人牙周膜干細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)及增殖特性的影響

劉 焱， 趙曉霞， 王靖宇， 陳青宇， 仲 琳

牙周炎癥會(huì)破壞牙周支持組織，若治療不及時(shí)甚至?xí)?dǎo)致牙齒松動(dòng)、脫落及口頜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能受損[1]。它還與多種全身性疾病，如冠心病、糖尿病、慢性呼吸系統(tǒng)疾病、胃炎以及高血壓等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。隨著病程的進(jìn)展，牙周炎癥會(huì)引發(fā)牙槽骨細(xì)胞的一系列功能學(xué)變化，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這是牙齒喪失穩(wěn)定性、咀嚼功能下降的最主要因素，因此，新生成骨對(duì)于牙周組織修復(fù)和再生尤為重要。有效治療牙周炎癥的關(guān)鍵是消除局部及全身刺激因素、控制感染，并使已喪失的牙周組織實(shí)現(xiàn)修復(fù)與再生[3]。組織工程理論、材料和技術(shù)的不斷發(fā)展給牙周支持組織再生帶來(lái)了新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)[4]。作為牙周組織工程研究中公認(rèn)的首選種子細(xì)胞——人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)具有良好的組織同源性、自我增殖活力和多向分化潛能[5]。在適宜誘導(dǎo)條件下，hPDLSCs可以形成牙槽骨-牙周膜-牙骨質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)真正意義上的牙周組織再生[6]。然而，干細(xì)胞治療存在著許多問(wèn)題[7]：移植后生存能力降低；潛在的致瘤、致畸風(fēng)險(xiǎn)；包裝、轉(zhuǎn)運(yùn)、貯存及治療方法缺乏統(tǒng)一化、標(biāo)準(zhǔn)化等。來(lái)源于間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的條件培養(yǎng)基(conditioned medium,CM)富含其旁分泌的生物活性因子,且規(guī)避了干細(xì)胞移植的各種風(fēng)險(xiǎn),是替代干細(xì)胞治療的理想方案[8,9]。本研究通過(guò)酶消化組織塊法獲取原代hPDLSCs進(jìn)行培養(yǎng)，鑒定細(xì)胞來(lái)源后制備hPDLSCs-CM。選用具有單一定向成骨分化生物學(xué)特性的小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1以hPDLSCs-CM對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，探討干預(yù)組和常規(guī)培養(yǎng)組的細(xì)胞形態(tài)特征及增殖能力的改變情況，為其在牙周組織工程的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料和儀器 選取16～18周歲因正畸治療需拔除的健康前磨牙及第三磨牙52顆，由包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科提供。所有牙無(wú)齲壞、無(wú)牙髓及根尖周病變，無(wú)牙周疾病，無(wú)黏膜疾病。所有納入個(gè)體無(wú)系統(tǒng)疾病?；颊咧橥獠⒑炇鹜鈺MEM培養(yǎng)基(Hyclon，美國(guó))；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Hyclon，美國(guó))；0.25%胰蛋白酶-乙二氨四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)(Hyclon，美國(guó))；青霉素(河北石家莊華北制藥)；鏈霉素(河北石家莊華北制藥)；Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國(guó))；小鼠抗人角蛋白(pan cytokeratin，PCK)、小鼠抗人波形絲蛋白(vimentin)、小鼠抗人STRO-1單克隆抗體(Dako，丹麥)；羊抗小鼠四甲基異硫氰酸羅丹明標(biāo)記的免疫球蛋白G(immunoglobulin G-tetramethyl rhodamine isothiocyanate,IgG-TRITC)熒光二抗、熒光染料Hoechst33258(Sigma，美國(guó))；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天)。倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus，日本)；熒光顯微鏡(BX61+DP-71，Olympus，日本)；SpectraMax M2酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀(Molecular Devices，美國(guó))；FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))。

1.2酶消化組織塊法獲取hPDLSCs并制備hPDLSCs-CM 對(duì)待拔牙體周圍組織以75%乙醇充分消毒后，拔除牙齒，離體牙立刻置于含高倍雙抗的DMEM培養(yǎng)基，送至超凈臺(tái)。采用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)充分沖洗根面3～5次后刮取根中1/3的牙周膜，修剪為約1 mm3大小的組織塊，置于3 mg/ml的Ⅰ型膠原酶溶液中，37 ℃條件下作用1 h，離心棄上清，以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液吹勻所得沉淀，平鋪于培養(yǎng)皿底部，置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后予首次全量換液，后每3 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿培養(yǎng)皿底部70%～80%時(shí)進(jìn)行消化、傳代。當(dāng)?shù)?代hPDLSCs長(zhǎng)滿皿底約80%時(shí)，在無(wú)血清培養(yǎng)基條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集上清，即為hPDLSCs-CM，備用。

