蛹期薜荔榕小蜂的瓊脂培養(yǎng)

趙 萌,吳文珊,陳友鈴,吳婷婷

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350117)

蛹期是寄生蜂生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要階段，氣候因素直接影響寄生蜂的生長(zhǎng)發(fā)育，溫度和光周期對(duì)蛹期昆蟲(chóng)發(fā)育的影響尤為顯著(Hagstrum and Milliken,1988;文禮章等,1997;陳乾錦等,2004)。昆蟲(chóng)作為變溫動(dòng)物，不同種類的昆蟲(chóng)蛹，其發(fā)育需要不同的溫度條件，文獻(xiàn)表明室內(nèi)培養(yǎng)昆蟲(chóng)蛹的最適溫度范圍為20～31℃，蛹發(fā)育歷期隨溫度的升高而縮短(仵均祥等,1994;Dunnetal.,2008;顧俊榮等,2012)，但溫度過(guò)高可導(dǎo)致蛹的羽化率下降或無(wú)法羽化(李倩等,2017)。光周期對(duì)昆蟲(chóng)蛹的生長(zhǎng)發(fā)育也產(chǎn)生影響(Watanabe,2000)，通常認(rèn)為短光周期(≤12 h)更利于昆蟲(chóng)蛹的羽化(徐金漢等,2002;孫曉婷等,2019)，例如小地老虎Agrotisypsilon、黏蟲(chóng)Mythimnaseparata蛹期生長(zhǎng)發(fā)育的最適光周期為0L∶24D (褚艷娜等,2014;王熠等,2019)。但光周期對(duì)斑翅食蚧蚜小蜂Coccophagusceroplastae蛹期的發(fā)育歷期影響不明顯(張方平等,2010)。

榕小蜂與榕樹(shù)互惠共生，榕小蜂為榕樹(shù)授粉，同時(shí)依賴榕樹(shù)雌(癭)花子房做為孕育場(chǎng)所，完成生命周期(羅光坦等,2000)。目前，榕-蜂生物學(xué)、行為學(xué)、化學(xué)生態(tài)學(xué)及繁殖生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域的研究已取得豐碩的進(jìn)展(彭艷瓊等,2005;Herreetal.,2008;吳文珊和陳友鈴,2008;Chenetal.,2012;Jansen-Gonzalezetal.,2012;楊升等,2017)，但榕小蜂在蟲(chóng)癭中漫長(zhǎng)發(fā)育階段的相關(guān)研究幾為空白，亦無(wú)室內(nèi)飼養(yǎng)或培養(yǎng)榕小蜂成功的先例。薜荔Ficuspumilavar.pumila屬蕁麻目(Urticales)?？?Moraceae)榕屬Ficus常綠攀援藤本植物，廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南各個(gè)省區(qū)，是熱帶和亞熱帶植物生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵樹(shù)種(張秀實(shí)等,1998)。薜荔瘦果富含果膠、蛋白質(zhì)、維生素及礦質(zhì)元素等養(yǎng)分(吳文珊和方玉霖,1999)，是開(kāi)發(fā)低脂低熱保健飲品的首選資源，但薜荔結(jié)實(shí)依賴膜翅目(Hymenoptera)榕小蜂科(Agaonidae)的薜荔榕小蜂Wiebesiapumilae，沒(méi)經(jīng)榕小蜂授粉的花序?qū)⑻崆懊撀?陳勇等,2003)。本實(shí)驗(yàn)以瓊脂培養(yǎng)蛹期薜荔榕小蜂W.pumilae，探究不同溫度和光周期對(duì)蛹期小蜂發(fā)育的影響，實(shí)現(xiàn)對(duì)榕小蜂蛹期發(fā)育的連續(xù)性觀察；同時(shí)通過(guò)瓊脂培養(yǎng)縮短蛹期榕小蜂的發(fā)育歷期，解決蛹期植食性寄生蜂無(wú)法依據(jù)形態(tài)進(jìn)行種類鑒定的難題，并有望不受環(huán)境、季節(jié)和寄主等因素的限制，快速獲得大量標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)蟲(chóng)源。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

