把天門(mén)化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)及其總黃酮含量測(cè)定

張 瑩，傅 靜，王孝勛，鐘秋節(jié)，俞 鵬

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530200）

把天門(mén)為豆科胡枝子屬植物美麗胡枝子（Les?pedeza formosa）的根，又名三妹木、謀見(jiàn)亮［1］，廣泛分布于廣西、廣東、陜西、江蘇、甘肅、浙江、安徽、江西、湖北、福建、臺(tái)灣、四川、貴州、云南等省區(qū)［2］。廣西主產(chǎn)于柳州、梧州、桂林、南寧等地，是瑤族地區(qū)的民間常用藥［1］。中醫(yī)認(rèn)為其味微辛澀，性微溫，具有活血散瘀、消腫止痛之功，主治跌打腫痛、風(fēng)濕骨痛、肺癰［3］?，庒t(yī)認(rèn)為把天門(mén)具有清熱涼血、活血散瘀、消腫止痛、利尿、止血、潤(rùn)肺、祛風(fēng)濕的功效；主要用于風(fēng)濕骨痛、關(guān)節(jié)痛、腰腿痛、跌打損傷、骨折、脫臼等癥［1］。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)美麗胡枝子化學(xué)成分的研究較少，僅有Li 等［4］從安徽產(chǎn)美麗胡枝子根皮中分離得到2 個(gè)新的黃酮類(lèi)成分，命名為L(zhǎng)espedezaflava?none F和Lespedezaflavanone G。吳和珍等［5］研究發(fā)現(xiàn)湖北產(chǎn)美麗胡枝子的根皮中含有槲皮苷。傅靜等［6］建立了廣西產(chǎn)美麗胡枝子莖葉的HPLC 指紋圖譜，采用對(duì)照品指認(rèn)了3 個(gè)黃酮類(lèi)成分，分別為夏佛塔苷、牡荊素及異牡荊素?，F(xiàn)代藥理試驗(yàn)表明，黃酮類(lèi)化合物具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗心律失常、抗心肌缺血、降壓等作用［7］，療效顯著。本試驗(yàn)首次采用系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)法對(duì)把天門(mén)的化學(xué)成分進(jìn)行較全面的研究，建立其總黃酮含量測(cè)定的方法，為其活性成分的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

把天門(mén)藥材于2018 年4 月至2019 年8 月采自廣西壯族自治區(qū)不同市縣，共10 批，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為豆科胡枝子屬植物美麗胡枝子的根，標(biāo)本存于廣西壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，樣品信息見(jiàn)表1。蘆丁對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-201811；95%乙醇、石油醚（60～90 ℃）、氯仿、醋酐、氨水、鹽酸、濃硫酸、氫氧化鉀、氫氧化鈉、碘化鉍鉀、α-萘酚、茚三酮、三氯化鐵、鎂粉、磷鉬酸、冰乙酸等均為分析純，水為去離子水，其余試劑自制。

1.2 儀器

HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；BP211D 型電子分析天平，德國(guó)賽多利斯公司；ZF-20C 型暗箱三用紫外分析儀，上海精密儀器儀表有限公司；RS-232 精密電子天平，丹納赫西特傳感工業(yè)控制天津有限公司；UV-2600 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津儀器蘇州有限公司。

表1 把天門(mén)樣品信息

1.3 方法

1.3.1 化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)

1）水供試液的制備。取把天門(mén)藥材粉末10 g，置于250 mL 錐形瓶中，加去離子水100 mL，室溫浸泡24 h，過(guò)濾出約20 mL 濾液檢測(cè)氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)。將剩余的冷水浸泡液連同殘?jiān)糜?0 ℃左右水浴加熱30 min，趁熱過(guò)濾，濾液檢測(cè)糖、多糖、有機(jī)酸、皂苷、苷類(lèi)、酚類(lèi)、鞣質(zhì)［8］。

2）乙醇供試液、酸水供試液的制備。稱(chēng)取把天門(mén)藥材粉末10 g，置于250 mL 錐形瓶中，加95%乙醇100 mL，水浴加熱回流1 h，稍冷后加入去離子水使其含醇量為70%。冷卻至室溫，過(guò)濾，濾液分成2份，一份濾液濃縮成膏狀，加5%鹽酸5 mL 使溶解，過(guò)濾，酸水溶液用于生物堿的定性檢測(cè)。另一份濾液用于黃酮、酚類(lèi)、蒽醌、內(nèi)酯、香豆素、強(qiáng)心苷、萜類(lèi)、甾體、有機(jī)酸、酚類(lèi)等化合物的定性檢測(cè)［8］。

3）石油醚供試液的制備。取把天門(mén)藥材粉末1 g，置于50 mL 錐形瓶中，加石油醚（60～90 ℃）10 mL，室溫浸泡3 h，過(guò)濾，濾液用于油脂、揮發(fā)油檢測(cè)［8］。

