基于植物皂素提取液為發(fā)酵基質(zhì)的酶表達及洗滌性能研究

劉玉婷，張瑜婷，藍素桂，陳鈺泉，李 麗，譚 強

（廣西中醫(yī)藥大學藥學院，南寧 530001）

皂素是一種高分子量糖苷，由與三萜苷或甾體苷元相連的糖基部分組成［1］。它們廣泛分布在植物特別是一些草本植物或植物種子中，包括無患子、艾葉、皂莢、油茶子等［2-4］。皂素是天然的非離子表面活性劑，具有較好的洗滌性能，在水中能產(chǎn)生穩(wěn)定、細膩豐富的泡沫［1］。皂素與人工合成的化學表面活性劑相比，具有來源廣泛、生物降解性好、天然且低毒等優(yōu)點，因此被廣泛用于化妝品和洗滌劑等行業(yè)［5］。

許多酶試劑包括脂肪酶（E.C.3.1.1.3）、蛋白酶（E.C.3.4.21.14）和果膠酶（E.C.3.2.1.15）等被添加到化妝品和洗滌劑產(chǎn)品中，用于提高去污力和改善洗滌性能［6，7］。脂肪酶能催化三酰基甘油中羧基酯鍵裂解，隨后釋放脂肪酸和甘油，用于水解油脂，在洗滌劑行業(yè)有巨大的市場［8］。目前脂肪酶生產(chǎn)主要為微生物發(fā)酵法，芽孢桿菌（Bacillussp.）是脂肪酶主要的產(chǎn)生菌［9］。蛋白酶又稱肽酶，是作用于蛋白質(zhì)的肽鍵，將其水解成多肽和氨基酸，存在于所有的生物體內(nèi)［10］。蛋白酶應用廣泛，是國內(nèi)銷量巨大的酶制劑［11］。蛋白酶生產(chǎn)也主要為微生物發(fā)酵法，產(chǎn)生菌主要為芽孢桿菌［12］。果膠酶作為果膠類物質(zhì)的水解酶，廣泛存在于高等植物和各種微生物中，其中微生物中歐文氏桿菌（Erwiniasp.）、芽孢桿菌、假單胞桿菌（Pseudomonassp.）、曲霉屬（Aspergillussp.）和灰霉菌屬（Botrytissp.）等都能表達果膠酶［13-15］。果膠酶應用于皮革、絲綢等行業(yè)，在食品、飼料，特別是醫(yī)藥領域植物藥的提取和洗滌等方面［16］。脂肪酶、蛋白酶和果膠酶等已是化妝品與洗滌劑產(chǎn)品的重要成分［17］，尤其是脂肪酶的去污作用最強，很多的洗滌劑產(chǎn)品通常選擇添加脂肪酶。

試驗以高濃度的植物皂素提取液為發(fā)酵基質(zhì)，優(yōu)化枯草芽孢桿菌CICC 23083 和地衣芽孢桿菌CICC 21085 發(fā)酵表達脂肪酶、蛋白酶和果膠酶，提高植物皂素液的去污力與洗滌效果，開發(fā)一款可降解、溫和的富酶天然表面活性劑，為制備天然可降解的化妝品與洗滌劑產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 CICC 23083 購于商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司，CICC 21085 購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 供試藥劑及其他化合物 橄欖油購于麥克林公司；聚乙烯醇（AR）、酚酞購于成都市科龍化工試劑廠；三氯乙酸、磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫二鈉、氫氧化鈉（AR）購于天津市大茂化學試劑廠；福林酚、酪蛋白、DNS 試劑、果膠購于索萊寶生物科技有限公司；蛋白胨（AR）、95%乙醇（AR）、瓊脂粉購于國藥集團化學試劑有限公司；牛肉膏購于北京奧博里生物技術有限責任公司；茶皂素粉購于陜西承乾生物科技有限公司。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 蛋白胨5.0 g/L，牛肉浸出物3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，調(diào)pH 7.0，固體培養(yǎng)基另加20 g/L瓊脂粉。