薜荔榕小蜂采集于福州閩侯鎮(zhèn)(26°01′N,119°12′E)。薜荔榕小蜂W.pumilae分子證據(jù)顯示存在3個(gè)隱存種(Chenetal.,2012)，本研究中的種類是分布于南部的隱存種2，由于目前尚未對(duì)該復(fù)合群其進(jìn)行分類命名，仍用學(xué)名Wiebesiapumilae。

1.2 野外薜荔榕小蜂及其蟲(chóng)癭的發(fā)育觀測(cè)

2019年8月初，對(duì)新生長(zhǎng)的薜荔雄花序進(jìn)行標(biāo)記，并選取其中的90個(gè)用100目的尼龍網(wǎng)袋(20 cm×20 cm)罩住以阻止小蜂進(jìn)入薜荔果實(shí)干擾實(shí)驗(yàn)，每天觀察花序發(fā)育狀態(tài)，8月31日隱頭花序的苞口開(kāi)始松動(dòng)，果內(nèi)散發(fā)出芳香氣味，表明花序小花開(kāi)放進(jìn)入雌花期(引誘傳粉榕小蜂進(jìn)果傳粉或繁殖時(shí)期)，于是打開(kāi)網(wǎng)袋，每果放入15頭小蜂產(chǎn)卵，翌日統(tǒng)計(jì)每果進(jìn)蜂數(shù)，共獲得產(chǎn)卵薜荔雄果88個(gè)。此后，每7 d隨機(jī)采摘3個(gè)已被產(chǎn)卵的雄果，用密封袋裝好帶回實(shí)驗(yàn)室，將其縱向剖開(kāi)，隨機(jī)取30個(gè)蟲(chóng)癭在立體顯微鏡下解剖，用解剖針將蟲(chóng)癭劃開(kāi)并取出小蜂，置于載玻片上，使用顯微鏡觀察并記錄小蜂發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)變化及蟲(chóng)癭表皮層、保護(hù)層、內(nèi)皮層的形態(tài)變化，監(jiān)測(cè)榕小蜂發(fā)育進(jìn)程，觀測(cè)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)如下：

(2)蟲(chóng)癭含水量：將剔除榕小蜂后的蟲(chóng)癭立即置于2 mL指形管內(nèi)，防止水分流失，每管10個(gè)蟲(chóng)癭，共3組，使用分析天平稱量，記錄蟲(chóng)癭總重，隨后置于80℃烘箱內(nèi)烘干至恒重后，記錄蟲(chóng)癭烘干后重量。蟲(chóng)癭含水量(%)=(蟲(chóng)癭總重-烘干后重量)/蟲(chóng)癭總重×100%。

(3)羽化率：羽化，指榕小蜂已羽化但未打洞離開(kāi)蟲(chóng)癭。雌(雄)蜂羽化率(%)=雌(雄)蜂羽化成蟲(chóng)數(shù)/雌(雄)蜂總數(shù)×100%。

(4)出飛率：出飛，指羽化榕小蜂已打洞離開(kāi)蟲(chóng)癭。雌(雄)蜂出飛率(%)=雌(雄)蜂出飛成蟲(chóng)數(shù)/雌(雄)蜂總數(shù)×100%。

1.3 蛹期薜荔榕小蜂的瓊脂培養(yǎng)

1.3.1瓊脂培養(yǎng)基的制備：瓊脂培養(yǎng)基的組成：瓊脂15 g；超純水1 000 mL，pH 7。將配制好的瓊脂培養(yǎng)基分別放入高壓蒸汽滅菌鍋進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(121℃ 0.105 MPa滅菌30 min)；滅菌后將瓊脂培養(yǎng)基分裝入90 mL培養(yǎng)皿成平板，使各培養(yǎng)皿中形成至少5 mm厚的瓊脂層(瓊脂層厚度約為培養(yǎng)皿壁高度的1/2)。所有實(shí)驗(yàn)材料置于超凈臺(tái)內(nèi)紫外線殺菌30 min。

