五加枝葉中1個新的羽扇豆烷型三萜

劉荷秀，徐凌玉，賈瑞芳，黃美玲，李振麟，錢士輝,

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028

2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028

3.南京市莫愁中等專業(yè)學(xué)校 藥學(xué)系，江蘇 南京 210017

4.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺，江蘇 南京 210014

五加Acanthopanax gracilistylusW.W.Smith var.gracilistylus為五加科五加屬多年生灌木，主要分布于我國中南、西南地區(qū)及山西、陜西、江蘇、安徽、浙江、江西、福建等地，其干燥根皮為常用中藥五加皮，有祛風(fēng)濕、補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨、利水消腫的功效[1]。研究表明五加中含有揮發(fā)油、黃酮、生物堿、脂肪酸、苯丙素、神經(jīng)酰胺和萜類化合物[2-4]。萜類化合物是五加中的一類重要成分，目前發(fā)現(xiàn)五加的枝葉中含有大量三萜類成分，而根皮的主成分為二萜類[5]。五加葉中三萜類成分具有顯著的保肝、抗炎[6-7]、抗腫瘤[8]等藥理活性。為了提高五加地上部分資源綜合利用效率，尋找新的活性成分，本實驗對江蘇產(chǎn)五加地上部分進(jìn)行化學(xué)成分研究，從70%乙醇提取物中分離鑒定出了1 個新的降羽扇豆烷型三萜3α,4α,11α-三羥基降-23-碳羽扇豆-20(29)-烯-28-酸 [3α,4α,11α-trihydroxy-23-norlup-20(29)-ene-28-oic acid，1]和4 個已知的羽扇豆烷型三萜類成分3α,11α-二羥基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸[3α,11α-dihydroxylup-20(29)-ene-28-oic acid，2]、23-氧-3α,11α-二羥基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸[23-oxo-3α,11α-dihydroxylup-20(29)-ene-28-oic acid，3]、23-氧-3α-羥基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸[23-oxo-3αhydroxylup-20(29)-ene-28-oic acid，4]和3α-羥基羽扇豆-20(29)-烯-23,28-二酸[3α-hydroxylup-20(29)-ene-23,28-dioic acid，5]。結(jié)構(gòu)見圖1。其中，化合物1 命名為新印象酸?；钚詫嶒灲Y(jié)果表明化合物1對人骨肉瘤143B 細(xì)胞無顯著細(xì)胞毒活性。

1 儀器與材料

圖1 五加地上部分羽扇豆三萜類化學(xué)成分結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds from aerial parts of A.gracilistylus var.gracilistylus

Agilent 1100 系列LC-MS D Trap 質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；ULTRA SHIELD 500 plus 核磁共振波譜儀（德國布魯克公司）；APS 10 制備液相色譜儀（北京元寶山色譜科技有限公司）；Waters 2695 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；Thermo BDS HYPERSLL-C18（250 mm×10 mm，5 μm；250 mm×4.6 mm，5 μm，Thermo 公司）；柱色譜硅膠（青島海洋化工廠）；薄層色譜硅膠板（煙臺江友開發(fā)有限公司）；凝膠Sephadex LH-20（Pharmacia Biotech公司）；除色譜用試劑為色譜純，其余均為分析純。

人骨肉瘤143B 細(xì)胞株購自美國ATCC 公司，由本實驗室傳代培養(yǎng)并保存；MTT（美國Sigma 公司）；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（美國Gibico 公司）；胰蛋白酶、PBS 和DMSO（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。

五加地上部分2018年5月采集于江蘇省盱眙縣，經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院錢士輝研究員鑒定為五加科植物五加A.gracilistylusW.W.Smith var.gracilistylus的枝葉，憑證標(biāo)本（JSTCMIBS-180511）存放于江蘇省中醫(yī)藥研究院。