1.1.4 儀器 立式蒸汽壓力滅菌柜（YXQ-LS-50SII），上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；恒溫培養(yǎng)箱（LRH-250-S），韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4），國華電器有限公司；紫外分光光度計（759S），上海儀電分析儀器有限公司；超凈平臺（VS-840K-U），蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；分析天平（BSA224S），賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；恒溫定時攪拌器（JB-3），上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司；羅氏泡沫儀（2151），金壇區(qū)白塔安瑞實驗儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵基質(zhì)的準備 植物皂素提取液的制備參照文獻［18］。在所獲提取液中加入50%茶皂素（皂素濃度為0.48 g/g）攪拌溶解后，調(diào)pH 為7，經(jīng)高壓滅菌鍋121 ℃滅菌15 min 后，放冷即為發(fā)酵基質(zhì)。

1.2.2 粗酶液的制備 取50 mL 發(fā)酵基質(zhì)至250 mL三角瓶，接種5%菌液，在37 ℃，180 r/min 振蕩發(fā)酵培養(yǎng)48 h。每隔8 h 取發(fā)酵樣液，在4 000 r/min 下離心10 min，取上清液，為粗酶液。

1.2.3 酶活力測定 脂肪酶活力測定方法參照國標GB/T 23535-2009；蛋白酶活力測定方法參照國標GB/T 23527-2009；果膠酶活力測定方法參照文獻［18］。

1.2.4 去污力測定 去污機由勻速攪拌機和恒溫器組成，人工污垢配置方法、去污力測定方法參照國標GB 9985-2009。將去污機接通電源，設置速度為200 r/min，洗滌3 min，溫度設為30 ℃。洗滌液由300 mL 自來水和適量發(fā)酵液混勻而成。將潔凈的載玻片（稱重為m0）均勻地鋪上人工污垢，自然晾干（稱重為m1）。將已知涂污量的載玻片夾在勻速攪拌機上，泡入洗滌液中浸泡1 min 后，開啟攪拌機洗滌3 min 后，迅速取出洗后的污片，掛晾3 h 后稱重，為m2。污片重量的損失用以評價發(fā)酵液的洗滌性能，分別做3 次平行試驗取平均值。去污力計算公式：Y=（m1-m2）（/m1-m0）×100%。

1.2.5 泡沫高度測定 泡沫高度測定方法參照文獻［19］。

2 結果與分析

2.1 單菌株發(fā)酵表達脂肪酶

在前期試驗中，氮源影響（包括酵母膏、蛋白胨和硫酸銨等）的優(yōu)化試驗結果表明，添加3%酵母膏至發(fā)酵基質(zhì)中，對CICC 21085 表達脂肪酶有顯著的提高作用，最大酶活力到達166.7 U/mL。碳源（蔗糖、葡萄糖、麥芽糖）對脂肪酶表達的影響研究結果表明，蔗糖為最佳碳源。當?shù)孜镏刑砑诱崽菨舛葹?%，CICC 21085 發(fā)酵表達脂肪酶在16 h 獲得最高酶活力，為116.7 U/mL。關于發(fā)酵液去污力的對比試驗發(fā)現(xiàn)，脂肪酶對去污力的影響顯著大于蛋白酶與果膠酶的混合液?；谇捌谘芯拷Y果，本研究進一步對CICC 23083 單菌株發(fā)酵表達蛋白酶與果膠酶，以及CICC 23083 和CICC 21085 雙菌株混合發(fā)酵表達蛋白酶、果膠酶和脂肪酶的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。

2.2 單菌株發(fā)酵表達蛋白酶與果膠酶

2.2.1 酵母膏的影響 在基質(zhì)中分別加入1%、3%、5%和7%的酵母膏，每8 h 取樣測定蛋白酶和果膠酶活力，結果如圖1A 所示。在發(fā)酵32 h 內(nèi)，蛋白酶活力不斷增加，酶活力峰值出現(xiàn)在32 h。當酵母膏添加量為3%，蛋白酶活力有最好的表達，在32 h 獲得最大酶活力，為792.6 U/mL。為未添加酵母膏直接發(fā)酵最大酶活力（216.8 U/mL）的3.7 倍。當酵母膏濃度進一步增加時，最高蛋白酶活力沒有明顯增加。果膠酶活力同樣在32 h達到峰值（圖1B）。當酵母膏濃度為3%時，最大果膠酶活力為4 352.9 U/mL，約是未添加酵母膏直接發(fā)酵最大酶活力（2 140.8 U/mL）的2.0 倍。根據(jù)結果推測，在高濃度皂素提取液中添加3%酵母膏即可為枯草芽孢桿菌提供足夠的氮源，滿足該菌生長所需的營養(yǎng)，又可促進蛋白酶和果膠酶的表達。

