bào)道，研究結(jié)果表明，低氧及低氧訓(xùn)練能夠顯著降低體重和體脂，影響機(jī)體脂類代謝，是重要的減控體重方式[4,5,6,18,25,27]。miRNA是大小為20～25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼、在進(jìn)化上高度保守的內(nèi)源性小分子RNA。miRNA在生物體的發(fā)育、生長和凋亡、免疫調(diào)控、腫瘤發(fā)生等過程中均發(fā)揮重要作用，參與脂肪細(xì)胞分化、糖脂代謝以及能量穩(wěn)態(tài)調(diào)控等，與肥胖、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[21,28,36]。研究表明，miRNA通過調(diào)節(jié)脂類合成、運(yùn)輸以及分解等有關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控脂代謝。隨著對(duì)miRNA研究的深入，發(fā)現(xiàn)miRNA-27b在調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化和脂代謝方面發(fā)揮重要作用，miR-27b已經(jīng)成為膽固醇和脂類代謝的調(diào)節(jié)中心和治療動(dòng)脈粥樣硬化的潛在靶點(diǎn)。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）作為脂代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，受miRNA-27調(diào)節(jié)，影響機(jī)體脂肪細(xì)胞分化和脂代謝，與肥胖緊密相關(guān)[12,23,24]。

朱磊等[15]報(bào)道，隨著低氧訓(xùn)練時(shí)間延長，肥胖大鼠肝臟中miR27表達(dá)水平逐步降低，而與之相反的是，PPARγ、CD36、ATGL、LPL的表達(dá)水平卻逐步升高，該研究認(rèn)為，低氧訓(xùn)練通過miR-27影響PPARγ及其下游脂肪酸代謝相關(guān)靶基因，從而改善機(jī)體脂代謝水平。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，有關(guān)miR-27b/PPARγ通路的研究多集中在肝臟組織，鮮見有關(guān)低氧訓(xùn)練對(duì)脂肪組織中miR-27b/PPARγ通路影響的報(bào)道。而脂肪組織是機(jī)體最大的內(nèi)分泌器官，參與糖脂代謝的調(diào)節(jié)，在代謝綜合征和心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

本研究擬通過建立高脂飲食單純營養(yǎng)性肥胖大鼠模型，結(jié)合脂肪組織中脂肪酸結(jié)合蛋白AFABP1、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FATP4和膽固醇反轉(zhuǎn)物ABCA1的表達(dá)水平變化，從脂類物質(zhì)結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)的角度探討低氧訓(xùn)練對(duì)miRNA-27b/PPARγ調(diào)節(jié)通路及其下游相關(guān)靶基因表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

出生21天的離乳雄性SD大鼠100只，購自北京維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司（體重56.46±3.59 g），普通飼料喂養(yǎng)1周后（體重92.12±6.09 g），隨機(jī)分為兩組：正常飲食組、高脂飼料組。正常飲食組共10只SD大鼠普通飼料喂養(yǎng)（實(shí)驗(yàn)鼠生長維持顆粒飼料，玉米粉40%、面粉20%、豆粕20%、麩皮9%、魚粉6%、酵母粉1%、豆油1%、食鹽0.8%、磷酸鈣2%、多種微量元素0.2%），分籠飼養(yǎng)，每籠5只，室溫21℃~23℃，濕度40%~60%，自然光照，自由飲食。高脂飼料組共90只SD大鼠（普通飼料主要成分的68%、豬油10%、白糖10%、奶粉10%、豆油1.04%，食鹽0.8%、磷酸鈣2%、多種微量元素0.2%）喂養(yǎng)12周，經(jīng)肥胖模型驗(yàn)證成功后，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)2周，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，室溫21℃~23℃，濕度40%~60%，自然光照，自由飲食。

肥胖模型驗(yàn)證依據(jù)：大鼠喂養(yǎng)12周后，從高脂飼料組中體重大于普通飼料組平均體重的大鼠中隨機(jī)選出10只，保證與剩余大鼠平均體重?zé)o顯著差異。比較10只高脂飼料大鼠與10只普通飼料大鼠的體重、Lee’s指數(shù)、脂肪重（附睪脂肪+腎周脂肪）、脂體比[（腎周脂肪重+附睪脂肪重）/體重×100%]、血脂。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂飼料組大鼠體重（390.22±37.53 g）和Lee’s指數(shù)（304.26±8.47）較普通飼料組大鼠體重（363.11±33.09 g）和Lee’s指數(shù)（296.32±3.63）分別升高7.5%（＞0.05）和2.7%（＜0.05）。高脂飼料組大鼠脂肪重（14.82±5.50 g）和脂體比（3.73±0.98）較普通飼料組大鼠脂肪重（10.04±2.40 g）和脂體比（2.78±0.67）分別升高47.6%（＜0.05）和34.2%（＜0.05）。高脂飼料組大鼠血清TC（1.86±0.24 mmol/L）、LDL-C（0.43±0.10 mmol/L）較普通飼料組大鼠血清TC（1.29±0.22 mmol/L）、LDL-C（0.26±0.04 mmol/L）含量分別升高43.7%（＜0.01）、66.1%（＜0.01）。Lee’s指數(shù)、脂肪重、脂體比以及TC、LDL-C顯著升高，表明高脂飼料飼養(yǎng)12周后肥胖大鼠造模成功。

