基于LF-NMR/MRI的維C銀翹片制粒中潤濕劑評價方法研究

周冠芮，高美連，張新瑞，楊兆陽，張 堯，張愛玲，羅曉健,*，饒小勇,*

1.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004

2.上海紐邁電子科技有限公司，上海 200333

3.中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，江西 南昌 330006

維C 銀翹片（Vitamin C Yinqiao Tablets，VCYT）主要用于治療感冒，因臨床療效確切、價格低廉，是感冒藥市場中的常用藥[1]。對VCYT 近5年的文獻報道進行分析發(fā)現(xiàn)，其研究主要聚焦于質(zhì)量標準研究，而對制劑工藝鮮有報道，故在此開展VCYT的制粒工藝研究。

制粒是固體制劑成型的關鍵工序之一，主要目的是改善粉體的形貌、粒徑、松密度等物理性質(zhì)。制粒中粘合劑/潤濕劑的用量與分布至關重要，若潤濕劑用量過低會導致顆粒蓬松或粉末多，顆粒整體流動性差，影響后續(xù)工序順利進行；潤濕劑用量過高會導致“過制粒”[2]或顆粒緊實影響片劑的溶出度和硬度[3]。潤濕劑分布不均會導致顆粒大小不均一，易出現(xiàn)大團塊。傳統(tǒng)的潤濕劑用量測定方法有卡爾-費休滴定法、烘干法[4]等，存在著有機試劑毒性、耗時長等問題。近年來，紅外光譜法（IR）、近紅外光譜法（NIRs）[5]等非破壞性測定方法得到了發(fā)展，但這些技術難以直觀表征潤濕劑在顆粒中的內(nèi)部結(jié)合形式。目前，廖正根等[6]采用熒光素鈉作為示蹤劑說明黏合劑的分布，但該方法前提是熒光素鈉均勻分布顆粒，沒有考慮熒光素鈉是否會包裹于顆粒中[7]，采用HPLC 法測定熒光素鈉含量存在樣品制備時間長、有機溶劑安全性、取樣準確性等問題，難以簡單、直接、快速準確的測出潤濕劑用量及分布，因此，采用新技術對制粒中潤濕劑用量和分布表征的研究尤為重要。

低場核磁共振時域技術（low-field nuclear magnetic resonance time domain technique，LF-NMR）和低場核磁成像技術（low-field nuclear magnetic resonance imaging，LF-MRI）是對處于恒定磁場中的樣品施加頻率匹配的射頻脈沖，使質(zhì)子從低能態(tài)躍遷至高能態(tài)，質(zhì)子再以非輻射的方式釋放能量并返回到低能態(tài)，發(fā)生核磁共振。通過分析自旋弛豫特性反映質(zhì)子的運動性質(zhì)，進而從微觀的角度解釋樣品的物理化學環(huán)境等內(nèi)部信息。不同體積分數(shù)乙醇溶液是中藥制粒中常用的潤濕劑，其含有大量的質(zhì)子，可通過LF-NMR 測定潤濕劑質(zhì)子濃度、運動狀態(tài)，進而分析潤濕劑的含量和潤濕劑在顆粒中的分布狀態(tài)。該技術具有快速、無損、測得數(shù)據(jù)準確，且無需添加化學試劑即可測定樣品水分變化等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應用于食品、炮制等工業(yè)中[8-9]。劉佳佳等[10]使用LF-NMR 研究浸膏粉的吸濕過程；吳雙雙等[11]用于研究顆粒的含水量及水分的相態(tài)分布，這些研究都用于研究水分的變化，并未見對制粒中乙醇研究的變化相關報道。

本實驗以VCYT 濕法制粒為研究對象，采用LF-NMR 和LF-MRI 研究制粒中潤濕劑的結(jié)合態(tài)質(zhì)子、束縛態(tài)質(zhì)子和自由態(tài)質(zhì)子變化，探討其變化與顆粒得率的相關性，為闡明潤濕劑對顆粒性質(zhì)的影響和成型機制提供評價方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LHSH3/6/12 型高剪切制粒機，翰林航宇（天津）實業(yè)有限公司；NMI20-025V-I 型低場核磁共振分析及成像系統(tǒng)，上海紐邁電子科技有限公司；AL204型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；DHG-9050A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海姚氏儀器設備廠；300T 型標準檢驗篩機，新鄉(xiāng)市大漢振動機械有限公司。