1.3免疫熒光染色法檢測(cè)vimentin、PCK及STRO-1的表達(dá)情況 制備hPDLSCs的細(xì)胞爬片，應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中vimentin、PCK和STRO-1的表達(dá)情況。PBS漂洗后，以預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，1%牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)封閉30 min，加入特異性一抗，孵育過(guò)夜。次日以PBS沖洗2～3次，避光加入二抗孵育1 h，以Hoechst33258對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染5 min，甘油封片、標(biāo)記，鏡下觀察vimentin、PCK及STRO-1的表達(dá)情況。

1.4MC3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng)與干預(yù) 通過(guò)國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)購(gòu)入MC3T3-E1細(xì)胞系，常規(guī)培養(yǎng)、傳代，選取第4代生長(zhǎng)旺盛的MC3T3-E1細(xì)胞用于后續(xù)干預(yù)實(shí)驗(yàn)。其中，干預(yù)組MC3T3-E1細(xì)胞在含50% hPDLSCs-CM +50%常規(guī)DMEM培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)液+10% FBS)條件下進(jìn)行培養(yǎng)；對(duì)照組在常規(guī)DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5不同處理組MC3T3-E1細(xì)胞的增殖能力檢測(cè) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的干預(yù)組和對(duì)照組MC3T3-E1細(xì)胞，以2×104cells/cm2密度接種于96孔板中，每孔100 μl，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)孔。按各組培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)1、3、5、7 d，培養(yǎng)結(jié)束后，每個(gè)孔加20 μl MTT溶液，37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)孵育4 h，吸棄上清后再向各孔加入150 μl DMSO，振蕩10～15 min。采用SpectraMax M2酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處各孔吸光光度值(OD值)。

1.6不同處理組MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞周期檢測(cè) 分別收集干預(yù)組和對(duì)照組的MC3T3-E1各約3×106個(gè)，制成單細(xì)胞懸液，離心后加入70%乙醇吹打充分混勻，4 ℃過(guò)夜，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)管。次日離心后吸棄乙醇上清，避光下各加入50 μg/ml的碘化丙錠1 ml，4 ℃環(huán)境下染色30 min，通過(guò)200目尼龍篩網(wǎng)，經(jīng)FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀測(cè)定兩組MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞周期。

2 結(jié)果

2.1hPDLSCs的形態(tài)觀察及vimentin、PCK及STRO-1的表達(dá)情況 原代培養(yǎng)hPDLSCs 14 d可見(jiàn)細(xì)胞以組織塊為中心，呈環(huán)繞、散在分布，細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形或多邊形、胞體豐滿，貼壁生長(zhǎng)(見(jiàn)圖1?)。培養(yǎng)21 d后，細(xì)胞增多，可達(dá)80%匯合，形態(tài)均一，呈放射狀、旋渦狀緊密排列于組織塊周圍(見(jiàn)圖1?)。傳代后，細(xì)胞的形態(tài)特征與原代相同，呈成纖維細(xì)胞樣長(zhǎng)梭、多角形特征，束狀整齊排布(見(jiàn)圖1?)。經(jīng)免疫熒光染色可見(jiàn)hPDLSCs中vimentin陽(yáng)性表達(dá)，胞漿紅染，胞核藍(lán)染(見(jiàn)圖2?)；PCK陰性表達(dá)，胞漿未被染色，僅見(jiàn)胞核藍(lán)染(見(jiàn)圖2?)。提示hPDLSCs為間充質(zhì)來(lái)源，未有上皮細(xì)胞污染。STRO-1陽(yáng)性表達(dá)，胞漿綠染，胞核藍(lán)染(見(jiàn)圖2?)。

?原代培養(yǎng)14 d；?原代培養(yǎng)21 d；?傳代培養(yǎng)的hPDLSCs

?vimentin表達(dá)陽(yáng)性，胞漿紅染，胞核藍(lán)染；?PCK表達(dá)陰性，胞核藍(lán)染；?STRO-1表達(dá)陽(yáng)性，胞漿綠染，胞核藍(lán)染