1.2 分組與訓(xùn)練安排

根據(jù)實(shí)驗(yàn)大鼠的體重、適應(yīng)性訓(xùn)練情況，將40只肥胖大鼠隨機(jī)分為4組，各組之間體重?zé)o顯著性差異；分組后的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按表1安排生活和訓(xùn)練。

表1 本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生活及訓(xùn)練安排

注：常氧訓(xùn)練和低氧訓(xùn)練跑速是依據(jù)前期研究和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，普通SD大鼠進(jìn)行遞增負(fù)荷確定實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度時(shí)，常氧訓(xùn)練組和低氧訓(xùn)練組的血乳酸出現(xiàn)拐點(diǎn)的對(duì)應(yīng)速度分別為30 m/min和25 m/min；而本研究實(shí)驗(yàn)對(duì)象為肥胖大鼠，其運(yùn)動(dòng)能力較弱，在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)低氧環(huán)境下肥胖大鼠不能完成25 m/min的強(qiáng)度訓(xùn)練，后為保障有氧強(qiáng)度的一致性，實(shí)驗(yàn)大鼠訓(xùn)練強(qiáng)度定為：常氧訓(xùn)練組為25 m/min，低氧訓(xùn)練組為20 m/min。

1.3 取材

安靜組4周末，運(yùn)動(dòng)組最后一次訓(xùn)練恢復(fù)24 h后取材。對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠稱重后按0.3 ml/100 g體重劑量腹腔注射10%水合三氯乙醛溶液麻醉大鼠。腹主動(dòng)脈取血后，37℃水浴30 min，3 000 rpm離心15 min，吸取血清，待測(cè)；分離出腎周脂肪，稱重、分裝、液氮中保存，待測(cè)。

1.4 試劑與儀器

主要試劑：引物（Invitragen miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）、DEPC（Sigma）、氯仿、異丙醇、無水乙醇（上海化學(xué)試劑公司）、RT試劑（BPI）、熒光定量PCR試劑（TAKARA）、SYBR Green I（TAKARA）、RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）、RNeasy Mini Kit（QIAGEN）。

主要儀器：MULTISKAN MK3全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（Thermo，USA）、CFX 96Connect熒光定量PCR儀（USA BIO-RAD）、FTC2000熒光定量PCR儀(Canada)、高速離心機(jī)（Eppendorf）。

1.5 測(cè)試方法

血脂指標(biāo)采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)試，具體操作過程依說明書進(jìn)行。

脂肪組織miRNA-27、PPARγ、AFABP1、FATP4、ABCA1表達(dá)采用SYBR Green I熒光染料RT-PCR測(cè)試，具體步驟如下。

1.5.1 總RNA提取

參照QIAGEN RNeasy Mini Kit說明書提取RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.5.2 反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄過程參照試劑盒說明書進(jìn)行。

miRNA-27b反轉(zhuǎn)錄總反應(yīng)體系為15 μl，含3 μl RT Primer、1 μl總RNA、0.5 μl RNaseOUT、1.5 μl 0.1 mmol/L DTT、3 μl 5RT×buffer、1 μl 2.5 mmol/L dNTP、1 μl反轉(zhuǎn)錄酶，最后加無RNA酶水至15 μl。冰浴5 min，16℃ 30 min，42℃ 30 min，70℃ 15 min。

PPARγ、AFABP1、FATP、ABCA1 mRNA反轉(zhuǎn)錄總反應(yīng)體系為40 μl，2.5 μg/μl oligo(dT)18(2 μl)、5 μg 總RNA()混勻后68℃ 5~10 min，立即置于冰上5 min，加入1 μl RNaseOUT、4 μl 0.1 mmol/L DTT、8 μl 5X RT buffer、10 μl 2.5 mmol/L dNTP，混勻后42℃ 2 min，加入反轉(zhuǎn)錄酶2 μl，混勻42℃ 1~1.5 h，70℃ 15 min。

