姜黃素對(duì)腦出血模型大鼠認(rèn)知功能以及海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響

徐 鵬， 葉 蕓， 喬 鵬

腦出血危害人類(lèi)健康的重大疾病，因腦出血引發(fā)的癡呆發(fā)生率很高(從5%～44%不等)。研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后的認(rèn)知功能障礙既包括急性出血性病變導(dǎo)致的即刻認(rèn)知功能障礙，也包括彌漫性血管和非血管病變緩慢積累導(dǎo)致的進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙[1]。Charlotte Cordonnier等對(duì)417例腦出血患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，16%的患者存在既存性癡呆，在重度腦出血患者中，既往癡呆的發(fā)生率高達(dá)23%[2]。腦出血患者中較高的既往癡呆發(fā)生率可能是由潛在的淀粉樣變病理所致[3]，其病變?cè)诖竽X中海馬區(qū)的損傷最為重要。

海馬神經(jīng)元凋亡在腦出血、血管性癡呆、阿爾茨海默病發(fā)病中均起著重要的作用[4]。神經(jīng)元凋亡受多種因素影響，如Bcl-2、Bax、caspases、活性氧(ROS)等。Bcl-2和caspases-3是已被認(rèn)知的兩個(gè)參與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控分子，抑制Bcl-2的表達(dá)，提高Bax的表達(dá)可以激活p53和caspases-3，將誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡[5～7]。

姜黃素是從姜黃中分離得到的一種天然多酚類(lèi)物質(zhì)。大量研究表明，姜黃素具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)活性等生物學(xué)和藥理特性，被認(rèn)為是一種潛在的治療延遲和治療各種與年齡有關(guān)的慢性疾病的藥物，越來(lái)越受到人們的關(guān)注[8～10]。然而目前對(duì)姜黃素參與調(diào)控海馬神經(jīng)元凋亡因子表達(dá)和學(xué)習(xí)記憶能力的影響卻少有報(bào)道。

為了尋找更有效、毒性更小的新型抗腦出血的藥物或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，本研究選用姜黃素作為活性因子，建立腦出血大鼠模型來(lái)評(píng)價(jià)姜黃素對(duì)腦出血大鼠模型的認(rèn)知和海馬區(qū)細(xì)胞凋亡作用及探索其作用機(jī)制，探索姜黃素輔助治療是否可以替代傳統(tǒng)藥物對(duì)腦出血引發(fā)的功能損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 動(dòng)物試驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)方案已得到動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。在本研究中選用從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)的24只12個(gè)月大的C57BL/6雄性大鼠作為研究對(duì)象，在這個(gè)年齡大鼠衰老的腦血管作用已經(jīng)完全發(fā)育成熟，飼養(yǎng)過(guò)程中維持12 h的光/暗循環(huán)，并且可以自由獲得水和食物。

1.2 試劑與儀器 Aβ25-35 (批號(hào):Y-0044) 購(gòu)買(mǎi)于BIOSS生物科技有限公司(北京，中國(guó))；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)買(mǎi)于BOSTER生物科技有限公司(武漢，中國(guó))；An RT-PCR試劑盒購(gòu)買(mǎi)于TransGen生物科技有限公司(北京，中國(guó))；Anti-Bcl-2、anti-Bax與anti-β-actin抗體購(gòu)買(mǎi)于Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室(伯克利，美國(guó))；MT-2000Morris水迷宮購(gòu)買(mǎi)于成都泰盟科技有限公司(成都，中國(guó))；戊巴比妥(批號(hào):76-74-4)、多聚甲醛(批號(hào):30525-89-4)、氯仿(批號(hào):67-66-3)、乙醇(批號(hào):64-17-5)；異丙醇(批號(hào):67-63-0)等常規(guī)試劑均購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma公司；LDH 檢測(cè)試劑盒(建成生物工程研究所，中國(guó))；細(xì)胞色素C釋放凋亡測(cè)定試劑盒(BioVision，美國(guó))；Sepharose凝膠(Invitrogen公司，美國(guó))；紫外分光光度計(jì)(Beckman-Coulter DU-640，美國(guó))；DL500 DNA(Invitrogen，美國(guó))；倒置顯微鏡S70購(gòu)自Leica DMIRB(Lognes，法國(guó))；ChemiDocXRS凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室(伯克利，美國(guó))；免疫組化試劑盒購(gòu)自北京ZSGB生物工程有限公司(中國(guó)，北京)；TC-512PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自Techen(倫敦，英國(guó))。