1.3.3不同光周期下蛹期薜荔榕小蜂發(fā)育速率觀測(cè)：在28℃條件下，將蟲(chóng)癭分別置于0L∶24D,10L∶14D,12L∶12D,14L∶10D和24L∶0D光周期處理的培養(yǎng)箱內(nèi)，小蜂鏡檢同1.3.2節(jié)，并計(jì)算1.2節(jié)中的各項(xiàng)。每個(gè)培養(yǎng)皿30粒蟲(chóng)癭，每個(gè)處理設(shè)5次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016和SPSS 21軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，并依據(jù)Duncan氏多重檢驗(yàn)進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 野生型薜荔榕小蜂預(yù)蛹至出飛發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)變化

2.1.1預(yù)蛹：薜荔榕小蜂預(yù)蛹是5齡幼蟲(chóng)(圖1:A)發(fā)育至初期蛹之間的一個(gè)短暫的過(guò)渡時(shí)期，蟲(chóng)體乳白，呈“C”型彎曲(圖1:B)。在預(yù)蛹時(shí)期，蟲(chóng)體內(nèi)部正在發(fā)生著某些組織器官解離與重組，出現(xiàn)蛹期的器官分化，并且中腸的活動(dòng)靜止，整個(gè)蟲(chóng)體處于不吃不動(dòng)的狀態(tài)，當(dāng)發(fā)育至末期，蟲(chóng)癭內(nèi)壁蟲(chóng)體排出的蛹便清晰可見(jiàn)，雌性發(fā)育歷期為23.06±5.67 d(n=39)；雄性發(fā)育歷期為21.97±6.68 d(n=31)。

2.1.2蛹：薜荔榕小蜂的蛹屬于裸蛹(或離蛹)，依據(jù)蛹的顏色以及其他特征，可以分為初期蛹、中期蛹和成熟蛹。

初期蛹：雌、雄蛹體的體色皆呈白色，分為頭、胸、腹3部分，兩性蛹體差異明顯：雌性頭扁腹圓，初具翅芽，復(fù)眼較大，隨著發(fā)育的進(jìn)行逐漸呈淡粉色(圖1:C)；雄性身體較雌性略瘦長(zhǎng)，腹部漸細(xì)(圖1:D)，無(wú)翅芽，復(fù)眼小且無(wú)色。雌性發(fā)育歷期為16.30±6.22 d(n=41)；雄性發(fā)育歷期為15.58±8.49 d(n=31)。

中期蛹：雌性蛹體依然呈白色，復(fù)眼顏色逐漸加深至黑色，單眼亦可見(jiàn)(圖1:E)，頭部微微變黑；雄性身體的骨化速度較雌性更快，黑色復(fù)眼此時(shí)已經(jīng)可見(jiàn)，頭、胸、前翅皆呈淡黃色(圖1:F)。雌性發(fā)育歷期為16.95±6.36 d(n=50)；雄性發(fā)育歷期為15.91±8.54 d(n=27)。

成熟蛹：雌性已基本完成形態(tài)的分化，頭、胸、腹的顏色依次加深至黑色，觸角、附肢、足也變?yōu)楹谏?，翅折疊在蛹皮內(nèi)，呈黑色盤(pán)狀，蛹體保持靜止?fàn)顟B(tài)(圖1:G)；雄性蛹體體色與雌性出現(xiàn)明顯的差異，呈黃色，且末期顏色進(jìn)一步加深至黃褐色，此時(shí)蛹體已完全骨化，與雄性成蟲(chóng)形態(tài)相似，頭、背板、附肢由淡黃色逐漸變?yōu)辄S褐色，身體能夠輕微扭動(dòng)(圖1:H)。雌性發(fā)育歷期為12.84±2.41 d(n=38)；雄性發(fā)育歷期為11.84±3.31 d(n=26)。