1.5.3 引物序列

引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

ACTB FW: ACAGGATGCAGAAGGAGATTAC, RV: ACAGTGAGGCCAGGATAGA, 產(chǎn)物長度117bp；PPARγ FW: GCCTAAGTTTGAGTTTGCTGTG, RV: GCGGTCTCCACTGAGAATAA TG , 產(chǎn)物長度97bp；FABP1 FW:GGTCAAGGCAGTGGTTAAGA, RV:GTCACCCAGTGTCATGGTATT, 產(chǎn)物長度118bp；FATP4 FW:CTGGACCCTAACTCAATGTACC, RV:TGAAGGTGCCTGTTGTATCC, 產(chǎn)物長度107bp；ABCA1 FW:AGGAGGGAAGATCCGTAGTT, RV: CTGAACCTCCCATTGACCATTA, 產(chǎn)物長度94 bp。

1.5.4 RQ-PCR 檢測(cè)

1. RQ-PCR 反應(yīng)體系的配制（本實(shí)驗(yàn)采用20 μl反應(yīng)體系）。

miRNA-27b：在Real-time PER 管中依次加入10 X buffer（2 μl）、Primer（1 μl）、 cDNA（1.33 μl）、DEPC水（13.17 μl）、10 X2.5mmol/L dNTPs（2 μl）、HSTaq（0.5 μl），95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 60 s循環(huán)40次后檢測(cè)。

PPARγ、AFABP1、FATP、ABCA1 mRNA：在Real-time PER 管中依次加入10 X buffer（2 μl）、Primer（0.4 μl×2）、cDNA（1 μl）、DEPC水（12.7 μl）、10×2.5 mmol/L dNTPs（2 μl）、SRBR GreenI（1 μl）、HSTaq（0.5 μl），95℃ 3 min、94℃ 20 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s循環(huán)40次、72℃檢測(cè)。

2. 測(cè)CT 值并分析R熔解曲線。

3. 每個(gè)樣本重復(fù)3次。

4. 以ACTB作為內(nèi)參，依據(jù)CT比較法進(jìn)行相對(duì)定量分析，△Ct=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct（實(shí)驗(yàn)組）－△Ct（對(duì)照組），相對(duì)表達(dá)量=2﹣△△Ct。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±）表示，顯著性水平定為=0.05。將氧濃度和訓(xùn)練方式作為組間主因素，分別對(duì)肥胖大鼠各數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)肥胖大鼠體重、腎周脂肪重的影響

圖1結(jié)果表明，HT組和NT組大鼠體重較NC組顯著下降（＜0.01），HC組大鼠體重較NC組顯著下降（＜0.05）；NT組大鼠脂肪重較NC組顯著下降（＜0.05），HT組大鼠脂肪重較NC組和HC組顯著下降（＜0.01）。

雙因素方差分析結(jié)果顯示，訓(xùn)練因素對(duì)體重有顯著影響（＜0.01），說明訓(xùn)練能顯著降低肥胖大鼠體重；氧濃度、訓(xùn)練對(duì)脂肪重有顯著影響（＜0.05，＜0.01），說明低氧和訓(xùn)練都能顯著降低肥胖大鼠腎周脂肪重。

2.2 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)肥胖大鼠血脂水平的影響

雙因素方差分析顯示，氧濃度對(duì)TC、HDL-C有顯著影響（＜0.05，＜0.01），說明低氧能顯著降低高脂飲食大鼠血清TC、HDL-C水平；氧濃度、訓(xùn)練對(duì)TG有顯著影響（＜0.01，＜0.05），說明低氧能顯著升高血清TG水平，訓(xùn)練能顯著降低血清TG水平（圖2）。

2.3 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)肥胖大鼠脂肪組織miRNA-27b表達(dá)水平的影響

圖3結(jié)果表明，HT組大鼠脂肪組織miRNA-27表達(dá)水平較NC組、NT組和HC組均出現(xiàn)顯著下調(diào)（＜0.01）。

雙因素方差分析結(jié)果顯示，氧濃度×訓(xùn)練交互作用對(duì)肥胖大鼠脂肪組織的miRNA-27影響顯著（＜0.01），而單純低氧和訓(xùn)練雖然有上調(diào)趨勢(shì)，但不具有顯著性。

圖1 肥胖大鼠體重、腎周脂肪重變化

Figure 1. The Changes of Body Weight and Perirenal Fat Weight in Obese Rats

注：*表示與NC組比較有顯著性差異（＜0.05），**表示與NC組比較有極顯著性差異（＜0.01）；##表示與HC組比較有極顯著性差異（＜0.01），下同。

圖2 肥胖大鼠血脂變化

Figure 2. The Changes of Blood Lipids in Obese Rats

注：&表示與NT組比較有顯著性差異（＜0.05），&&表示與NT組比較有極顯著性差異（＜0.01），下同。

圖3 脂肪組織miRNA-27b基因表達(dá)

Figure 3. The Expression of miRNA-27b in Adipose Tissue

2.4 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)肥胖大鼠脂肪組織PPARγ mRNA基因表達(dá)水平的影響