1.3 腦出血?jiǎng)游锝?用異氟醚麻醉大鼠并放置于立體定向的框架中，在做頭皮中線(xiàn)切口之前在頭皮下注射利多卡因。試驗(yàn)中使用無(wú)菌技術(shù)在大鼠前囪的外側(cè)(一半在前囪的左側(cè)，一半在前囪的右側(cè))和0.0 AP水平處鉆一個(gè)3.0 mm的孔，將一根26號(hào)針插入6.0 mm的深度，分別將1.0 L的無(wú)菌生理鹽水(n=8)和0.10 U(n=16)細(xì)菌膠原酶按常規(guī)注射法注入超過(guò)5 min，做為假手術(shù)組和腦出血患病大鼠[11～13]，針留在原處停留5 min以防止回流，隨后縫合傷口。在整個(gè)手術(shù)和恢復(fù)期間，使用直腸溫度探頭和加熱毯，使大鼠體溫被維持在37.0 ℃±0.5 ℃。

1.4 實(shí)驗(yàn)處理 所有藥物治療均于術(shù)后第21天開(kāi)始，將ICH建模大鼠隨機(jī)分為兩組，一組給予姜黃素(120 mg/kg，480 mg/kg)作為姜黃素(Cur)處理組;另一組作為模型組(0.005%乙醇/生理鹽水)。在膠原酶注射前及注射后1 d、3 d分別測(cè)量體重。體重變化百分比按公式計(jì)算：體重變化百分比(%)=(出血性后各時(shí)間點(diǎn)-出血性前體重)/出血性前體重×100。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 本研究采用Morris水迷宮法對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)是在一個(gè)圓形的白色塑料水池中進(jìn)行(直徑94 cm，深度31 cm)，里面裝滿(mǎn)了水(深度30 cm)和3000 ml脫脂牛奶，測(cè)試時(shí)溫度保持在25 ℃±1 ℃。逃生平臺(tái)是一個(gè)25 cm2的有機(jī)玻璃廣場(chǎng)，位于游泳池的一個(gè)象限的中心，距離泳池邊緣15 cm，并淹沒(méi)在液面下方1 cm。

1.5.1 隱藏的平臺(tái)測(cè)試 每只老鼠頭部標(biāo)注黃色，背帶著亞硝基黃原酸，在一個(gè)圓形池對(duì)小鼠進(jìn)行訓(xùn)練，一個(gè)隱藏的平臺(tái)將圓形池隨機(jī)分為4個(gè)象限，每次試驗(yàn)120 s，間隔30 min，連續(xù)5 d。通過(guò)在線(xiàn)圖像視頻跟蹤系統(tǒng)記錄大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間，并在120 s內(nèi)作為逃逸潛伏期。

1.5.2 空間探針實(shí)驗(yàn) 隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將平臺(tái)從池中取出，老鼠被留在距離主平臺(tái)最遠(yuǎn)的水池的四分之一處，通過(guò)在線(xiàn)圖像視頻跟蹤系統(tǒng)記錄大鼠通過(guò)平臺(tái)的次數(shù)、平臺(tái)象限停留時(shí)間、平臺(tái)象限的總距離的百分比。

1.6 神經(jīng)行為評(píng)分 姜黃素處理5 d后，對(duì)不同組處理的大鼠的神經(jīng)行為進(jìn)行行為評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分:無(wú)任何神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：提尾懸空后，大鼠前肢腕肘屈曲，肩內(nèi)旋，肘外擴(kuò)，緊貼胸壁，沒(méi)有其他不正常行為；2分：將大鼠放在光滑的平面上，橫向推動(dòng)大鼠肩部使其向前方移動(dòng)，肢體阻力減小，同時(shí)伴有前肢彎曲動(dòng)作，無(wú)轉(zhuǎn)圈行為；3分：大鼠自由活動(dòng)時(shí)會(huì)發(fā)生環(huán)轉(zhuǎn)或轉(zhuǎn)圈；4分：肢體軟癱，肢體無(wú)法進(jìn)行自發(fā)活動(dòng)。分值越高表明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.7 大鼠海馬神經(jīng)元組織病理學(xué)檢查 將大鼠腹腔注1.0%的戊巴比妥，灌注4%多聚甲醛固定腦24 h，隨后將腦組織取出稱(chēng)重，固定在10%的中性福爾馬林緩沖液中，脫水后使用石蠟將其封裝在冠狀切片中，隨后H&E染色，在光學(xué)顯微鏡下(400×)進(jìn)行病理研究。實(shí)驗(yàn)中仔細(xì)觀察凋亡細(xì)胞的明顯形態(tài)學(xué)特征，包括細(xì)胞核凝結(jié)和碎裂情況。由于凋亡細(xì)胞在細(xì)胞核內(nèi)呈褐色，采用石蠟切片TUNEL免疫組織化學(xué)染色法相結(jié)合計(jì)算凋亡細(xì)胞指數(shù)。凋亡指數(shù)的計(jì)算方法為隨機(jī)選取100個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的百分比，采用GD-10.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率。