2.2.2 蔗糖的影響 分別往基質(zhì)中加入3%、5%、7%和9%的蔗糖用于CICC 23083 發(fā)酵表達蛋白酶和果膠酶，每8 h 取樣測定酶活力。從圖2 可以看出，添加5%蔗糖時，蛋白酶活力和果膠酶活力分別在32 h 和16 h 達到最大值237.3 U/mL 和2 283.5 U/mL，分別約為未添加蔗糖直接發(fā)酵所獲最大酶活力（分別為 216.8 U/mL 和 2 140.8 U/mL）的 1.1 倍。隨著蔗糖添加量進一步提高至7%～9%，蛋白酶和果膠酶活力提高不明顯。

根據(jù)結果分析，對于單菌株CICC 23083 發(fā)酵表達蛋白酶與果膠酶，3%酵母膏的促進作用要遠大于5%蔗糖添加量。根據(jù)結果推測，高濃度植物皂素提取液可提供充足碳源為CICC 23083 表達雙酶，但額外添加少量外援氮源（3%酵母膏）可顯著促進該菌株表達雙酶。

圖1 酵母膏量對蛋白酶和果膠酶表達的影響

圖2 蔗糖量對蛋白酶和果膠酶表達的影響

2.3 雙菌株混合發(fā)酵

圖3 酵母膏量對雙菌株混合發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.3.1 酵母膏的影響 在發(fā)酵基質(zhì)分別加入3%、5%、7%、9%和11%的酵母膏用于CICC 21085 和CICC 23083 混合發(fā)酵，每8 h 取樣測定3 種酶活力。從圖3A 可以看出，脂肪酶活力峰值均在16 h 出現(xiàn)。當添加3%的酵母膏可獲得最大脂肪酶活力，為166.7 U/mL，與CICC 21085 單菌株發(fā)酵表達脂肪酶所獲最大酶活力相同，說明3%酵母膏添加量對雙菌株混合發(fā)酵中的脂肪酶表達影響不明顯。然而添加3%酵母膏發(fā)酵，蛋白酶活力在8 h 達到峰值（245.8 U/mL）（圖3B），當酵母膏添加量大于3%時，蛋白酶活力均在發(fā)酵24 h 達到酶峰點，最大值為347.9 U/mL。關于果膠酶的表達（圖3C），當發(fā)酵基質(zhì)中添加5%酵母膏時，酶活力在8 h 達到最大值4 745.4 U/mL。添加酵母膏進行雙菌株混合發(fā)酵，蛋白酶和果膠酶達到最大酶活力的時間縮短了8～24 h，但兩種酶最大酶活力分別比CICC 23083 單菌株發(fā)酵所獲最大酶活力降低了56.1%和提高了9.0%。根據(jù)結果推測，雙菌株混合發(fā)酵表達三酶時，添加酵母膏對脂肪酶的表達（CICC 21085 發(fā)酵）沒有明顯影響，但對蛋白酶和果膠酶的表達量與表達時間（CICC 23083 發(fā)酵）都有顯著影響?？紤]到脂肪酶對去污效果影響最大，添加3%酵母膏進行的雙菌株發(fā)酵能獲得最大的脂肪酶活力，因此選擇3%酵母膏作為雙菌株發(fā)酵的最佳添加量。

2.3.2 蔗糖的影響 在基質(zhì)添加3%酵母膏基礎上，再分別加入1%、3%、5%和7%的蔗糖進行雙菌株混合發(fā)酵，每8 h 取樣測定脂肪酶、蛋白酶和果膠酶活力。如圖4所示，添加7%的蔗糖作為底物發(fā)酵時，脂肪酶和蛋白酶分別在24 h 和32 h 獲得最大酶活力，為133.3 U/mL 和327.4 U/mL。果膠酶也在發(fā)酵24 h達到活力峰值（圖4C）。當蔗糖添加量為5%時，果膠酶獲得最大酶活力為3 817.7 U/mL；而當蔗糖添加量為7%時，果膠酶活力最大值降低至3 318.2 U/mL。根據(jù)結果對比分析發(fā)現(xiàn)，與基質(zhì)中添加3%酵母膏（基質(zhì)+3%酵母膏）的發(fā)酵相比，基質(zhì)添加3%酵母膏和7%蔗糖（基質(zhì)+3%酵母膏+7%蔗糖）的發(fā)酵所獲最大脂肪酶活力和果膠酶活力分別降低了20.0%和22.5%，而蛋白酶最大活力提高33.2%。