圖4結(jié)果表明，NT組大鼠脂肪組織PPARγ mRNA基因表達(dá)水平較NC組比較有顯著性上調(diào)（＜0.01）；HT組大鼠脂肪組織PPARγ mRNA基因表達(dá)水平較NC組和HC組均顯著上調(diào)（＜0.01）。

雙因素方差分析結(jié)果顯示，訓(xùn)練和氧濃度×訓(xùn)練對(duì)肥胖大鼠脂肪組織中PPARγ mRNA基因表達(dá)具有顯著性影響（＜0.01）。

圖4 脂肪組織PPARγ mRNA基因表達(dá)

Figure 4. The Expression of PPARγ mRNA in Adipose Tissue

2.5 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)肥胖大鼠脂肪組織脂代謝相關(guān)基因的影響

圖5結(jié)果表明，NT組大鼠FABP1 mRNA表達(dá)水平較NC組顯著上調(diào)（＜0.01）；HC組大鼠FABP1 mRNA表達(dá)水平較NC組顯著下調(diào)（＜0.01）；HT組大鼠FABP1 mRNA表達(dá)水平較NC組和HC組顯著上調(diào)（＜0.01），而較NT組大鼠顯著下調(diào)（＜0.01）。HT組大鼠FATP4 mRNA較NC組顯著上調(diào)（＜0.01）。HC組大鼠和HT組大鼠ABCA1 mRNA表達(dá)水平較NC組和NT組顯著下調(diào)（＜0.01）。

圖5 脂肪組織脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)

Figure 5. The Expression of Lipid Metabolism Related Gene mRNA in Adipose Tissue

雙因素方差分析結(jié)果顯示，氧濃度、訓(xùn)練和氧濃度×訓(xùn)練交互因素均對(duì)肥胖大鼠脂肪組織中FABP1 mRNA基因表達(dá)作用顯著（＜0.01）；氧濃度和氧濃度×訓(xùn)練交互因素對(duì)肥胖大鼠脂肪組織ABCA1 mRNA表達(dá)水平均具有顯著作用（＜0.01）。

3 分析與討論

3.1 低氧訓(xùn)練對(duì)肥胖大鼠體重、脂肪重的影響

有研究表明，長時(shí)間低氧環(huán)境暴露或低氧環(huán)境下訓(xùn)練均能引起體重降低，且低氧訓(xùn)練降低體重和減少體脂的效果更明顯。研究認(rèn)為，低氧暴露和低氧訓(xùn)練導(dǎo)致體重降低的原因主要在于：1）低氧暴露或低氧訓(xùn)練導(dǎo)致食欲下降，能量攝入減少；2）在低氧環(huán)境下能量消耗增加。通常上述兩方面共同影響體重變化，究其原因是使機(jī)體能量消耗大于吸收，產(chǎn)生能量負(fù)平衡[8,9,29,34]。

本研究結(jié)果顯示，常氧訓(xùn)練和低氧訓(xùn)練均能顯著降低肥胖大鼠體重，單純低氧暴露也能顯著降低體重，但在降低體重幅度上，由強(qiáng)到弱依次為低氧訓(xùn)練、常氧訓(xùn)練和單純低氧暴露，體重下降幅度分別為12.7%、11.8%和8.2%，表明，低氧訓(xùn)練對(duì)肥胖大鼠體重影響最為明顯，降體重效果最好。Netzer等[30]研究發(fā)現(xiàn)，每周進(jìn)行90 min的低氧低強(qiáng)度訓(xùn)練，持續(xù)8周后，低氧訓(xùn)練組體重和BMI下降量較對(duì)照組更為明顯，與本研究結(jié)果一致。

脂肪重量的變化也表現(xiàn)出相同趨勢(shì)，即低氧訓(xùn)練和常氧訓(xùn)練顯著降低肥胖大鼠腎周脂肪重，分別下降39.4%和26.5%；單純低氧暴露后，肥胖大鼠腎周脂肪重也呈現(xiàn)出降低，下降幅度達(dá)到15.8%。李旭武等[5]、雷雨等[6]、吳秋桃等[10]研究結(jié)果也顯示出常氧訓(xùn)練和低氧訓(xùn)練對(duì)體重、體脂有顯著影響。

綜上所述，本研究認(rèn)為，低氧暴露及低氧訓(xùn)練降低體重和體脂的原因可能是低氧暴露和中等強(qiáng)度訓(xùn)練提高了大鼠能量消耗，使消耗/攝入比例提高，尤其是代謝過程中提高了脂肪利用率。