2.1.3成蟲(chóng)：羽化成蟲(chóng)：已羽化但在蟲(chóng)癭內(nèi)的成蟲(chóng)。雌成蟲(chóng)身體為黑色，頭部扁平，兩對(duì)觸角，1對(duì)復(fù)眼和3只單眼清晰可見(jiàn)，兩對(duì)翅已展開(kāi)，覆密毛；前、中、后足均能活動(dòng)，腹部具產(chǎn)卵器(圖1:I)；雄成蟲(chóng)身體為棕褐色，個(gè)體較雌性略小，具復(fù)眼，無(wú)單眼，一對(duì)觸角，背無(wú)翅，蟲(chóng)體極度彎曲，前后足腿節(jié)粗壯，中足退化(圖1:J)。雌蜂羽化至出飛的歷期為8.17±1.51 d(n=49)；雄蜂羽化至出飛的歷期為7.16±2.58 d(n=44)。

出飛成蟲(chóng)：羽化并已離開(kāi)蟲(chóng)癭的成蟲(chóng)，雌、雄蜂各形態(tài)特征同羽化成蟲(chóng)(圖1:K-L)。

圖1 薜荔榕小蜂5齡幼蟲(chóng)至出飛成蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)變化Fig.1 Morphological changes during the developmental process of Wiebesia pumilae from the 5th instar larva to adult flying out of gallsA:5齡幼蟲(chóng)5th instar larva;B:預(yù)蛹Prepupa;C:雌性初期蛹Early female pupa;D:雄性初期蛹Early male pupa;E:雌性中期蛹Middle female pupa;F:雄性中期蛹Middle male pupa;G:雌性成熟蛹Mature female pupa;H:雄性成熟蛹Mature male pupa;I:羽化的雌成蟲(chóng)Emerged female adult;J:羽化的雄成蟲(chóng)Emerged male adult;K:雌性出飛成蟲(chóng)Female adult flying out of galls;L:雄性出飛成蟲(chóng)Male adult flying out of galls.標(biāo)尺Scale bars=500 μm.

圖2 溫度對(duì)瓊脂培養(yǎng)的蛹期薜荔榕小蜂發(fā)育的影響Fig.2 Effect of temperature on the development of Wiebesia pumilae in the pupal stage cultured on agar culture mediumCK:野外In the wild.發(fā)育成熟度：將榕小蜂從預(yù)蛹至成蟲(chóng)期的發(fā)育過(guò)程分6個(gè)階段并以數(shù)值1-6依次賦值，則發(fā)育成熟度為每階段所有實(shí)驗(yàn)小蜂賦值的平均值。Developmental maturity:The developmental process of fig wasps from prepupa to adult was divided into six stages and successively assigned by values 1-6,and the developmental maturity was the average value of all experimental fig wasps at each stage.

圖3 30℃和32℃下瓊脂培養(yǎng)的薜荔榕小蜂的存活率Fig.3 Survival rates of Wiebesia pumilae cultured on agar culture medium at 30℃ and 32℃

2.2 瓊脂培養(yǎng)時(shí)溫度對(duì)小蜂發(fā)育的影響

瓊脂培養(yǎng)時(shí)，32℃下，薜荔榕小蜂發(fā)育停滯在預(yù)蛹階段，表明高溫阻礙薜荔榕小蜂的發(fā)育(圖2)，蛹體表面在第3天出現(xiàn)輕微皺縮，半致死率發(fā)生在第12天(圖3)，此時(shí)蛹體逐漸失去原本的形態(tài)，開(kāi)始腐爛變軟，體節(jié)已無(wú)法辨認(rèn)，白色脂肪粒融為一團(tuán)；第16天小蜂全部死亡，此時(shí)蛹體明顯縮小，脂肪粒消失，變成無(wú)色透明狀；30℃條件下，小蜂的半致死率發(fā)生在第21天(圖3)，部分小蜂能夠發(fā)育至成熟蛹，但蛹體因失水變得不飽滿且透明，失去正常蟲(chóng)態(tài)，無(wú)法羽化。