1.8 大鼠腦組織RNA分離及caspase-3 mRNA分析 大鼠腦組織麻醉后，注射1.0%戊巴比妥麻醉。按照文獻(xiàn)中描述的一般步驟，用TRIzol對(duì)組織總RNA進(jìn)行分離和提取。純度：A260/280為1.91-2.19，A260/230為1.98-2.31；而濃度> 0.2 μg/μl，使用1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。PCR產(chǎn)物在0.1%瓊脂糖凝膠電泳的DL500DNA標(biāo)記，采用β-actin作為空白，凝膠成像后定量分析。

1.9 細(xì)胞培養(yǎng) PC 12細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，湖北武漢)杜爾貝克補(bǔ)充5%胎牛血清、10%馬血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，在改良的培養(yǎng)基沖入CO2(5% CO2，37 ℃)培養(yǎng)，每3～5 d更換一次新的培養(yǎng)基。

1.10 Western blotting分析PC12細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá) PC12細(xì)胞培養(yǎng)在密度為1.0×105six-well中(2.0 ml)與20 μmol/L Aβ25-35在CO2培養(yǎng)箱中反應(yīng)12 h以建立的細(xì)胞模型，隨后將細(xì)胞隨機(jī)分為5組，使用血清DMEM培養(yǎng)基沖洗，培養(yǎng)基(空白)或含有20 μmol/L Aβ25-35的姜黃素(120 mg/kg，240 mg/kg，480 mg/kg)反應(yīng)12 h，假手術(shù)組PC12細(xì)胞也用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基沖洗，并作為對(duì)照處理組。Bax與Bcl-2蛋白表達(dá)量采用Quantity One System，Bcl-2、Bax的比率以Bax/β-actin和Bcl-2/β-actin計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對(duì)腦出血大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響 Morris水迷宮試驗(yàn)是被廣泛使用的用于評(píng)估空間學(xué)習(xí)和記憶認(rèn)知的經(jīng)典方法，在本文中我們采用Morris水迷宮試驗(yàn)對(duì)大鼠建模后的空間學(xué)習(xí)和記憶能力開(kāi)展了研究，不同處理組在Morris水迷宮中探測(cè)的運(yùn)動(dòng)軌跡(見(jiàn)圖1)。

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(見(jiàn)表1)，而分別給予120、480 mg/(kg·d)的姜黃素(Cur)處理的腦出血大鼠與模型組大鼠相比，2 d后大鼠的逃避潛伏期均顯著降低(P<0.01)。此外，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠在穿越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間、平臺(tái)象限的總距離的百分比3個(gè)方面均明顯降低(P<0.01)(見(jiàn)表2)，而Cur處理組與模型組相比顯著增加(P<0.01)。這些結(jié)果揭示姜黃素能顯著提高腦出血大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶認(rèn)知能力。

2.2 姜黃素對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)元凋亡的影響 腦出血的病理改變和神經(jīng)元損傷是海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡關(guān)鍵因素。大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)及凋亡百分比，假手術(shù)組的神經(jīng)元凋亡比例為(8.1±1.07)%，而模型組高達(dá)(65±1.23)%，采用120、480 mg/kg姜黃素處理后神經(jīng)元凋亡比例下降為(36.50±2.43)%、(15.00±2.51)%，這一結(jié)果表明神經(jīng)元凋亡在腦出血患者中起重要作用，能有效抑制神經(jīng)元凋亡(見(jiàn)圖2)。

2.3 姜黃素對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)元組織caspase-3 mRNA、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 對(duì)大鼠腦組織RNA分離及caspase-3 mRNA分析，數(shù)據(jù)顯示患病組大鼠神經(jīng)元組織caspase-3的mRNA表達(dá)明顯高于假手術(shù)組大鼠(P<0.01)。與模型組相比，姜黃素處理(120、480 mg/kg)顯著降低了腦出血大鼠caspase-3 mRNA的表達(dá)(P<0.01)。試驗(yàn)中進(jìn)一步通過(guò)建立細(xì)胞模型評(píng)估不同處理對(duì)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響，以探討細(xì)胞凋亡通路相關(guān)的可能機(jī)制。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在120 mg/kg、480 mg/kg濃度下姜黃素處理細(xì)胞模型12 h，顯著下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)水平(P<0.01)并且上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平(見(jiàn)表3)。與假手術(shù)組相比，模型組Bcl-2/Bax的相對(duì)比例顯著下降(P<0.01)，而經(jīng)120 mg/kg、480 mg/kg濃度姜黃素處理后，這一比值由0.3顯著提高至0.7、1.4(P<0.05)。這些結(jié)果表明，姜黃素的抗腦出血作用可能與Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)參與抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制相關(guān)。