3.2 低氧訓(xùn)練對(duì)肥胖大鼠血脂的影響

肥胖往往伴隨著血液中TC、TG和LDL-C濃度的升高及HDL-C濃度的降低，有研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)降低機(jī)體TC、TG、LDL-C濃度和提高HDL-C濃度，從而改善脂代謝。不同研究報(bào)道對(duì)于低氧暴露引起脂代謝變化的研究結(jié)果不太一致，究其原因可能是低氧程度和低氧時(shí)間不同而導(dǎo)致[9,29,34]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與常氧安靜組相比，低氧安靜組和低氧訓(xùn)練組大鼠血清TC濃度分別顯著降低15.9%和17.8%，表明，單純低氧暴露和低氧訓(xùn)練均有助于降低機(jī)體血清TC濃度。低氧安靜組和低氧訓(xùn)練組血清HDL-C濃度較常氧安靜組顯著降低29.22%和29.3%，低氧安靜組和低氧訓(xùn)練組比常氧訓(xùn)練組顯著降低19.7%和19.8%。有研究提出，低氧暴露和低氧訓(xùn)練能顯著降低高脂飲食大鼠血清TC濃度，降低心血管、動(dòng)脈粥樣硬化等脂代謝疾病的風(fēng)險(xiǎn)；而由于血清TC濃度降低，需要轉(zhuǎn)運(yùn)入肝的膽固醇減少，因此血清HDL-C水平顯著降低，這與本研究結(jié)果較為一致[8,32]。

從血清TG濃度變化來看，低氧安靜組比常氧安靜組血清TG濃度顯著升高40.1%，比常氧訓(xùn)練組血清TG濃度升高95.5%；低氧訓(xùn)練組比常氧訓(xùn)練組血清TG濃度顯著升高63.7%，結(jié)果表明，常氧訓(xùn)練有助于降低機(jī)體血清TG水平，而低氧刺激則提高了機(jī)體血清TG水平，且低氧訓(xùn)練在一定程度上逆轉(zhuǎn)單純低氧的這種作用。提示，低氧環(huán)境刺激可能導(dǎo)致機(jī)體脂肪動(dòng)員加快，使血清TG水平出現(xiàn)一定程度升高，機(jī)體安靜狀態(tài)下有脂肪供能比例增加。因此，低氧訓(xùn)練加速了脂肪動(dòng)員和脂類在血液中的運(yùn)輸，增加了脂肪的利用，最終使脂肪質(zhì)量減少。

雖然本研究發(fā)現(xiàn)，常氧訓(xùn)練組、低氧安靜組、低氧訓(xùn)練組大鼠血清LDL-C濃度與常氧安靜組大鼠血清LDL-C濃度間不具有顯著性差異，但分別降低10.5%、3.2%、11.1%的結(jié)果也充分顯示出常氧訓(xùn)練和低氧訓(xùn)練均具有一定改善肥胖大鼠LDL-C的作用。

3.3 低氧訓(xùn)練對(duì)肥胖大鼠microRNA-27b表達(dá)水平的影響

miRNA是一類由20~25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼小RNA分子。miRNA在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄成為pri-miRNA，在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)一步被加工為中間體pre-miRNA，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)過一系列酶切反應(yīng)后形成成熟miRNA。成熟miRNA與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體結(jié)合于目標(biāo)mRNA的3’非翻譯端（3′UTR）區(qū)域，引起目標(biāo)mRNA的降解或者抑制其翻譯，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的表達(dá)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用[19,28,33]。

研究證實(shí)，miR-27可與PPARγ的3’UTR特異結(jié)合，抑制PPARγ的表達(dá)，因此，PPARγ被認(rèn)為是miR-27的靶基因。miR-27有miR-27a和miR-27b兩個(gè)亞型，miR-27a參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，調(diào)節(jié)機(jī)體脂代謝和糖代謝過程，與脂肪組織的發(fā)育成熟及糖尿病的生成密切相關(guān)；miR-27b不僅調(diào)控脂肪干細(xì)胞的脂向分化，而且可以通過下游靶基因PPARγ調(diào)節(jié)機(jī)體脂代謝過程，在脂肪生長中發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用。因此，miR-27作為成脂抑制因子，是脂肪細(xì)胞發(fā)育和脂肪形成過程中特異的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[17,23,33]。肖金剛等[12]通過建立脂肪干細(xì)胞體外脂向分化模型，采用miRNA芯片及qRT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞體外脂向分化過程中miRN-27b表達(dá)顯著下調(diào)，認(rèn)為miRNA-27b與脂肪干細(xì)胞的脂向分化密切相關(guān)，并可能通過調(diào)控靶基因PPARγ的表達(dá)而影響脂肪干細(xì)胞的脂向分化。