22～28℃范圍內(nèi)，薜荔榕小蜂發(fā)育速率與溫度呈正相關(guān)(R2均大于0.96)，培養(yǎng)溫度越高薜荔榕小蜂發(fā)育歷期越短，薜荔榕小蜂均能成功羽化，但4個(gè)溫度下的薜荔榕小蜂羽化率無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)，因此，僅從發(fā)育歷期看，28℃培養(yǎng)薜荔榕小蜂發(fā)育最快，此條件下，薜荔榕小蜂從預(yù)蛹發(fā)育至成蟲(chóng)的歷期較野外發(fā)育的雌、雄蜂(CK)提前約44.00 d(圖2)。

瓊脂培養(yǎng)條件下的薜荔榕小蜂發(fā)育較整齊，成熟蛹階段通常沒(méi)有其他發(fā)育期的薜荔榕小蜂存在，但野外對(duì)照組卻有中期蛹存在(表1)；雄蜂在22～28℃下的成熟蛹期和羽化期的發(fā)育歷期沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，而雌蜂在各發(fā)育期均存在顯著性差異(P<0.05)(表2)；瓊脂培養(yǎng)下雄蜂有少量出飛，而雌蜂均未能出飛(表1)。

表1 瓊脂培養(yǎng)時(shí)不同溫度下羽化期薜荔榕小蜂出飛率及蟲(chóng)癭內(nèi)未出飛小蜂的發(fā)育狀態(tài)Table 1 The eclosion rate of Wiebesia pumilae wasps in the emergence period and the developmental status of non-eclosed wasps in galls cultured on agar culture medium at different temperatures

表2 瓊脂培養(yǎng)時(shí)不同溫度下薜荔榕小蜂各階段蛹發(fā)育歷期(d)Table 2 The developmental duration (d) of various stages of Wiebesia pumilae pupae cultured on agar culture medium at different temperatures

2.3 瓊脂培養(yǎng)時(shí)溫度對(duì)蟲(chóng)癭內(nèi)雌成蟲(chóng)壽命的影響

瓊脂培養(yǎng)時(shí)，22,24,26和28℃下蟲(chóng)癭內(nèi)羽化薜荔榕小蜂雌成蟲(chóng)的壽命分別為48.97,36.62,28.86和22.24 h，各溫度之間差異顯著(P<0.05)(圖4)；用線性模型擬合雌性成蟲(chóng)的平均壽命(y)與溫度(x)的直線回歸方程：y=-0.20x+6.5,R2=0.96，說(shuō)明蟲(chóng)癭內(nèi)薜荔榕小蜂雌成蟲(chóng)的壽命隨溫度的升高而顯著縮短。

圖4 不同溫度下瓊脂培養(yǎng)蟲(chóng)癭內(nèi)薜荔榕小蜂雌成蟲(chóng)壽命Fig.4 Longevity of female adults of Wiebesia pumilae in galls cultured on agar culture medium at different temperatures圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;柱上大小寫(xiě)字母分別表示差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)(Duncan氏多重檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE.Different capital and small letters above bars indicate extremely significant differences (P<0.01) and significant differences (P<0.05),respectively (Duncan’s multiple range test).

2.4 薜荔榕小蜂蛹發(fā)育起點(diǎn)溫度和有效積溫

根據(jù)不同溫度下蛹期薜荔榕小蜂的發(fā)育歷期，采用直接最優(yōu)法求出其不同發(fā)育階段的發(fā)育起點(diǎn)溫度和有效積溫，表3結(jié)果表明，薜荔榕小蜂不同發(fā)育階段的發(fā)育起點(diǎn)溫度和有效積溫均有差異，越是薜荔榕小蜂成熟的階段，其發(fā)育起點(diǎn)溫度越低，而所需有效積溫越高。培養(yǎng)溫度應(yīng)高于預(yù)蛹至羽化成蟲(chóng)整個(gè)蛹期發(fā)育各階段的發(fā)育起點(diǎn)溫度，即培養(yǎng)溫度的設(shè)置不低于17.18℃。

表3 蛹期薜荔榕小蜂的發(fā)育起點(diǎn)溫度及有效積溫Table 3 The threshold temperature and effective accumulated temperature of Wiebesia pumilae in the pupal stage