2 提取與分離

五加地上部分干燥藥材34 kg，用10 倍量70%乙醇回流提取3 次，每次1.5 h，提取液經(jīng)常壓蒸餾和減壓濃縮，得到流浸膏20 L，水分散后生成大量沉淀，離心，沉淀部分（570 g）經(jīng)20～60 目硅膠柱色譜，采用石油醚、石油醚-醋酸乙酯（1∶1）、醋酸乙酯-乙醇（1∶0、1∶1）、乙醇作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，得到53 個組分WJ1～WJ53。WJ33～WJ35（48 g）合并后經(jīng)100～200 目硅膠柱色譜，三氯甲烷-甲醇（15∶1、8∶1、4∶1）梯度洗脫，其中三氯甲烷-甲醇（8∶1）洗脫部分（2.3 g）經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜[甲醇-三氯甲烷（1∶1）洗脫]和制備高效液相色譜[甲醇-水（78∶22），tR＝6.69 min]分離純化，得到化合物1（37 mg）；三氯甲烷-甲醇（4∶1）洗脫部分（5.2 g）經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜[甲醇-三氯甲烷（1∶1）]和制備型高效液相色譜[甲醇-水（49∶51），tR＝9.33 min]分離純化，得到化合物4（55 mg）。WJ23～WJ25（135.3 g）合并后經(jīng)100～200 目硅膠柱色譜，三氯甲烷-甲醇（20∶1、10∶1、5∶1）梯度洗脫，三氯甲烷-甲醇（20∶1）洗脫部分在二氯甲烷中生成大量結(jié)晶，乙醇重結(jié)晶后得到化合物2（3.5 g）；三氯甲烷-甲醇（10∶1）洗脫部分經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜[甲醇-三氯甲烷（1∶1）]后重結(jié)晶得到得化合物3（30 mg）和5（360 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末（甲醇），易溶于三氯甲烷等。TLC 檢查10%硫酸乙醇加熱顯淡黃色；(nm):226；(cm?1):3414,3035,2981,1715,1623,1493,1181；HR-ESI-MSm/z:473.329 1 [MH]?（C29H45O5），提示化合物1 的分子式為C29H46O5，不飽和度為7。13C-NMR (125 MHz,CD3OD) 譜中顯示29 個C 信號，DEPT 提示含5 個CH3、10 個CH2、7 個CH 和7 個季碳信號，提示1 可能是降三萜類化合物。1H-NMR (500 MHz,CD3OD) 譜中δ4.75 (1H,brs),4.61 (1H,brs),1.72 (3H,brs) 及13CNMR 譜中δ110.4,151.6,19.6 的信號推斷結(jié)構(gòu)中含有異丙烯基，提示化合物為羽扇豆烷型三萜，δ3.43(1H,t,J=2.8 Hz),3.86 (1H,m) 以及13C-NMR 譜中δ74.8,71.0,74.1 信號提示結(jié)構(gòu)中含有3 個氧取代碳，δ1.07 (3H,s),1.05 (3H,s),1.01 (3H,s),0.97 (3H,s) 為角甲基氫信號。

將化合物1 的13C-NMR 譜數(shù)據(jù)（表1）與已知化合物3α,11α,23-三羥基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸（1a）的碳譜數(shù)據(jù)[9]對照，發(fā)現(xiàn)除A 環(huán)上部分?jǐn)?shù)據(jù)有位移外其余數(shù)據(jù)基本一致?；衔? 的C-3 位化學(xué)位移向高場位移δ1.1，C-5 位化學(xué)位移向低場位移δ7.2，C-24 位化學(xué)位移向低場位移δ3.7，C-23位及C-4 位對應(yīng)的化學(xué)位移值缺失，而多出δ74.1的氧取代季碳信號，因此推斷化合物1 可能為C-23位-CH3被-OH 取代的降碳化合物。通過HMBC 譜分析發(fā)現(xiàn)H-3 (δ3.43) 與C-1 (δ35.8)、C-24 (δ22.0)相關(guān)，H-6 (δ1.38) 與C-4 (δ74.1) 相關(guān)，H-24 (δ1.07) 與C-4 (δ74.1) 和C-5 (δ51.1) 相關(guān)，證明C-4位為1 個甲基和1 個羥基取代的季碳；NOESY 譜中H-3 (δ3.43) 與H-24 (δ1.07)、H-2β (δ1.75)、H-2α(δ1.57) 相關(guān)，H-24 (δ1.07) 與H-25 (δ1.01)、H-26(δ0.97)、H-3 (δ3.43)、H-2β (δ1.75) 相關(guān)，進(jìn)一步證明C-4 位為α-OH 取代。綜上所述，推斷化合物1 結(jié)構(gòu)為3α,4α,11α-三羥基-23-降羽扇豆-20(29)-烯-28-酸，該化合物為天然產(chǎn)物中比較罕見的23-降羽扇豆三萜，為1 個新化合物，命名為新印象酸。

化合物2：無色針晶（甲醇），易溶于氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑，ESI-MSm/z:507.3 [M＋Cl]?。1HNMR (500 MHz,CDCl3)δ:4.77 (1H,brs,H-29a),4.63 (1H,brs,H-29b),3.95 (1H,m,H-11),3.37 (1H,dd,J=2.6,3.0 Hz,H-3),1.70 (3H,brs,H-27),1.05(3H,s,H-26),1.01 (3H,s,H-25),0.94 (3H,s,H-24),0.85 (3H,s,H-23)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ:35.6 (C-1),25.7 (C-2),76.0 (C-3),37.9 (C-4),49.0(C-5),18.1 (C-6),35.3 (C-7),42.4 (C-8),55.8 (C-9),39.3 (C-10),70.6 (C-11),37.0 (C-12),37.4 (C-13),42.8 (C-14),30.7 (C-15),32.3 (C-16),56.4 (C-17),46.8 (C-18),48.9 (C-19),149.9 (C-20),29.7 (C-21),37.0 (C-22),28.8 (C-23),22.4 (C-24),17.5 (C-25),16.4 (C-26),14.8 (C-27),181.4 (C-28),110.3 (C-29),19.5 (C-30)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)波譜數(shù)據(jù)對照基本一致[10]，故鑒定化合物2 為3α,11α-二羥基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸。