本研究發(fā)現(xiàn)，低氧訓(xùn)練組大鼠脂肪組織中的miR-27b表達(dá)水平較常氧安靜組、常氧訓(xùn)練組和低氧安靜組分別下調(diào)39.6%、62.0%、65.4%，且均具有顯著性差異；而單純有氧訓(xùn)練和單純低氧對(duì)肥胖大鼠脂肪組織miR-27b表達(dá)不具有顯著性影響，但均表現(xiàn)出升高趨勢(shì)。提示，低氧訓(xùn)練能通過下調(diào)肥胖大鼠脂肪組織miR-27的表達(dá)，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。Lin等[24]研究指出，miR-27在脂肪分化過程中下調(diào)，miR-27的過表達(dá)則抑制脂肪細(xì)胞形成，且miR-27通過下調(diào)PPARγ從而調(diào)控脂肪細(xì)胞生成。他們同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在肥胖小鼠脂肪組織中，miR-27表達(dá)增加，并受低氧環(huán)境影響。在模擬類似于肥胖小鼠氧合水平的1%氧濃度環(huán)境下，前脂肪細(xì)胞中miR-27a表達(dá)水平升高約2倍，miR-27b表達(dá)水平升高約1.5倍，他們的研究與Kulshreshtha等[23]報(bào)道腫瘤細(xì)胞中低氧誘導(dǎo)miR-27a表達(dá)上升一致。而在21%氧濃度條件下進(jìn)行的脂肪分化中，miR-27a和miR-27b表達(dá)水平則在24 h后降低[23]。導(dǎo)致本研究與上述研究結(jié)果不一致的原因可能是低氧程度不一致對(duì)機(jī)體造成的低氧刺激不同，本研究的低氧濃度是13%，而Lin等的研究中氧濃度為1%。

3.4 低氧訓(xùn)練對(duì)肥胖大鼠PPARγ mRNA表達(dá)水平的影響

PPARγ在脂肪組織中高表達(dá)，有脂肪組織特異性。PPARγ有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在脂肪細(xì)胞分化、糖脂代謝平衡、胰島素敏感性、抑制炎癥反應(yīng)、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗腫瘤等方面均發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ在脂肪細(xì)胞分化的早期有表達(dá)，在脂肪細(xì)胞分化過程中，通過正反饋調(diào)控，PPARγ表達(dá)水平不斷升高，到脂肪細(xì)胞成熟時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。PPARγ誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化過程中能夠直接在轉(zhuǎn)錄水平激活ap2、磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（PEPCK）等基因。PPARγ在脂代謝途徑中參與AFABP、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEP-CK）、乙酰輔酶A合成酶（ACS）、FATP、脂肪酸移位酶（FAT/CD36）、脂蛋白脂酶（LPL）、肉毒堿乙酰肉毒堿轉(zhuǎn)位酶（CACT）、ABCA1等基因的調(diào)控[3,31]。

運(yùn)動(dòng)過程中由于機(jī)體激素水平、能量代謝和酸堿平衡等方面的變化，可能影響PPARγ的表達(dá)水平，進(jìn)而影響機(jī)體脂代謝[1,26,35]。但報(bào)道結(jié)果不一致，陳玉娟等[2]發(fā)現(xiàn)，8周耐力游泳運(yùn)動(dòng)后，大鼠脂肪組織中PPARγ蛋白表達(dá)量顯著上升。柏友萍等[1]則指出，高、中、低不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度結(jié)合共軛亞油酸運(yùn)動(dòng)后肥胖大鼠脂肪組織PPARγ mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)雖均高于對(duì)照組，但不具顯著性差異，因此認(rèn)為受運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度影響較小。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低氧訓(xùn)練組和常氧訓(xùn)練組肥胖大鼠脂肪組織PPARγ基因表達(dá)水平較常氧安靜組脂肪組織PPARγ基因表達(dá)水平分別顯著性上調(diào)52.88%和41.13%；低氧安靜組PPARγ基因表達(dá)水平較常氧安靜組雖然上調(diào)18.82%，但不具顯著性差異；低氧訓(xùn)練組PPARγ基因表達(dá)水平較低氧安靜組顯著上調(diào)28.66%。從雙因素方差分析結(jié)果看，氧濃度對(duì)脂肪組織中PPARγ mRNA基因表達(dá)影響不明顯，而訓(xùn)練和氧濃度×訓(xùn)練則對(duì)脂肪組織中PPARγ mRNA基因表達(dá)具有非常顯著性影響。提示，單純低氧刺激時(shí)可能由于低氧程度不夠從而導(dǎo)致對(duì)肥胖大鼠脂肪組織中PPARγ mRNA基因表達(dá)影響不及單純訓(xùn)練、低氧和訓(xùn)練的雙重刺激。

3.5 低氧訓(xùn)練對(duì)肥胖大鼠脂肪組織脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