2.5 瓊脂培養(yǎng)時(shí)光周期對(duì)蛹期薜荔榕小蜂發(fā)育的影響

瓊脂培養(yǎng)時(shí)，28℃下，不同光周期對(duì)蛹期薜荔榕小蜂發(fā)育速率的影響無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表4)，這可能是因?yàn)橄x(chóng)癭的表皮層和內(nèi)皮層在培養(yǎng)過(guò)程中很快就從黃色轉(zhuǎn)為褐色，阻礙了光照對(duì)薜荔榕小蜂的作用，抑或自然條件下蟲(chóng)癭位于密閉的榕果中，故蛹期薜荔榕小蜂對(duì)光的變化不敏感。

2.6 瓊脂培養(yǎng)薜荔榕小蜂蟲(chóng)癭含水量的變化

對(duì)不同溫度下瓊脂培養(yǎng)的蟲(chóng)癭含水量測(cè)定結(jié)果表明(圖5)，隨溫度的升高，含水量下降速度逐漸加快；培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，蟲(chóng)癭含水量越低。榕小蜂羽化時(shí)，22,24,26和28℃下的蟲(chóng)癭含水量分別為37.34%,38.23%,39.94%和41.79%，兩兩之間均呈極顯著性差異(P<0.01)，且極顯著低于野外對(duì)照組(51.63%)(P<0.01)。低含水量導(dǎo)致蟲(chóng)癭表皮層、保護(hù)層、內(nèi)皮層非常堅(jiān)硬，給薜荔榕小蜂雌、雄蜂的打洞行為帶來(lái)極大的困難。

2.7 野外生長(zhǎng)和瓊脂培養(yǎng)條件下的薜荔榕小蜂蟲(chóng)癭發(fā)育形態(tài)特征比較

蟲(chóng)癭壁分為表皮層、保護(hù)層和內(nèi)皮層，蟲(chóng)癭腔內(nèi)具營(yíng)養(yǎng)層和癭室。野外預(yù)蛹階段的蟲(chóng)癭被濕潤(rùn)飽滿的花被緊緊包裹，表皮層呈淺黃色，濕潤(rùn)且柔軟(圖6:A)；保護(hù)層呈米白色且富有彈性，為位于癭室內(nèi)的蛹提供良好的生存空間；內(nèi)皮層呈淺褐色，質(zhì)感濕潤(rùn)柔軟，使用鑷子很容易從將其從保護(hù)層上完整剝離(圖6:B,C)。野外薜荔榕小蜂羽化成蟲(chóng)階段，蟲(chóng)癭柄脫水明顯，易與蟲(chóng)癭分離，表皮層變?yōu)闇\褐色，略有脫水(圖6:D)；保護(hù)層無(wú)明顯變化，內(nèi)皮層轉(zhuǎn)呈褐色，因失水而無(wú)法完整撕下，質(zhì)感較脆(圖6:E-F)。瓊脂培養(yǎng)條件下的蟲(chóng)癭結(jié)構(gòu)在預(yù)蛹期時(shí)，與野外無(wú)明顯差異，羽化成蟲(chóng)時(shí)期，表皮層為深褐色，由于極度失水，干燥變硬，緊緊貼在保護(hù)層上(圖6:G)；保護(hù)層因脫水逐漸變硬，彈性減??；內(nèi)皮層質(zhì)感干硬，易碎成粉末狀(圖6:H-I)。

表4 不同光周期下瓊脂培養(yǎng)的薜荔榕小蜂的不同蟲(chóng)態(tài)個(gè)體占比(%)Table 4 Proportions of individuals of different developmental status (%) of Wiebesia pumilae cultured on agar culture medium at different photoperiods

圖5 不同溫度下瓊脂培養(yǎng)的薜荔榕小蜂蟲(chóng)癭含水量Fig.5 The water content of Wiebesia pumilae galls cultured on agar culture medium at different temperatures