1.2 試藥

VCYT 浸膏粉，由中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心中藥室制備，批號20190901；對乙酰氨基酚，安徽豐原利康制藥有限公司，批號011708232；馬來酸氯苯那敏，北京康斯諾生物科技有限公司，批號19052283；可溶性淀粉，西安天正藥用輔料有限公司，批號20190709；糊精，安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號190706；乙醇，永華化學科技有限公司，批號20181113；純化水。

2 方法

2.1 顆粒制備

按處方比例稱取原料藥與輔料共3 kg，置于高剪切制粒機中，以300 r/min 的攪拌槳速度和700 r/min 的剪切速度混合5 min 后開始制粒。制粒中采用的潤濕劑為75%乙醇，攪拌槳速度為700 r/min、剪切速度為2500 r/min，每隔60 s 加入20 mL 的潤濕劑，直至呈現(xiàn)“泥漿”狀態(tài)后結(jié)束。上述研究共做4 次試驗，每次均是在鍋體的3 個不同位置、同一深度處收集約20 g 樣品，置于西林瓶中，密封，備用。

2.2 潤濕劑用量測定

2.2.1 LF-NMR 檢測參數(shù) 取“2.1”項下備用濕顆粒2 g，移入φ26 mm 的核磁共振樣品管，再將樣品管放置于探頭中，儀器磁體溫度為（32.00±0.02）℃，儀器共振頻率為20.679 MHz。然后采用CPMG 采集樣品信號，序列參數(shù)設置：采樣頻率（SW）200 kHz，硬脈沖90°脈寬（P1）6.52 μs，硬脈沖180°脈寬（P2）11.52 μs，重復采樣等待時間（TW）1000 ms，重復采樣次數(shù)（NS）128 次，回波時間（TE）0.1 ms，回波個數(shù)（NECH）5000。

2.2.2 烘干法 依照《中國藥典》2020年版四部通則0832 水分測定法中第二法[12]。稱取“2.1”項下備用顆粒3 g，平鋪于干燥至恒定質(zhì)量的扁形稱量瓶中，精密稱定，記質(zhì)量為m0，開啟瓶蓋在105 ℃下干燥5 h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，放冷30 min，精密稱定質(zhì)量（m1），再開啟瓶蓋在105 ℃干燥1 h，放冷，精密稱定質(zhì)量，記質(zhì)量為m2，至連續(xù)2 次稱量的差異不超過5 mg 為止。按公式計算潤濕劑用量。

潤濕劑用量＝(m0－m2)/m0

2.3 LF-MRI 檢測參數(shù)

采用多層自旋回波序列（MSE）采集樣品的質(zhì)子密度圖像，運用LF-MRI 進行核磁共振成像試驗。LF-MRI 成像參數(shù)：層數(shù)為3，層厚為1.8 mm，層間隙為2.0 mm，重復采樣次數(shù)為8，重復采樣等待時間為260 ms，視野FOV 為100 mm×100 mm，頻率編碼步數(shù)為256，相位編碼步數(shù)192。

2.4 顆粒得率

參照《中國藥典》2020年版四部通則0982 粒度和粒度測定法中的機械篩分法（雙篩分法）[12]。取“2.1”項下備用顆粒15 g，在50 ℃的烘箱中烘干，將干顆粒進行稱定質(zhì)量（M0），取干顆粒于標準檢驗篩機中振動5 min，振動幅度3 mm，振動頻率1400 r/min，收集一號篩和五號篩之間的顆粒，稱定質(zhì)量（M1），計算顆粒得率。

顆粒得率＝M1/M0

2.5 數(shù)據(jù)處理

利用系統(tǒng)自帶反演軟件對Q-CPMG 衰減曲線進行反演擬合，得到峰面積、弛豫時間等弛豫數(shù)據(jù)，使用Origin 2018 軟件繪制T2譜圖。采用核磁共振圖像軟件對LF-MRI 圖像進行偽彩和反色處理。應用Excel?-worksheets（美國Microsoft 公司）計算樣品的潤濕劑用量。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學考察