研究表明，低氧及低氧訓(xùn)練通過對(duì)脂肪合成與分解關(guān)鍵酶的活性及其相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)進(jìn)行影響，從而調(diào)控機(jī)體脂代謝。多數(shù)研究表明，低氧及低氧訓(xùn)練對(duì)脂肪酸合成代謝能力有降低作用，且低氧及低氧訓(xùn)練加快脂肪酸的分解。低氧暴露（1%O2濃度）通過抑制SREBP-1c表達(dá)，下調(diào)FAS mRNA表達(dá)水平，減少FAS合成，從而抑制細(xì)胞中脂肪的生成[7,11,22]。

FABP和FATP作為機(jī)體內(nèi)重要的脂肪酸結(jié)合與轉(zhuǎn)運(yùn)載體，廣泛存在于各細(xì)類胞中，通過結(jié)合飽和及不飽和長鏈脂肪酸，促進(jìn)脂肪酸的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)，影響脂肪酸的攝取、儲(chǔ)存及排出，調(diào)控脂類生成及降解。研究表明，劇烈運(yùn)動(dòng)或長期鍛煉，會(huì)引起FAT、FABP和FATP從胞漿內(nèi)的“儲(chǔ)存池”快速移動(dòng)到胞膜上，心肌和骨骼肌細(xì)胞中FATP表達(dá)增加，促進(jìn)脂肪酸的大量攝入以供機(jī)體能量代謝之需[14,16]。

本研究結(jié)果顯示，常氧訓(xùn)練組肥胖大鼠脂肪組織FABP1 mRNA表達(dá)水平上調(diào)幅度較大，較常氧安靜組顯著上調(diào)458.3%；低氧安靜組肥胖大鼠脂肪組織FABP1 mRNA表達(dá)水平較常氧安靜組和常氧訓(xùn)練組分別顯著下調(diào)56.94%和92.29%，表明低氧暴露在一定程度上抑制其表達(dá)；低氧訓(xùn)練組肥胖大鼠脂肪組織FABP1 mRNA表達(dá)水平較常氧安靜組和低氧安靜組顯著上調(diào)76.39%和309.68%，較常氧訓(xùn)練組顯著下調(diào)68.41%。提示，低氧訓(xùn)練有助于反轉(zhuǎn)這種作用。同時(shí)，低氧訓(xùn)練組肥胖大鼠脂肪組織FATP4 mRNA表達(dá)水平較常氧安靜組顯著上調(diào)42.53%，表明低氧訓(xùn)練有助于脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)；較常氧訓(xùn)練組和低氧安靜組分別上調(diào)3.05%和8.87%，但不具顯著性差異。Jeppesen等[20]報(bào)道，經(jīng)過8周訓(xùn)練后，受試者骨骼肌中FATP4的含量上升了33%，且在干預(yù)后期，骨骼肌中FATP-4蛋白表達(dá)的增加與耐力訓(xùn)練中脂質(zhì)的氧化顯著相關(guān)。這與本研究結(jié)果表現(xiàn)趨勢(shì)一致，表明低氧訓(xùn)練、低氧暴露、常氧訓(xùn)練均能在一定程度上加快脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。

ABCA1介導(dǎo)胞內(nèi)脂質(zhì)流出形成新生性HDL-C，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，起到心血管保護(hù)作用。ABCAl基因可被肝X受體（LXR）激動(dòng)劑轉(zhuǎn)錄激活，ABCAl蛋白也可被鈣蛋白酶介導(dǎo)降解[22]。張洪俠等[13]通過對(duì)ApoE基因敲除小鼠進(jìn)行14周跑臺(tái)耐力訓(xùn)練，觀察耐力運(yùn)動(dòng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)組ABCAl mRNA表達(dá)上調(diào)且主動(dòng)脈斑塊及內(nèi)膜損傷程度較對(duì)照組減輕。顯示耐力運(yùn)動(dòng)通過增加LXR-α和ABCAl mRNA的表達(dá)，而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。關(guān)于低氧環(huán)境的作用，莫顯剛等[8]則報(bào)道，TO-901317上調(diào)ABCAl mRNA及細(xì)胞膜蛋白水平的表達(dá)。無論放線菌酮存在或不存在情況下，缺氧（1%O2濃度）均能降低細(xì)胞膜ABCAl蛋白水平，升高鈣蛋白酶活性。鈣蛋白酶抑制劑ALLN能部分逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞膜ABCAl蛋白水平降低。因此他們認(rèn)為，缺氧可能通過增加鈣蛋白酶活性，從而加速細(xì)胞膜ABCAl蛋白降解。