考慮到脂肪酶對產(chǎn)品去污力的影響作用要大于蛋白酶與果膠酶，因此，雙菌株發(fā)酵表達三酶的最佳發(fā)酵條件為添加3%酵母膏，不需要進一步添加任何碳源。

2.4 洗滌效果比較

如圖5 所示，枯草芽孢桿菌CICC 23083 和地衣芽孢桿菌CICC 21085 單菌株發(fā)酵液的相對去污力分別為84.8%和88.9%，比未發(fā)酵提取液的去污力（77.4%）分別提高了7.4 和11.5 個百分點。雙菌株混合發(fā)酵液去污力最高視為100%，比未發(fā)酵皂素提取液去污力提高22.6 個百分點，比單菌株發(fā)酵液去污力分別提高11.1、15.2 個百分點。根據(jù)結果分析，酶對植物皂素提取液去污力的提升效果大小排序為脂肪酶+蛋白酶+果膠酶>脂肪酶>蛋白酶+果膠酶。研究結果表明，植物皂素提取液作為基質(zhì)，通過添加3%的酵母膏進行雙菌株混合發(fā)酵表達脂肪酶、蛋白酶和果膠酶，即可顯著提升去污力。

圖4 蔗糖量對雙菌株混合發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.5 泡沫高度

泡沫高度是由液膜隔開和并列的氣泡形成的氣泡群，是衡量表面活性劑質(zhì)量且必須考察的重要性能之一。根據(jù)國家標準GB/T 29679-2013 規(guī)定，透明與非透明型洗滌類產(chǎn)品的泡沫高度底限分別為100 和50 mm。本研究所獲高濃度皂素提取液（非透明）在發(fā)酵前后的泡沫高度基本沒有明顯變化，維持在（157±5）mm，是《化妝品安全技術規(guī)范》（2015 版）規(guī)定的非透明型產(chǎn)品泡沫高度底限的3 倍多，達到甚至略高于大部分市售透明型洗滌產(chǎn)品的起泡高度。經(jīng)發(fā)酵后的皂素提取液泡沫高度不受影響是因為皂素濃度在發(fā)酵過程中沒有變化。

圖5 發(fā)酵液洗滌效果對比

3 結論

本研究以高濃度的植物皂素提取液為底物，對CICC 23083 和CICC 21085 發(fā)酵表達脂肪酶、蛋白酶和果膠酶的工藝條件進行優(yōu)化，目的是為了提高皂素提取液的去污能力。結果表明，3%的酵母膏能顯著促進枯草芽孢桿菌CICC 23083 表達蛋白酶和果膠酶，達到的最高酶活力分別是無酵母膏直接發(fā)酵的3.7 倍和2.0 倍。蔗糖對單菌株CICC 21085 表達脂肪酶有明顯促進作用，但對單菌株CICC 23083 表達蛋白酶與果膠酶沒有明顯改善作用。利用雙菌株混合發(fā)酵時，添加3%酵母膏可獲得最大的脂肪酶活力（166.7 U/mL），但進一步添加7%蔗糖，最大脂肪酶活力和果膠酶活力分別降低20.0%和22.5%，而最大蛋白酶活力提高33.2%。

對發(fā)酵液的洗滌性能研究分析發(fā)現(xiàn)，雙菌株混合發(fā)酵液去污力比未發(fā)酵皂素提取液去污力提高22.6個百分點，比單菌株發(fā)酵液去污力分別提高11.1～15.2 個百分點。酶對植物皂素提取液去污力的提升效果排序脂肪酶+蛋白酶+果膠酶>脂肪酶>蛋白酶+果膠酶。植物皂素提取液（非透明）在發(fā)酵前后的泡沫高度基本沒有明顯變化，維持在（157±5）mm，是國標規(guī)定的非透明型產(chǎn)品泡沫高度底限的3 倍多。試驗為開發(fā)富酶的天然表面活性劑提供理論依據(jù)。