3 討論

榕小蜂依賴專一的寄主供給營(yíng)養(yǎng)才能完成發(fā)育，因此人工培養(yǎng)榕小蜂十分困難。本研究通過(guò)瓊脂培養(yǎng)法實(shí)現(xiàn)了蛹期薜荔榕小蜂的室內(nèi)培養(yǎng)，通過(guò)比較不同溫度對(duì)蛹期薜荔榕小蜂發(fā)育的影響，確定了28℃為最適培養(yǎng)溫度，為薜荔榕小蜂的批量生產(chǎn)創(chuàng)造了可能性；榕小蜂的成蟲(chóng)期通常1～2 d，而幼蟲(chóng)期長(zhǎng)達(dá)數(shù)十天甚至數(shù)月，因此榕小蜂成蟲(chóng)采樣極為困難，而易采集的幼期榕小蜂卻難以鑒定，成為榕-蜂協(xié)同進(jìn)行化領(lǐng)域的研究瓶頸，榕小蜂蛹期瓊脂培養(yǎng)的成功，縮短了榕小蜂的發(fā)育歷期，可快速便捷地獲得蟲(chóng)源，為榕-蜂相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供便利。

圖6 野外和瓊脂培養(yǎng)條件下薜荔榕小蜂預(yù)蛹及羽化成蟲(chóng)階段的蟲(chóng)癭結(jié)構(gòu)比較Fig.6 Comparison of gall structure in prepupal and emerged adult stages of Wiebesia pumilae in the wild and cultured on agar culture mediumA-C:野外預(yù)蛹發(fā)育階段Prepupal stage in the wild.A:蟲(chóng)癭Gall;B:蟲(chóng)癭內(nèi)的預(yù)蛹Prepupa in gall;C:蟲(chóng)癭壁Gall shell.D-F:野外羽化成蟲(chóng)階段Emerged adult stage in the wild.D:蟲(chóng)癭Gall;E:蟲(chóng)癭內(nèi)的雄性羽化成蟲(chóng)Emerged male adult in gall;F:蟲(chóng)癭壁Gall shell.G-I:瓊脂培養(yǎng)的羽化成蟲(chóng)階段Emerged adult stage on agar culture.G:蟲(chóng)癭Gall;H:蟲(chóng)癭內(nèi)的雌性羽化成蟲(chóng)Emerged female adult in gall;I:蟲(chóng)癭壁Gall shell.ep:表皮層Epidermis;pr:保護(hù)層Protective layer;en:內(nèi)皮層Endodermis.

3.1 薜荔榕小蜂蛹期發(fā)育與溫度的關(guān)系

昆蟲(chóng)屬于變溫動(dòng)物，受外界環(huán)境的影響較大;在自然進(jìn)化的過(guò)程中，昆蟲(chóng)采取了一系列的措施來(lái)適應(yīng)溫度的變化并且形成了長(zhǎng)期的協(xié)同適應(yīng)機(jī)制(陳麗芳等,2015)。本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度在22～28℃下薜荔榕小蜂均能完成個(gè)體發(fā)育，在此范圍內(nèi)培養(yǎng)溫度越高，薜荔榕小蜂發(fā)育速率越快，但28℃下，雖發(fā)育最快，薜荔榕小蜂蛹期發(fā)育縮短了44.00 d(圖2)，但成蟲(chóng)壽命卻縮短了近85%，因此建議將培養(yǎng)至成熟蛹階段的薜荔榕小蜂轉(zhuǎn)入22℃或更低的溫度下培養(yǎng)，不僅可以延長(zhǎng)成蟲(chóng)壽命，也能夠減少蟲(chóng)癭的水分蒸發(fā)，有利于薜荔榕小蜂打洞出飛；瓊脂培養(yǎng)在預(yù)蛹和初期蛹發(fā)育歷期的縮幅顯著大于中期蛹和成熟蛹，可能是由于薜荔榕小蜂預(yù)蛹和初期蛹的發(fā)育起點(diǎn)溫度較高，而有效積溫較小的緣故；雄蜂的中蛹期和熟蛹期在22～28℃下的發(fā)育歷期沒(méi)有顯著差異，而雌蜂在各發(fā)育時(shí)期均存在差異(表2)，表明雌蜂比雄蜂對(duì)溫度變化更為敏感。另外，在30℃和32℃培養(yǎng)溫度下，薜荔榕小蜂在發(fā)育過(guò)程中均出現(xiàn)因失水造成體表皺縮的現(xiàn)象，可能是當(dāng)外界環(huán)境溫度超過(guò)一定限度時(shí)，薜荔榕小蜂增加了體內(nèi)水分的蒸發(fā)以降低體內(nèi)及體表溫度，以避免高溫傷害。持續(xù)高溫也會(huì)使正常細(xì)胞內(nèi)的水分平衡遭到破壞，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可恢復(fù)的損傷(Eliopoulos and Stathas,2003;Skovgrd and Nachman,2015)，進(jìn)而改變細(xì)胞、蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能(杜堯等,2007)，導(dǎo)致小蜂死亡。由于30℃培養(yǎng)過(guò)程中，部分薜荔榕小蜂死亡，而部分小蜂能發(fā)育至成熟蛹(但無(wú)法羽化)，表明薜荔榕小蜂對(duì)高溫的耐受性存在個(gè)體差異，耐受性高的薜荔榕小蜂存活期較長(zhǎng)，并由此推測(cè)30℃可能是薜荔榕小蜂的高溫耐受性極限，超過(guò)此極限則導(dǎo)致預(yù)蛹滯育。