2.2兩組MC3T3-E1細(xì)胞的形態(tài)觀察結(jié)果 鏡下可見(jiàn)干預(yù)組和對(duì)照組細(xì)胞的形態(tài)一致、均為長(zhǎng)梭形或多角形，細(xì)胞呈“漩渦狀”緊密排列，CM處理組的細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯增多。見(jiàn)圖3。

?CM處理組；?對(duì)照組

2.3兩組MC3T3-E1細(xì)胞的增殖能力比較 兩組MC3T3-E1細(xì)胞的數(shù)量及增殖活性均隨培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在培養(yǎng)第3天、第5天和第7天，干預(yù)組OD值均顯著大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組MC3T3-E1細(xì)胞的增殖能力比較值]

2.4兩組MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞周期情況 干預(yù)組和對(duì)照組處于G0/G1期的細(xì)胞比例分別為(65.50±0.28)%和(78.82±0.86)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=32.943，P=0.000)。兩組處于G2/M+S期的細(xì)胞比例分別為(31.43±0.59)%和(19.11±0.24)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=43.393，P=0.000)。說(shuō)明hPDLSCs-CM更能促進(jìn)MC3T3-E1進(jìn)入DNA合成期，發(fā)生細(xì)胞分裂、加速增殖。見(jiàn)圖4。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞周期結(jié)果圖

3 討論

3.1《全國(guó)第四次口腔健康流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告》顯示,我國(guó)成人組和老年組的牙周健康率均低于10%，55～64歲年齡段人群的牙周健康率更是僅為5%，這說(shuō)明牙周病的防治已成為亟待解決的口腔健康問(wèn)題。在控制感染的同時(shí)獲得牙周支持組織的再生、重建是牙周病治療的終極目標(biāo)。牙周治療可以有效清除致病菌，延緩、阻止牙周炎的進(jìn)展，但受制于機(jī)體修復(fù)的自限性，病變區(qū)域難以獲得牙周組織的新生[10]。引導(dǎo)組織再生技術(shù)雖然可以獲得一定的牙周附著和骨內(nèi)缺損修復(fù)，但目前仍存在易形成長(zhǎng)結(jié)合上皮、再生硬組織的功能較差、手術(shù)適應(yīng)證窄、生物膜降解時(shí)易塌陷等問(wèn)題[11]，對(duì)于牙周組織的正常結(jié)構(gòu)和功能的構(gòu)建，遠(yuǎn)未達(dá)到醫(yī)師和患者所期望的理想結(jié)果。

3.2相較于傳統(tǒng)治療方法，組織工程技術(shù)利用干細(xì)胞的定向分化潛能發(fā)揮修復(fù)作用，給牙周組織修復(fù)和再生提出了新思路。有研究[12]通過(guò)體內(nèi)示蹤植入的MSCs發(fā)現(xiàn)，僅有<1%的干細(xì)胞歸巢并定植于病變?nèi)睋p區(qū)發(fā)揮促進(jìn)組織再生的作用，而絕大多數(shù)的MSCs僅附著于待修復(fù)組織的表面，這說(shuō)明直接發(fā)揮生物學(xué)功能、參與組織再生和修復(fù)的主要細(xì)胞并不是MSCs。另有研究[13]表明，比起“分化、替代受損細(xì)胞”，再生過(guò)程中移植的干細(xì)胞主要通過(guò)旁分泌機(jī)制釋放多種生物活性分子(如趨化因子、生長(zhǎng)因子等)，從而構(gòu)建、優(yōu)化局部微環(huán)境，趨化病變周圍的健康干細(xì)胞/祖細(xì)胞遷徙至損傷部位進(jìn)行增殖、分化，減少受損細(xì)胞發(fā)生凋亡和炎性反應(yīng)，促進(jìn)組織新生血管，并可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能等多重效應(yīng)誘導(dǎo)組織再生。Osugi等[14]將人MSCs-CM作用于小鼠顱骨缺損模型，經(jīng)CT檢查發(fā)現(xiàn)，干預(yù)后顱骨骨量生成增多；同時(shí)體內(nèi)細(xì)胞示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MSCs-CM處理后被標(biāo)記的小鼠MSCs遷移到病變?nèi)睋p區(qū)的細(xì)胞量顯著增多，并能檢測(cè)到明顯的血管新生。上述研究結(jié)果均表明MSCs-CM可以調(diào)動(dòng)內(nèi)源性MSCs的歸巢，并能正向調(diào)節(jié)血管新生和新骨形成。

