四種藥用植物內生真菌的分離及抗單胺氧化酶的活性研究

茍文博，楊中鐸，周格格

（蘭州理工大學生命科學與工程學院，蘭州 730050）

單胺氧化酶（Monoamine oxidase，MAO）是一種存在于線粒體外膜的氧化還原酶，通過催化內源性和外源性單胺類物質的代謝，使其失去生理活性，從而控制機體內胺類物質的水平，其抑制劑在臨床上可用于抑郁癥、帕金森癥、阿爾茨海默癥的治療，但是目前臨床上應用的單胺氧化酶均具有一定的副作用，因此，尋找新型的、副作用小的天然單胺氧化酶是十分必要的［1］。

內生真菌（Endophytic fungi）是指在生活史的某段時期生活于植物組織內部，對宿主沒有造成明顯病害癥狀的真菌。內生真菌在植物中普遍存在，其代謝產物具有結構新穎、活性好的特點，因此備受關注。內生真菌代謝產物已顯示出多種生物活性，可用在抗腫瘤、抗病毒、抗菌以及殺蟲等方面，在農業(yè)和（或）醫(yī)藥業(yè)中也具有重要的應用潛力。但截至目前，關于內生真菌抗單胺氧化酶活性篩選的研究報道還不多見。為了得到天然的單胺氧化酶抑制劑，本試驗對4 種植物內生真菌及其抗單胺氧化酶活性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 所用藥材有栓翅衛(wèi)矛（Euonymus phel?lomanus）、甘西鼠尾草（Salvia przewalskii）、刺五加（Acanthopanax senticosus）、黃 海 棠（Hypericum as?cyron）4 種新鮮藥用植物，采自甘肅省臨洮縣，由蘭州理工大學楊林副教授鑒定。

Wistar 大鼠購自蘭州大學實驗動物中心。

1.1.2 真菌培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基：新鮮馬鈴薯去皮200 g/L，葡萄糖25 g/L，去離子水1 L。固體培養(yǎng)基加 2% 瓊脂，培養(yǎng)基中加入150 μg/mL 青霉素鉀和120 μg/mL 硫酸鏈霉素用以防止細菌污染。

1.1.3 試劑與儀器 瓊脂粉（北京索萊寶科技有限公司）、葡萄糖（上海恒生化工有限公司）、乙醇（山東利爾康消毒科技有限公司）、HgCl（2北京化工廠）、注射用青霉素（華北制藥集團）、注射用硫酸鏈霉素（華北制藥集團）、電子分析天平（上海良平儀器儀表有限公司）、潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）、手提式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械有限公司）、數顯電熱培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司）、光學顯微鏡（Classica）。

1.2 待測樣品制備

1.2.1 內生真菌的分離和純化 取出要分離菌株的藥材剪成小段，然后用無菌水將其洗干凈，采用組織切塊法處理表面消毒好的藥材，放入培養(yǎng)基中進行組織培養(yǎng)。選出切口處新長出的菌絲于PDA 培養(yǎng)基上進行反復的劃線分離、純化，最后在斜面上保存。

1.2.2 發(fā)酵產物的制備 取菌絲接種于裝有400 mL PDA 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃、120 r/min 搖床培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液采用乙酸乙酯萃取，濃縮至干，獲得提取物浸膏。

1.3 單胺氧化酶活性測定

單胺氧化酶活性的測定參照文獻［2］，即采用酶標法測定酶活性。對于提取物，稱取2 mg，用50 μL的無水乙醇溶解，pH 7.6 的磷酸緩沖液稀釋，得濃度為1 mg/mL 的待測樣品，備用。對于單體化合物，配制成300 μg/mL 的待測樣品備用。根據下式計算抑制率：抑制率=［（空白組-空白本底）-（樣品-樣品本底）］/（空白組-空白本底）×100%。所用樣品做3 次平行測定，取其平均值，用磷酸異丙煙肼作陽性對照。

1.4 內生真菌的鑒定

首先采用形態(tài)學方法進行初步鑒定，觀察菌株的菌落顏色、質地、氣生菌絲生長情況、基質的顏色以及在光學顯微鏡下菌落產孢結構、分生孢子梗著生情況、孢子的形態(tài)與顏色，參照《真菌鑒定手冊》進行初步鑒定。然后用分子生物學的方法對真菌進行序列測定，其中菌株DNA 的提取、ITS 序列的PCR擴增、純化和測序工作由上海生物工程股份有限公司完成。將所得的ITS 序列與GenBank 中已知菌株的DNA 序列比對，確定真菌菌屬。