本研究結(jié)果顯示，低氧安靜組肥胖大鼠脂肪組織ABCA1 mRNA表達(dá)水平較常氧安靜組和常氧訓(xùn)練組分別顯著下調(diào)79.74%和82.97%，低氧訓(xùn)練組ABCA1 mRNA表達(dá)水平較常氧安靜組和常氧訓(xùn)練組分別顯著下調(diào)77.16%和80.80%；而常氧訓(xùn)練組與常氧安靜組，以及低氧訓(xùn)練組與低氧安靜組之間均無顯著變化。提示，單純訓(xùn)練對(duì)脂肪組織ABCA1 mRNA的表達(dá)影響不明顯，這與張洪俠等[13]的報(bào)道結(jié)果不太一致，可能與跑速不同、持續(xù)時(shí)間長短不一有關(guān)。但低氧刺激均下調(diào)其表達(dá)則與他人研究一致。結(jié)合HDL-C結(jié)果分析，低氧暴露和低氧訓(xùn)練均在一定程度上降低了機(jī)體HDL-C水平，這與ABCA1表達(dá)水平的變化情況一致。

4 結(jié)論

1. 常氧訓(xùn)練、低氧暴露和低氧訓(xùn)練均有利于通過減少機(jī)體脂肪重量降低體重，其中以低氧訓(xùn)練效果最好。

2. 低氧訓(xùn)練通過抑制脂肪組織miRNA-27表達(dá)，上調(diào)PPARγ表達(dá)，影響下游靶基因AFABP1和FATP4的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸的結(jié)合與轉(zhuǎn)運(yùn)，但抑制ABCA1表達(dá)，引起HDL-C水平下降。

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Study on the Lipid Metabolism of miRNA-27b/PPARγ in Obese Rats after Hypoxic Training

XU Jian-fang, LU Ying-li, FENG Lian-shi

China Institute of Sport Science, Beijing 100061, China.

This paper is aimed to study the lipid metabolism by detecting the expression of miRNA -27b/PPAR gamma and the target genes in obese rats’ adipose tissue after hypoxic training, which is induced to obese through high-fat diet. Methods: 40 obese rats were divided into 4 groups as the followings: normal oxygen control group (NC), normal oxygen training group (NT), hypoxic control group (HC) and hypoxic training group (HT). All hypoxic training groups stayed in the environment with 13.6% oxygen concentration. The treadmill training was applied with 25m / min in normoxic training group and 20 m/min in hypoxic training group, for 1h/d, 6d/w, 4 weeks. The miRNA-27b, PPARγ, AFABP1, FATP4, ABCA1 mRNA genes expressions in adipose tissue were measured by quantitative fluorescent PCR. Results: 1) The body weight of HT and HC was lower than that of NC (＜0.01,＜0.01,＜0.05), and the kidney fat weight of NT was lower than that of NC (＜0.05), while the kidney fat weight of HT was lower than that of NC and HC (＜0.01). 2) The level of total cholesterol of HT and HC were lower than NC(＜0.05). The level of triglyceride of HC and HT were higher than NT (＜0.01). The level of HDL-C of HT and HC were lower than NC (＜0.05). 3) The expression of miRNA-27b of HT was significantly down-regulated compared with NC, NT and HC (＜0.01). 4) The expression of PPARγ mRNA of HT was significantly up-regulated compared with NC and HC (＜0.01), and the expression of PPARγ mRNA of NT was up-regulated compared with NC (＜0.01). 5) The expression of FABP1 mRNA of NT was up-regulated compared with NC (＜0.01), while HC was down-regulated. The expression of FABP1 mRNA of HT was up-regulated compared with NC and HC (＜0.01), while was down-regulated compared with NT (＜0.01). The expression of FATP4 mRNA of HT was significantly up-regulated compared with NC. The expression of ABCA1 mRNA of HT and HC was significantly down-regulated compared with NC and NT. Conclusion: 1) The effect of reducing the weight and body fat by HT is better than NC and NT. 2) By inhibiting miRNA-27b expression in adipose tissue, hypoxic training promotes the expression of PPARγ gene and then affects lipid metabolism. Hypoxic training influences the expression of FABP1 and FATP4 through miRNA-27b/PPARγ pathway, and then regulates the transport and binding of fatty acids. Hypoxic training inhibits the expression of ABCA1 through the miRNA-27b/PPARγ pathway, leading to decrease the level of HDL-C.

1002-9826(2018)05-0056-09

10.16470/j.csst.201805009

G804.7

A

國家體育總局體育科學(xué)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(基本14-14, 基本16-18)

徐建方,男,副研究員,博士,主要研究方向?yàn)榍嗌倌牦w質(zhì)健康、優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員訓(xùn)練監(jiān)控、低氧訓(xùn)練適應(yīng)機(jī)制、體重控制研究,E-mail: xujianfang@ciss.cn。

馮連世,男,研究員,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)訓(xùn)練監(jiān)控、高原（低氧）訓(xùn)練、運(yùn)動(dòng)與減控體重、運(yùn)動(dòng)與青少年健康促進(jìn),E-mail:fengls98@126.com。