3.1.1 顆粒中不同體積分數(shù)乙醇的檢測 稱取100 g已混合均勻的粉末置于制粒機中，添加18 g 不同體積分數(shù)乙醇進行制粒，采用LF-NMR 檢測不同體積分數(shù)乙醇的變化。由圖1可知，橫向弛豫時間（T2）譜圖上存在3 種相態(tài)的質(zhì)子：T21（0.01～1.00 ms）代表的是結(jié)合態(tài)質(zhì)子，T22（1.00～10.00 ms）代表的是束縛態(tài)質(zhì)子，T23（10.00～1 000.00 ms）代表的是自由態(tài)質(zhì)子，峰面積（A21、A22、A23）代表其相對含量，其中束縛態(tài)質(zhì)子和自由態(tài)質(zhì)子亦可稱為非結(jié)合態(tài)質(zhì)子。由圖1可知，低體積分數(shù)乙醇時，只檢測出2 個峰，且隨著乙醇體積分數(shù)的增加，A21逐漸減少，A22逐漸增加。隨著乙醇體積分數(shù)越來越高，出現(xiàn)峰形越來越多，可能是因為乙醇體積分數(shù)越高，粉末和潤濕劑的結(jié)合能力越弱。

圖1 LF-NMR 檢測不同體積分數(shù)乙醇的T2 譜圖Fig.1 Detection of T2 of different concentrations of ethanol by LF-NMR

3.1.2 線性關系考察 LF-NMR 數(shù)據(jù)的線性主要用“2.1”項的濕顆粒所測的潤濕劑量（X）與LF-NMR的T2總峰面積（Y）之間的關系來評價。潤濕劑用量在5%～35%時的線性方程為Y＝2238.3X－87.16，R2＝0.957 5。

3.1.3 重復性實驗 按“2.2.1”項方法，將樣品平行制備5 次測定，LF-NMR 值的RSD 值為2.97%，表明該方法重復性良好。

3.1.4 日內(nèi)穩(wěn)定性實驗 按“2.2.1”項方法，將1份樣品分別在同1 d 的11:00、12:00、13:00、14:00、15:00 時進行測定，樣品儲存同“2.1”項，LF-NMR值的RSD 值為2.68%，表明日內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.5 日間穩(wěn)定性實驗 按“2.2.1”項方法，將同1 份樣品分別于24、48、72、96、120 h 時測定，樣品儲存同“2.1”項，LF-NMR 值的RSD 值為1.02%，表明日間穩(wěn)定性良好。

3.1.6 精密度實驗 按“2.2.1”項方法，取1 份樣品連續(xù)測定5 次，LF-NMR 值的RSD 值為3.25%，表明儀器的精密度良好。

3.1.7 準確性實驗 按“2.2.1”項方法對5 個待測樣品的潤濕劑用量進行LF-NMR 檢測，并與烘干法測定的結(jié)果進行比對，結(jié)果見表1。由表1可看出，LF-NMR 與烘干法測定的結(jié)果差值均小于1%，說明所建立的LF-NMR 具有較好的準確性。

表1 LF-NMR 與烘干法測定潤濕劑用量對比結(jié)果Table 1 Comparison of LF-NMR and oven-drying method for determination of wetting agent

3.2 制粒中潤濕劑用量對T2 的影響

經(jīng)預試驗對潤濕劑濃度的考察，發(fā)現(xiàn)75%乙醇制粒時顆粒得率最高，故采用75%乙醇為潤濕劑進行制粒。潤濕劑中質(zhì)子主要以結(jié)合態(tài)、束縛態(tài)和自由態(tài)3 種形式存在于濕顆粒中，見圖2。不同形式的質(zhì)子與濕顆粒的結(jié)合狀態(tài)不盡相同，其中結(jié)合態(tài)與濕顆粒連接最為緊密、束縛態(tài)次之、自由態(tài)最差，LF-NMR 中的T2可反應制粒中潤濕劑中質(zhì)子與濕顆粒之間的結(jié)合狀態(tài)。在制粒中前期大部分都是結(jié)合態(tài)，隨著制粒過程的進行，峰面積逐漸增加且T2向右移動，即3 種相態(tài)的質(zhì)子與濕顆粒結(jié)合越來越疏松。