1.5 化學成分初步分離

將活化好的菌株SJ-2 在50 L 的發(fā)酵罐中用40 L PDB 液體培養(yǎng)基進行大批量發(fā)酵，室溫下連續(xù)培養(yǎng)20 d。培養(yǎng)結束后，菌液用等體積乙酸乙酯萃取2 次，合并萃取液，濃縮至干，得提取物浸膏15.2 g。浸膏用大孔樹脂柱層析，10%、30%、50%、70%、90%乙醇-水體系進行梯度洗脫，通過TLC 色譜法檢查合并樣品，最終得到了5 個粗組分SJ-2-A、SJ-2SB、SJ-2-C、SJ-2-D、SJ-2-E。

SJ-2-D 組分（3.58 g）干法上樣硅膠柱層析分離，用氯仿-甲醇體系（120∶1～10∶1）進行梯度洗脫，通過TLC 色譜法檢查合并樣品。得到9 個組分（SJ-2-D-1 至 SJ-2-D-9）。

SJ-2-D-2 組分（850 mg）干法上樣硅膠柱層析分離，石油醚-丙酮體系（80∶1～20∶1）梯度洗脫，通過TLC 色譜法檢查合并樣品，得到7 個組分（SJ-2-D-2-A 至 SJ-2-D-2-G）。其中，組分 SJ-2-D-2-C（180 mg）干法上樣硅膠柱層析分離，石油醚-丙酮體系（60∶1～20∶1）梯度洗脫，通過 TLC 色譜法檢查合并樣品，得到化合物 1（10 mg）。

SJ-2-D-3 組分（240 mg），用 4 mL 色譜甲醇溶解，HPLC 分離，77% 甲醇-水為流動相，流速為1.0 mL/min，得到化合物 2（tR=40.39 min，10 mg）。

SJ-2-D-4 組分（280 mg），用 4 mL 色譜甲醇溶解，HPLC 分離，58% 甲醇-水為流動相，流速為1.0 mL/min，得到化合物 3（tR=40.23 min，18 mg）。

2 結果與分析

2.1 不同藥用植物組織中內生真菌數量

經過分離純化后得到20 株內生真菌，其中從黃海棠中得到10 株內生真菌，從刺五加中得到2 株內生真菌，從甘西鼠尾草中得到6 株內生真菌，從栓翅衛(wèi)矛中得到2 株內生真菌，表明藥用植物組織中存在豐富的內生真菌資源。

2.2 內生真菌發(fā)酵物的單胺氧化酶抑制活性

通過酶標法測定了所有內生真菌提取物對單胺氧化酶的抑制活性，活性較高的3 種內生真菌提取物為栓翅衛(wèi)矛（SJ-2）、刺五加（WJ-3）、黃海棠（HJ-1）的PDB 液體培養(yǎng)基菌液提取物（表1）。對抑制率 70% 以上的提取物測定了其IC50，SJ-2、WJ-3、HJ-1 發(fā) 酵 提 取 物 的IC50分 別 為 126.64、118.56、221.34 μg/mL。

表1 內生真菌次級代謝產物提取物的抗單胺氧化酶活性

2.3 菌株的分子生物學鑒定

菌株SJ-2 氣生菌絲棉絮狀、茂盛、白色，菌落背面產生淡紅色色素，其ITS 序列與 GenBank 中的MK028863.1（Fusarium tricinctum）比 對 相似 度 為98%，因此將內生真菌SJ-2 鑒定為鐮孢屬（Fusarium）真菌。菌株WJ-3 菌絲有橫隔，分生孢子經多次分生產生幾輪對稱或不對稱小梗，其ITS 序列與Gen?Bank 中的 MK357511.1（Penicilliumsp.）比對相似度為97%，因此將內生真菌WJ-3 鑒定為青霉菌屬（Penicillium）真菌。菌株HJ-1 生長速度較快，菌落為白色、毯狀、全緣，基質棕色，將菌株HJ-1 的ITS序列與 GenBank 中的 MH329584.1（Alternaria alter?nata）比對，相似度為98%，因此將內生真菌HJ-1鑒定為鏈格孢屬（Alternaria）真菌。

2.4 單體化合物結構鑒定

通過硅膠柱色譜、高效液相色譜等方法從菌株SJ-2 的菌液提取物中分離得到了3 個純的單體化合物，并通過1H NMR、13C NMR 等波譜解析技術，參考文獻［3-5］，鑒定了其結構。

2.4.1 化合物1 白色粉末，紫外光波長254 nm 下有吸收，硫酸-乙醇不顯色。1H NMR（600 MHz，CD3OD）：δ5.14（3H，d，J=7.9 Hz），4.52（3H，d，J=9.4 Hz），3.12（9H，s），2.37～2.26（6H，m），1.06（9H，d，J=6.6 Hz），0.98（9H，d，J= 6.7 Hz），0.96（9H，d，J=6.8 Hz），0.90（9H，d，J=6.7 Hz）。13C NMR（50 MHz，CDCl3）：18.4（CH3），18.6（CH3），19.3（CH3），20.3（CH3），27.8（CH），29.8（CH），33.0（NCH3），62.9（CH），75.7（CH），169.3（C=O），170.2（C=O）。其1H-NMR、13C-NMR 數據與參考文獻［4］報道基本一致，因此該化合物被鑒定為Ennia?tin B。

