中藥一匹綢總黃酮提取工藝及其含量測(cè)定研究

劉 睿，馬秀梅 ，周金艮 ，馬家寶 ，韋麗富 ，陳圣斌 ，趙鳳仙，陳宏夏

（1.南寧市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530200；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023；4.廣西壯瑤藥技術(shù)研究中心，南寧 530200）

中藥一匹綢屬旋花科，是植物白鶴藤（Argyreia acetaLour.）的莖葉［1，2］，又叫白背絲綢、白牡丹等，具有散癖止血、止咳化痰、消痛解毒、祛風(fēng)除濕等多種療效。中藥一匹綢可用于醫(yī)治風(fēng)濕疼痛、慢性氣管炎、乳痛等疾?。?，2］。一匹綢主要分布于廣西、廣東、湖南、云南等地區(qū)，在臨床上常用做解毒藥［3，4］。黃酮類化合物是廣譜生物活性物質(zhì)，普遍存在于植物中，具有抗癌、防癌、抑菌、抗病毒、降低膽固醇等藥理作用與生物活性，對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)［5］和免疫系統(tǒng)等有很好的保護(hù)作用［6-9］。

試驗(yàn)以中藥一匹綢總黃酮含量為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)考察了提取方法、提取溶劑、提取體積、提取時(shí)間等因素對(duì)提取一匹綢藥材總黃酮含量的影響，再采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)選最佳提取工藝，為進(jìn)一步研究一匹綢藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)一匹綢藥材總黃酮含量測(cè)定的相關(guān)研究基本屬于空白，為保證其藥材質(zhì)量及臨床療效，試驗(yàn)建立一匹綢總黃酮的含量測(cè)定方法，為后期開發(fā)、利用其藥用資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

XS105D 型十萬(wàn)分之一天平，梅特勒-托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司；UV1780 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津公司；KQ5200B 型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；優(yōu)普ULUPURE 實(shí)驗(yàn)室超純水儀，上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司；DFT-1000 型高速萬(wàn)能打粉機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司。

1.2 試藥

蘆丁（批號(hào)：185126），純度>98%，購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試驗(yàn)所用試劑均為分析純。藥材采摘于廣西玉林市，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)教授鑒定為一匹綢為旋花科銀背藤屬植物白鶴藤的全草，經(jīng)55 ℃烘干，備用。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥恒重的蘆丁對(duì)照品適量，加70%甲醇溶解，定容至25 mL 容量瓶中，搖勻，制成濃度為0.45 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

1.3.2 供試品溶液制備 精密稱取一匹綢藥材粉末1.0 g，置錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇25 mL，稱定重量，回流提取1.0 h，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液2.0 mL，置50 mL 容量瓶中，依據(jù)總黃酮的測(cè)定方法測(cè)定其吸光度，用線性方程求出樣品溶液中總黃酮的含量（mg/g），即得一匹綢藥材總黃酮。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 采用單因素試驗(yàn)考察了提取方法、溶劑體積分?jǐn)?shù)、溶劑體積、提取時(shí)間等因素對(duì)一匹綢藥材總黃酮提取率的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 從中藥一匹綢中提取藥材總黃酮的方法主要有有機(jī)溶劑提取法。根據(jù)查閱的相關(guān)文獻(xiàn)，試驗(yàn)最終采取不同甲醇體積分?jǐn)?shù)為溶劑的提取方法，根據(jù)單因素考察結(jié)果分析，設(shè)置甲醇體積分?jǐn)?shù)（60%、70%、80%）、料液比（1∶30、1∶40、1∶50）、提取時(shí)間（1.0、1.5、2.0 h）［10-16］。根據(jù)正交設(shè)計(jì)助手軟件，選用L（934）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

精密量取上述對(duì)照品溶液3 mL 于25 mL 容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，靜置6 min 加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，再加4%氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置12 min，以相應(yīng)試劑作空白，在400～800 nm 測(cè)定吸收光譜，其最大吸收波長(zhǎng)為512 nm（圖1）。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