化合物3：無色方晶（乙醇），易溶于甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑，ESI-MSm/z:485.2 [M－H]?。1HNMR (500 MHz,CDCl3)δ:9.54 (1H,s,H-23),4.76(1H,brs,H-29a),4.62 (1H,brs,H-29b),3.97 (1H,m,H-11),3.71 (1H,brs,H-3),2.99 (1H,m,H-19),1.69(3H,brs,H-30),1.08 (3H,s,H-25),1.04 (3H,s,H-24),1.02 (3H,s,H-26),0.95 (3H,s,H-27)；13CNMR (125 MHz,CDCl3)δ:34.9 (C-1),26.3 (C-2),72.9 (C-3),52.6 (C-4),43.7 (C-5),20.8 (C-6),34.8(C-7),42.6 (C-8),55.6 (C-9),38.7 (C-10),70.5(C-11),38.0 (C-12),37.5 (C-13),43.2 (C-14),29.7(C-15),32.3 (C-16),56.5 (C-17),49.0 (C-18),46.9(C-19),149.9 (C-20),30.8 (C-21),37.0 (C-22),209.4(C-23),14.9 (C-24),16.6 (C-25),17.6 (C-26),14.9(C-27),181.4 (C-28),110.3 (C-29),19.5 (C-30)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對照基本一致[11]，故鑒定化合物3 為23-氧-3α,11α-二羥基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸。

化合物4：無色針晶（乙醇），易溶于氯仿、甲醇等有機(jī)溶劑，ESI-MSm/z:469.1 [M－H]?。1HNMR (500 MHz,Pyr-d5)δ:10.05 (1H,s,H-23),4.95(1H ,brs,H-29a),4.77 (1H,brs,H-29b),4.03 (1H,m,H-3),3.39 (1H,m,H-19),1.70 (3H,s,H-30),1.03(3H,s,H-25),0.99 (3H,s,H-24),0.92 (3H,s,H-26),0.82 (3H,s,H-27)；13C-NMR (125 MHz,Pyr-d5)δ:33.5 (C-1),26.7 (C-2),72.9 (C-3),52.5 (C-4),44.3(C-5),21.0 (C-6),34.6 (C-7),41.8 (C-8),50.6 (C-9),38.0 (C-10),21.1 (C-11),26.9 (C-12),38.4 (C-13),43.6 (C-14),30.2 (C-15),32.7 (C-16),56.9 (C-17),49.8 (C-18),47.6 (C-19),151.0 (C-20),31.1 (C-21),36.9 (C-22),209.5 (C-23),14.7 (C-24),16.6 (C-25),16.6 (C-26),14.8 (C-27),179.4 (C-28),109.9 (C-29),19.5 (C-30)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對照基本一致[12]，故鑒定化合物4 為23-氧-3α-羥基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸。

表1 化合物1 的NMR 數(shù)據(jù) (500/125 MHz,CD3OD)Table 1 NMR data of compound 1 (500/125 MHz,CD3OD)

化合物5：無色柱晶（乙醇），易溶于甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑，ESI-MSm/z:485.3 [M－H]?。1HNMR (500 MHz,Pyr-d5)δ:4.94 (1H,brd,J=2.0 Hz,H-29a),4.78 (1H,brd,J=2.0 Hz,H-29b),4.28 (1H,brs,H-3),3.54 (1H,m,H-19),2.70 (1H,ddd,J=3.4,12.0,12.3 Hz,H-13),1.78 (3H,brs,H-30),1.46 (3H,s,H-24),1.13 (3H,s,H-26),0.96 (3H,s,H-25),0.95(3H,s,H-27)；13C-NMR (125 MHz,Pyr-d5)δ:33.5(C-1),26.7 (C-2),73.5 (C-3),52.5 (C-4),45.5 (C-5),22.3 (C-6),35.2 (C-7),42.3 (C-8),51.5 (C-9),38.0(C-10),21.6 (C-11),26.6 (C-12),39.1 (C-13),43.5(C-14),30.7 (C-15),33.3 (C-16),57.1 (C-17),50.2(C-18),48.3 (C-19),151.8 (C-20),31.7 (C-21),38.1(C-22),180.0 (C-23),18.5 (C-24),17.2 (C-25),17.2(C-26),15.3 (C-27),179.3 (C-28),110.4 (C-29),19.9(C-30)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對照基本一致[13]，故鑒定化合物5 為3α-羥基羽扇豆-20(29)-烯-23,28-二酸。

4 人骨肉瘤143B 細(xì)胞體外細(xì)胞毒活性篩選

采用MTT 法，對化合物1 進(jìn)行人骨肉瘤143B細(xì)胞體外細(xì)胞毒活性篩選。143B 細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，以對數(shù)期細(xì)胞5×103個/孔的密度接種于96 孔板，正常培養(yǎng)48 h 后，加入受試藥物，于加藥72 h 后用酶標(biāo)儀在570 nm 測定吸光度（A）值。重復(fù)實驗3 次，用SPSS 20.0 軟件計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。結(jié)果顯示，化合物1對143B 細(xì)胞無顯著細(xì)胞毒活性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突