2.4.2 化合物2 白色粉末，紫外光波長254 nm 下有吸收，硫酸-乙醇顯黃色。1H NMR（600 MHz，CDCl3）：δ6.61（1H，d，J=2.2Hz，H-4），7.02（1H，d，J=2.2Hz，H-6），3.69（6H，s，7-OCH3和 H-8），6.45（1H，s，H-3’），6.06（1H，s，H-5），2.29（3H，s，H-7），3.37（3H，s，H-9），12.99（1H，s，2-OH）。其1H-NMR 數據與參考文獻［5］報道一致，因此該化合物被鑒定為Monomethylsulochrin。

2.4.3 化合物3 白色粉末，紫外光波長254 nm 下有吸收，硫酸-乙醇顯黃色。1H NMR（600 MHz，CDCl3）：δ7.70（1H，brs，H-1），7.42（1H，d，J=8.2 Hz，H-16），6.85（1H，d，J=2.3 H z，H-19），6.80（1H，dd，J=8.2，2.3 Hz，H-17），5.97（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），4.90（1H，d，J=9.5 Hz，H-21），4.17（1H，dd，J=11.0 Hz，5.0 Hz，H-12），4.10（1H，dd，J=9.5、7.5 Hz，H-6），3.82（3H，s，H-25）3.64（2H，m，H-9），3.50（1H，dd，J=15.8、5.0 Hz，H-13a），3.09（1H，dd，J=15.8、11.0 Hz，H-13b），2.40（1H，m，H-7a），2.22（1H，m，H-7b），2.05（1H，m，H-8a），1.92（1H，m，H-8b），1.99（3H，s，H-24），1.64（3H，s，H-23）。其1H-NMR 數據與參考文獻［6］報道一致，因此該化合物被鑒定為Fumitremorgin C。

3 討論

在試驗中分離內生菌所用的植物都是新鮮植物，試驗前用純凈水清洗 4～5 次，然后用75% 乙醇和1% 的升汞表面消毒，最后用無菌水洗滌，洗滌后的無菌水進行涂板培養(yǎng)，結果無雜菌長出，證明消毒比較徹底［6］。

目前，人們對植物內生真菌活性的研究主要集中在抗菌、抗腫瘤方面。如李冬利等［7］在藥用植物白木香（Aquilaria sineusis）中分離得到19 株內生真菌，用MTT 法測定它們的提取物對人神經膠質瘤細胞SF-268 的細胞毒活性，結果表明，其中抑制率90% 以上的菌株有 6 株。Jouda 等［8］在藤黃（Garcin?ia nobilis）的葉中分離得到一株青霉屬真菌，它的次級代謝產物對枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌表現出較強的抑制活性。但截至目前，關于內生真菌提取物的抗MAO 活性的報道較少。本試驗對分離自4 種藥用植物的20 株內生真菌的發(fā)酵產物的抗單胺氧化酶活性進行了研究，篩選出3 種具有活性的菌株。通過分子生物學方法鑒定它們?yōu)殓犳邔?、青霉菌屬和鏈格孢屬真菌。鐮孢屬為絲孢綱瘤座菌目真菌，該屬真菌具有抗菌等活性［9］。青霉菌屬為子囊菌亞門不整囊菌綱散囊菌目散囊菌科真菌，該屬真菌能代謝出多種抗腫瘤、抗菌等活性的化合物［10］。鏈格孢屬是全球分布最廣的半知菌類真菌之一，是一種有應用潛力的生物資源，該屬真菌能代謝出具有抗腫瘤、抗菌活性的化合物［11，12］。截至目前，未見關于上述3 屬真菌抗單胺氧化酶活性的報道。本試驗進一步對篩選出的活性菌株 SJ-2（Fusarium tricinctum）的化學成分進行了初探，得到了3 個化合物，分別為 Enniatin B（化合物 1）、Monomethylsulo?chrin（化合物 2）、Fumitremorgin C（化合物 3）。據報道，Enniatin B 為一種細胞毒素，能夠誘導細胞凋亡，還能夠增加脂多糖（LPS）引發(fā)的細胞中白細胞介素-1β（IL-1β）的釋放［13］。張弘弛等［14］發(fā)現 Mono?methylsulochrin 具有抑制擬青霉屬（Penicilliopsis）、粉孢霉屬（Oidium）、曲霉屬（Aspergillus）、絲核菌屬（Rhizoctonia）等真菌的作用。Fumitremorgin C 是一種霉菌毒素，還是乳腺癌抗性蛋白（ABCG2/BCRP）的抑制劑，可逆轉與癌細胞相關的細胞耐藥性［15］。