3.3本研究通過(guò)酶消化組織塊法獲得hPDLSCs，并經(jīng)免疫熒光染色證實(shí)所得細(xì)胞呈現(xiàn)vimentin陽(yáng)性表達(dá)、PCK陰性表達(dá)的狀態(tài)，說(shuō)明其來(lái)源于間充質(zhì)，而非上皮來(lái)源。目前尚無(wú)明確的研究結(jié)論給出一種或幾種特殊的hPDLSC標(biāo)志物。2004年，Seo等[5]最早成功分離獲得hPDLSCs，并使用早期間MSCs的標(biāo)志物STRO-1等作為其標(biāo)志物。本研究也發(fā)現(xiàn)所得hPDLSCs呈現(xiàn)STRO-1陽(yáng)性表達(dá)，以此驗(yàn)證細(xì)胞來(lái)源。

3.4MC3T3-E1細(xì)胞具有單一定向成骨分化的各種生物學(xué)特性，因而被廣泛應(yīng)用于成骨相關(guān)的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究中[15]。MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)符合成纖維細(xì)胞樣特性，為長(zhǎng)梭形或多角形，生長(zhǎng)特性為貼壁生長(zhǎng)。經(jīng)hPDLSCs-CM干預(yù)作用后，MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)與常規(guī)培養(yǎng)組的細(xì)胞形態(tài)一致，均為長(zhǎng)梭形或多角形，說(shuō)明hPDLSCs-CM不會(huì)導(dǎo)致MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)特征發(fā)生改變。類似結(jié)果在許多干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的研究中被證實(shí)[7,14]，這可能與MSCs的旁分泌功能密切相關(guān)。MSCs生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)將一些活性物質(zhì)，如生長(zhǎng)因子、血管生成因子、激素、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶和激素等分泌到培養(yǎng)環(huán)境中，這些活性物質(zhì)不僅對(duì)維持干細(xì)胞自身的未分化狀態(tài)和存活具有關(guān)鍵作用，還可以影響其他細(xì)胞的生長(zhǎng)和(或)功能，保持其原有的典型的細(xì)胞形態(tài)，且不會(huì)明顯改變細(xì)胞體積[16]。細(xì)胞增殖能力是反映生物學(xué)活性的重要指標(biāo)之一，組織的生長(zhǎng)、修復(fù)與重建都需要依靠細(xì)胞的增殖來(lái)完成[17]。本研究通過(guò)MTT法和細(xì)胞周期分析檢測(cè)hPDLSCs-CM對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活力的影響，結(jié)果顯示，hPDLSCs-CM干預(yù)可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖，且可正向促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期，加速細(xì)胞發(fā)生有絲分裂。類似結(jié)果也在其他的體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)中得以證實(shí)。Hendudari等[18]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合骨髓MSCs-CM與激光有利于人皮膚成纖維細(xì)胞在高糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。Nagata等[19]將牙周膜干細(xì)胞CM植入大鼠牙周缺損組織，獲得了較好的牙周組織再生，并且缺損的再生效果與條件培養(yǎng)液的濃度顯著相關(guān)。這些效應(yīng)與MSCs-CM的趨化性能、免疫調(diào)節(jié)功能、細(xì)胞生長(zhǎng)支持功能、抗細(xì)胞凋亡及血管生成功能等相關(guān)，但具體的機(jī)制尚無(wú)定論，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了hPDLSCs-CM干預(yù)可在不改變MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)特征的情況下增強(qiáng)其增殖能力。為研究干細(xì)胞衍生物CM應(yīng)用于牙周疾病及修復(fù)骨組織缺損的臨床治療提供了參考依據(jù)。但是，本研究對(duì)于具體干細(xì)胞培養(yǎng)液的內(nèi)容物質(zhì)沒(méi)有進(jìn)行深入檢測(cè)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)還將進(jìn)一步在體外細(xì)胞水平及牙周炎的動(dòng)物模型中驗(yàn)證hPDLSCs-CM對(duì)于成骨效應(yīng)所發(fā)揮的作用。