3.3 制粒中潤濕劑用量對A2 的影響

圖2 LF-NMR 檢測制粒中T2 譜圖變化Fig.2 Change of T2 in granulation process detected by LF-NMR

圖3 結(jié)合態(tài)質(zhì)子、束縛態(tài)質(zhì)子和自由態(tài)質(zhì)子的A2 變化Fig.3 A2 changes of bound,irreducible and free hydrogen protons

由圖3可知，隨著潤濕劑的添加，結(jié)合態(tài)質(zhì)子逐漸增加，A22峰值信號量在潤濕劑10%時開始逐漸增加，A23峰值信號量則當潤濕劑在15%時開始逐漸增加，說明水分逐漸增加且不斷向表面滲透。當潤濕劑在20%～25%時，結(jié)合態(tài)質(zhì)子處于穩(wěn)定狀態(tài)；當達到25%后，A21峰值信號量逐漸下降，可能是隨著潤濕劑的添加，結(jié)合態(tài)質(zhì)子在顆粒中的束縛力減少，或在濕顆粒中結(jié)合態(tài)質(zhì)子達到了飽和狀態(tài)，使部分結(jié)合態(tài)質(zhì)子向非結(jié)合態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)變。當呈現(xiàn)“泥漿”狀態(tài)時，即潤濕劑達到34%左右時，結(jié)合態(tài)質(zhì)子、束縛態(tài)質(zhì)子和自由態(tài)質(zhì)子3 種狀態(tài)的態(tài)質(zhì)子分趨于一定值。

3.4 制粒中LF-MRI 圖像變化

利用LF-MRI 成像技術可以直觀地觀察樣品內(nèi)部水分信息，質(zhì)子數(shù)量可以代表樣品中的水分含量，紅色、黃色、綠色表示質(zhì)子密度的高低，紅色含水量最高，綠色含水量最低。采用LF-MRI 掃描潤濕劑不同添加量的樣品后對圖像進行偽彩處理后可知，制粒前期，顆粒的潤濕劑較低，幾乎沒有非結(jié)合態(tài)潤濕劑，在LF-MRI 中幾乎不能檢識。制粒中期，當潤濕劑為20%時，能進行LF-MRI 成像，且顏色逐漸變得鮮明，直到呈現(xiàn)泥漿狀態(tài)時，即潤濕劑用量達到34%，圖像出現(xiàn)了紅色，見圖4-A。

對掃描的圖像進行反色處理后可以看出潤濕劑用量在20%時已出現(xiàn)紅色，但以綠色為主，說明非結(jié)合態(tài)潤濕劑量較低。制粒后期，顏色主要以紅色和黃色為主（圖4-B），說明濕顆粒中潤濕劑過量。由此可見LF-MRI 成像中，根據(jù)質(zhì)子密度變化，可以直觀表征制粒中顆粒內(nèi)部的潤濕劑變化，也可觀察到潤濕劑均勻分布情況。

3.5 潤濕劑用量與顆粒得率的關系

研究表明，當顆粒的含水量達到一定的范圍時，會發(fā)生明顯的團聚現(xiàn)象；低于范圍粉體的黏結(jié)性較小，高于一定范圍會出現(xiàn)“過制?！盵13]。由圖5可知，在潤濕劑用量較低時，顆粒得率也低，這可能與細粉的比表面積有關[14]，細粉粒徑越小比表面積越大，接觸到潤濕劑的面積增大；在前期添加潤濕劑后，潤濕劑與粉末緊密結(jié)合成結(jié)合態(tài)質(zhì)子，所以在顆粒增長的前期，需要較多的潤濕劑對顆粒的表面進行潤濕[6]，形成母核后合并或包裹。當潤濕劑達到20%～25%時，顆粒得率達到最高，之后顆粒得率逐漸下降（將A21與顆粒得率進行相關性分析，P＜0.05），分析可能是由于潤濕劑達到25%時，濕顆粒內(nèi)部的結(jié)合態(tài)質(zhì)子達到飽和，逐漸向非結(jié)合態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)化，隨著濕顆粒表面非結(jié)合態(tài)質(zhì)子增多，使?jié)耦w粒的黏結(jié)性增大更容易聚集、包覆，直至出現(xiàn)大團塊，而且隨著非結(jié)合態(tài)質(zhì)子持續(xù)增多，大團塊進一步變成“泥漿狀”。