3.2 薜荔榕小蜂羽化后未能出飛的原因

自然界中雄性薜荔榕小蜂通常先于雌蜂羽化，并自行咬破蟲(chóng)癭壁鉆出，雌蜂則在蟲(chóng)癭中等待雄蜂到來(lái)，雄蜂尋找到雌蜂所在蟲(chóng)癭后從外部咬破蟲(chóng)癭壁與其交配，雌蜂在此基礎(chǔ)上，將雄蜂咬破的洞口繼續(xù)擴(kuò)大后鉆出蟲(chóng)癭，經(jīng)苞口攜粉出飛(Liuetal.,2019)，而瓊脂培養(yǎng)條件下絕大多數(shù)羽化薜荔榕小蜂均未能出飛的原因包括：(1)蟲(chóng)癭的含水量低。從圖5中的CK曲線可以看出，薜荔榕小蜂從預(yù)蛹到蛹羽化為成蟲(chóng)階段蟲(chóng)癭的含水量(濕度)變化為：預(yù)蛹-中期蛹階段，含水量變化不明顯，呈略有下降的趨勢(shì)；但進(jìn)入成熟蛹(56 d)之后，蟲(chóng)癭含水量急劇下降，推測(cè)此期苞口開(kāi)始松動(dòng)，造成隱頭果內(nèi)濕度下降；但羽化期蟲(chóng)癭含水量仍有51.63%，極顯著高于瓊脂培養(yǎng)條件下的蟲(chóng)癭含水量最高組(41.79%)。瓊脂培養(yǎng)基雖具有良好的保濕效果，但受培養(yǎng)溫度(培養(yǎng)溫度越高，蟲(chóng)癭失水越快)和培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)(培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，蟲(chóng)癭失水越快，而培養(yǎng)溫度越低，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng))影響，蟲(chóng)癭組織因失水變化劇烈，表皮層和內(nèi)皮層變?yōu)楹稚?、?jiān)硬的革質(zhì)狀態(tài)，保護(hù)層彈性減小且硬度增大，從而給榕小蜂的打洞行為帶來(lái)了極大的困難。(2)薜荔榕小蜂壽命縮短。蟲(chóng)癭含水量降低，導(dǎo)致蟲(chóng)癭內(nèi)的濕度降低，影響小蜂體內(nèi)水分平衡與代謝。(3)瓊脂培養(yǎng)導(dǎo)致蟲(chóng)癭固著不穩(wěn)，增加了薜荔榕小蜂出飛打洞難度和速度。由于蟲(chóng)癭均以蟲(chóng)癭柄獨(dú)立插在瓊脂培養(yǎng)基中，出飛的雄蜂無(wú)法到達(dá)雌蜂所在蟲(chóng)癭開(kāi)掘交配孔，導(dǎo)致雌蜂無(wú)法出飛。