圖1 蘆丁對(duì)照品吸收光譜

2.2 線性方程的制定

分別取“1.3.1”對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL 于25 mL 容量瓶中，加5%亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min后，加10%硝酸鋁0.4 mL，放置6 min，再加4%的氫氧化鈉4 mL，加水至刻度，搖勻，放置10 min，然后在 512 nm 測(cè)定［10］。以吸光度對(duì)濃度做線性方程，方程為y=13.045x-0.039 2，R2=0.999 2，在0.009～0.072 mg/mL 與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取一匹綢藥材粉末約1.0 g，按“1.3.2”操作制備供試品，于 512 nm 波長(zhǎng)處連續(xù)6 次測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD為1.21%，小于3%，表明該方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取一匹綢藥材粉末約1.0 g，按“1.3.2”操作制備供試品，于512 nm 波長(zhǎng)處分別在0、10、20、30、40、50、60 min測(cè)定吸光度，RSD值為2.75%，小于3%，表明吸光度在60 min 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取壯藥一匹綢藥材粉末樣品6 份，每份約1.0 g，按“1.3.2”操作制備供試品，于512 nm 波長(zhǎng)處平行測(cè)定其吸光度，計(jì)算一匹綢藥材總黃酮的平均含量為24.85 mg/g；RSD值為2.79%，小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批次已知總黃酮含量的一匹綢藥材粉末（含量為24.85 mg/g）0.5 g，精密稱定，共9 份，分成3 組，即低、中、高加樣組（0.5 g 藥材總黃酮含量的80%、100%和120%加樣，精密加入蘆丁對(duì)照品，加樣量分別為9.94、12.43、14.91 mg），按“1.3.2”操作制備供試品，于512 nm 波長(zhǎng)處平行測(cè)定其吸光度，計(jì)算總黃酮的含量。由表2 可知，一匹綢低、中、高加樣組的總黃酮平均回收率分別為98.90%、100.07%、101.02%，RSD值分別為 2.12%、2.74%、2.51%（n=3），表明該方法準(zhǔn)確性良好。

表2 加樣回收率試驗(yàn)（n=3）

2.4 單因素考察試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 提取方法考察 取一匹綢藥材粉末約1.0 g，置錐形瓶中，提取時(shí)間1 h、提取體積25 mL、70%甲醇提取，分別采用浸漬法、超聲提取法和回流提取法對(duì)藥材進(jìn)行總黃酮提取，按“1.3.2”操作制備供試品。由圖2 可知，回流提取法的提取率最高。

圖2 提取方法對(duì)總黃酮提取率的影響

2.4.2 甲醇體積分?jǐn)?shù)考察 取藥材粉末約1.0 g，置錐形瓶中，以提取時(shí)間1 h、25 mL 不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇溶劑為提取條件，采用回流提取法，做單因素試驗(yàn)，甲醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、60%、70%、80%和100%，按“1.3.2”操作制備供試品。由圖3 可知，70%甲醇回流提取總黃酮提取率最高。

圖3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影

2.4.3 提取時(shí)間考察 取藥材粉末約1.0 g，置錐形瓶中，以70%甲醇25 mL 為提取條件，采用回流提取法，以提取時(shí)間對(duì)藥材總黃酮提取率做單因素試驗(yàn)，提取時(shí)間分別為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，按“1.3.2”操作制備供試品。由圖4 可知，提取時(shí)間為1.5 h 提取率最高。

圖4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

2.4.4 溶劑體積考察 取藥材粉末約1.0 g，置錐形瓶中，以提取時(shí)間1 h、70%甲醇為提取條件，采用回流提取法，以不同體積70%甲醇對(duì)藥材總黃酮提取率做單因素試驗(yàn)，70%甲醇提取體積為分別20、30、40、50、60、70 mL，按“1.3.2”操作制備供試品。由圖5 可知，溶劑體積為50 mL 時(shí)提取率最高。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交設(shè)計(jì)助手軟件，正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果見(jiàn)表3、表4。由表3、表4 可知，甲醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)一匹綢總黃酮的提取有顯著影響，而提取時(shí)間對(duì)一匹綢總黃酮的提取無(wú)顯著性影響；方差分析表明，甲醇體積分?jǐn)?shù)和料液比兩個(gè)因素都具有顯著差異，而提取時(shí)間無(wú)顯著差異，且各影響因素的強(qiáng)弱為料液比（B）>甲醇體積分?jǐn)?shù)（A）>提取時(shí)間（C），所以對(duì)一匹綢提取效果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素是甲醇體積分?jǐn)?shù)和料液比，考慮試驗(yàn)效率、試驗(yàn)時(shí)間以及成本，選擇提取時(shí)間為1.0 h，因此最理想的提取方案是A2B2C1，即甲醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比是1∶40，回流提取時(shí)間是1.0 h。

圖5 溶劑體積對(duì)總黃酮提取率的影響

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)方差分析

2.6 樣品含量測(cè)定

精密稱取一匹綢藥材粉末3 份，每份約1.0 g，置錐形瓶中，按“1.3.2”操作制備供試品，按正交試驗(yàn)最佳提取方案測(cè)定總黃酮的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 一匹綢藥材總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

試驗(yàn)以一匹綢藥材為研究對(duì)象，考察了甲醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑提取體積和提取時(shí)間3 個(gè)影響因素，一匹綢總黃酮的提取采用回流提取法，利用正交試驗(yàn)來(lái)優(yōu)選一匹綢總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)果表明，藥材一匹綢的最佳提取工藝為回流提取，70%甲醇，料液比1∶40，提取 1.0 h 效果最佳。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)，建立了一匹綢總黃酮提取的工藝優(yōu)化。方差分析具有顯著性，各因子對(duì)總黃酮提取率影響依次為料液比>甲醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間。