圖4 制粒中LF-MRI 圖像變化Fig.4 Changes of LF-MRI images in granulation process

圖5 潤濕劑用量與A21、顆粒得率的關系Fig.5 Relationship between wetting agent content and A21,particle yield

4 討論

李彥等[15]使用LF-NMR 研究葡萄酒中乙醇與水的關系，表示T22譜峰面積占比與酒精體積分數(shù)呈線性關系，劉敏等[16]利用LF-NMR 研究不同濃度水-乙醇的弛豫時間與氫鍵之間的關系，這些文獻報道提示LF-NMR 可用于乙醇的檢測。在現(xiàn)有的研究報道中，筆者發(fā)現(xiàn)LF-NMR 在中藥制劑中主要用于干燥工序，而未發(fā)現(xiàn)在制粒工序中應用的研究報道，本研究是一種新的嘗試。中藥提取物黏性大，常采用乙醇為黏合劑進行制粒，根據(jù)低場核磁原理，可將該技術應用于中藥制粒中監(jiān)測乙醇的用量及分布。根據(jù)方法學研究結(jié)果表明，可采用LF-NMR對VCYT 制粒中潤濕劑（75%乙醇）用量進行定性與定量評價。

利用LF-NMR 和LF-MRI 研究VCYT 在濕法制粒中潤濕劑用量變化和分布狀態(tài)，結(jié)果表明隨著潤濕劑的增加，A21、A22、A23逐漸增加，T2逐漸向右移動，說明質(zhì)子受束縛力越小或自由度越大，流動性變好[17-18]，結(jié)果與復水過程水分狀態(tài)相近[19]，與Ito 等[20]在制粒中發(fā)現(xiàn)的T2時間變化一致，潤濕劑與顆粒的結(jié)合越來越疏松，說明質(zhì)子的結(jié)合狀態(tài)對于制粒終點判斷具有重要指導意義。制粒中潤濕劑用量對粒徑大小與分布具有較大影響[21]，當潤濕劑用量為5%、10%、15%時，樣品粉末較多，潤濕劑用量在20%～25%，具有明顯的濕顆粒生長，此時目標顆粒得率達到最高，當潤濕劑達到大于25%時，A21開始下降，可能存在結(jié)合態(tài)質(zhì)子向非結(jié)合態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，此時目標顆粒得率下降，該結(jié)果與Cavinato 等[22]、Miwa 等[23]研究結(jié)果相同，表明A21的變化趨勢對于表征顆粒得率具有重要參考價值。

本實驗采用LF-NMR 和LF-MRI 檢測潤濕劑在顆粒中的用量變化及分布狀態(tài)，為研究制粒中潤濕劑/黏合劑變化提供了快速無損可視化的方法，且能通過橫向弛豫時間T2來描述3 種質(zhì)子在濕顆粒中的含量和相態(tài)變化，根據(jù)結(jié)合態(tài)質(zhì)子的變化可以判斷最佳的顆粒得率，比傳統(tǒng)的靠經(jīng)驗判斷制粒終點更合理、更科學。

但實驗還存在一些不足，該技術對中藥產(chǎn)品制粒工序的普適性有待深入研究。隨著現(xiàn)代智能制造水平的不斷提升，陳芳宇等[24]采用LF-NMR 在線研究巧克力融化過程，表明LF-NMR 具有較好的在線監(jiān)測能力，鑒于LF-NMR 對質(zhì)子具有較好的靈敏度，提示可將LF-NMR 制成便攜式的在線裝置，用于制粒過程在線監(jiān)測和終點判斷。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突