1.3.2 總黃酮含量測(cè)定

1）對(duì)照品溶液的制備。精密稱(chēng)取120 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10 mg，置于50 mL 容量瓶中，加70%乙醇定容，搖勻，即得濃度為0.200 mg/mL 的蘆丁對(duì)照品溶液。

2）供試品溶液的制備。取把天門(mén)藥材粉末約0.5 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，稱(chēng)重，回流提取60 min，冷卻至室溫，稱(chēng)重，用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失的重量，過(guò)濾，濾液即為供試品溶液。

3）測(cè)定方法。精密移取供試品溶液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，加1%三氯化鋁溶液1 mL，加去離子水定容，搖勻，放置20 min，以相應(yīng)溶劑為空白，于波長(zhǎng)275 nm 處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)性試驗(yàn)

2.1.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液（0.200 mg/mL）0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，按確定的顯色條件顯色，以相應(yīng)溶劑為對(duì)照，于275 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品溶液的吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。計(jì)算得到回歸方程為Y=35.142 2X+0.040 645 3，r=0.999 6，表明蘆丁在 0.004～0.040 mg/mL 呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.1.2 精密度試驗(yàn) 精密量取供試品溶液（BTM-2）1 mL，置于100 mL 容量瓶中，按確定的測(cè)定方法測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定6 次，記錄供試品溶液的吸光度，RSD為0.06%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液（BTM-2）1 mL，置于100 mL 容量瓶中，按確定的測(cè)定方法每隔10 min 進(jìn)行1 次吸光度測(cè)定，記錄120 min 內(nèi)供試品溶液的吸光度，RSD為1.06%，表明供試品溶液在120 min 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（BTM-2）藥材粉末0.5 g，平行6份，制備供試品溶液，分別取供試品溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，按確定的測(cè)定方法測(cè)定吸光度，記錄供試品溶液的吸光度，計(jì)算把天門(mén)總黃酮的含量，RSD為0.15%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的藥材（BTM-2）粉末6 份，各0.25 g，分別加入蘆丁對(duì)照品15.965 0 mg，制備供試品溶液。移取供試品溶液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，按確定的測(cè)定方法測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果平均加樣回收率為95.29%，RSD為0.65%（表2）。

2.2 化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)

水提取液檢測(cè)結(jié)果顯示，把天門(mén)含有糖、多糖、苷類(lèi)、有機(jī)酸、酚類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)，可能含有皂苷，不含氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)（表3）。乙醇提取液檢測(cè)結(jié)果表明，把天門(mén)含有有機(jī)酸、酚類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)，可能含有強(qiáng)心苷，不含生物堿、植物甾醇、三萜類(lèi)、內(nèi)酯、香豆素（表4）。石油醚提取液檢測(cè)結(jié)果顯示，把天門(mén)不含揮發(fā)油及油脂類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.3 總黃酮含量測(cè)定

取10 批次把天門(mén)藥材樣品，制備供試品溶液，按確定的方法測(cè)定供試品溶液的吸光度，計(jì)算把天門(mén)總黃酮的含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

3 小結(jié)與討論

化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)表明，本品可能含有黃酮、糖、多糖、苷類(lèi)、有機(jī)酸、酚類(lèi)、鞣質(zhì)、蒽醌等成分類(lèi)型。總黃酮含量測(cè)定試驗(yàn)中比較了直接測(cè)定法［9］、硝酸鋁比色法和三氯化鋁比色法3 種方法。結(jié)果表明，硝酸鋁比色法中，供試品溶液加入4%氫氧化鈉溶液立即出現(xiàn)絮狀沉淀，與胡文波等［10］研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象相同，且對(duì)照品和供試品溶液的最大吸收波長(zhǎng)相差甚遠(yuǎn)；三氯化鋁比色法測(cè)定時(shí)，溶液澄清且穩(wěn)定性好，供試品溶液與蘆丁對(duì)照品溶液在275 nm 左右有最大吸收，故選擇三氯化鋁比色法為總黃酮含量測(cè)定的顯色方法?？疾炝巳然X顯色劑的濃度、用量、顯色時(shí)間等因素，最終確定顯色方法為1%AlCl3乙醇溶液1 mL，加水定容，搖勻，放置20 min；通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)確定最佳的提取工藝為取把天門(mén)樣品0.5 g，加70%乙醇20 mL，提取60 min。結(jié)果表明，蘆丁對(duì)照品溶液濃度在0.004～0.040 mg/mL呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為Y=35.142 2X+0.040 645 3（r=0.999 6），10 批把天門(mén)藥材中總黃酮含量在31.84～75.85 mg/g。試驗(yàn)確定了瑤藥材把天門(mén)含有的化學(xué)成分，為進(jìn)一步研究其活性成分及開(kāi)發(fā)利用提供了依據(jù)。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表3 水提取液預(yù)試結(jié)果

表4 乙醇提取液預(yù)試結(jié)果

表5 石油醚提取液預(yù)試結(jié)果

表6 10 批次把天門(mén)藥材總黃酮含量測(cè)定結(jié)果（X±SD，n=3）