表1 姜黃素對(duì)逃避延遲的影響

表2 姜黃素對(duì)穿越平臺(tái)次數(shù)的影響

表3 姜黃素對(duì)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

腦出血是一種致命的卒中，不僅會(huì)導(dǎo)致患者死亡，還是會(huì)對(duì)幸存者造成長(zhǎng)期的神經(jīng)或認(rèn)知損傷，現(xiàn)階段用于腦出血治療的藥物只能緩解患者的癥狀，并不能起到延緩病的發(fā)展或治愈疾病的功效，目前仍缺乏有效的治療方法。為了尋找更有效、毒性更小的新型抗腦出血的藥物或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，本研究選用姜黃素作為活性因子，建立腦出血大鼠模型來(lái)評(píng)價(jià)姜黃素對(duì)腦出血大鼠模型的認(rèn)知和海馬區(qū)細(xì)胞凋亡作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Morris水迷宮試驗(yàn)證實(shí)與患病組大鼠相比，姜黃素處理的大鼠具有較短的脫逃潛伏期，穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)象限停留時(shí)間、平臺(tái)象限的總距離的百分比顯著增加，姜黃素能改善腦出血大鼠的認(rèn)知功能。

從腦出血?jiǎng)游锬Ｐ偷幕A(chǔ)研究和臨床資料中積累的證據(jù)表明，神經(jīng)元損傷和丟失是神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵因素，細(xì)胞凋亡阿爾茨海默病和其他許多慢性神經(jīng)退行性疾病中患者的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育起著重要作用，細(xì)胞凋亡主要通過(guò)線(xiàn)粒體途徑和外源性途徑兩種途徑(死亡受體介導(dǎo))通路。固有的凋亡過(guò)程發(fā)生在線(xiàn)粒體中，主要影響B(tài)cl-2家族和caspases[14,15]。細(xì)胞凋亡的外在途徑包括死亡信號(hào)的相互作用(如TNF-α TNFR1)和caspase-8裂解procaspase-3使其激活。Bcl-2家族由促凋亡蛋白(Bax、Bad和Bak)和抗凋亡蛋白(Bcl-2和Bcl-xL)組成。不良反應(yīng)可增加線(xiàn)粒體通透性，釋放促凋亡因子，并通過(guò)抑制抗凋亡的Bcl-2家族蛋白觸發(fā)caspase信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。促凋亡蛋白(如Bax)與抗凋亡蛋白(如Bcl-2)的比例直接決定了細(xì)胞線(xiàn)粒體外膜各通道的開(kāi)放程度和對(duì)凋亡的調(diào)控。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子，其激活被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵步驟?；罨腸aspases裂解多種靶蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞中DNA片段的破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡在腦出血的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色，姜黃素可以顯著抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。此外，我們還分析了神經(jīng)組織caspase-3 mRNA和Bcl-2在PC12細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果表明患病組caspase-3表達(dá)顯著增加，而姜黃素能顯著降低患病鼠caspase-3 mRNA和Bax蛋白的表達(dá)，同時(shí)增加Bcl-2/Bax的比值和Bcl-2蛋白的表達(dá)，這些研究結(jié)果揭示姜黃素可通過(guò)抑制神經(jīng)元凋亡信號(hào)通路改善腦出血模型大鼠認(rèn)知功能，預(yù)防神經(jīng)元損傷。但目前尚不清楚姜黃素對(duì)大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用是直接通過(guò)調(diào)控凋亡通路發(fā)揮作用還是通過(guò)細(xì)胞凋亡后IR的進(jìn)一步改善來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這部分機(jī)制需要進(jìn)一步開(kāi)展相應(yīng)的研究。

然而，姜黃素對(duì)caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)的顯著影響顯示，姜黃素的抗腦出血作用也可能與線(xiàn)粒體通透性、CytC、PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。因此，后續(xù)研究仍需進(jìn)一步開(kāi)展姜黃素對(duì)神經(jīng)退行性變中神經(jīng)元凋亡相關(guān)分子通路的作用機(jī)制工作。

圖1 不同處理組在Morris水迷宮中探測(cè)的運(yùn)動(dòng)軌跡。A、B、C、D分別為假手術(shù)組、模型組、Cur 120 mg/kg處理組、Cur 480 mg/kg處理組

圖2 不同處理對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響。A、B、C、D分別為假手術(shù)組、模型組、Cur 120 mg/kg以及Cur 480 mg/kg處理組細(xì)胞凋亡微觀結(jié)構(gòu)