基于高通量測(cè)序重茬草莓土壤細(xì)菌和真菌多樣性分析

肖蓉 張春芬 鄧舒

摘?要：研究利用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)，比較新茬草莓和連作3年草莓根際土壤細(xì)菌、真菌群落多樣性，旨在了解其微生物群落生態(tài)特征，為防治連作障礙奠定基礎(chǔ)。結(jié)果：重茬3年后土壤中細(xì)菌物種多樣性及豐富度降低;新茬土壤中豐度最高的鞘氨醇單胞菌被節(jié)桿菌屬取代，腸桿菌屬豐度顯著升高。對(duì)于真菌來講，重茬3年后土壤中真菌物種多樣性和豐富度增大;新茬土壤中含有植物病原菌鏈格孢菌和莖點(diǎn)霉菌，重茬3年后枝頂孢屬、被孢霉屬、鐮刀菌屬等病原菌大量積累。結(jié)論：重茬土壤中細(xì)菌多樣性降低、真菌多樣性增高，病原真菌積累是引起草莓連作障礙的主要原因。

關(guān)鍵詞：重茬;高通量測(cè)序;多樣性分析;草莓

文章編號(hào)：2096-8108（2021）01-0028-06?中圖分類號(hào)：S668.4?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract：In order to understand the ecological characteristics of rhizosphere soil microbial communities for strawberrys continuous obstacle controlling， the diversity of bacteria and fungi communities of newly cropped strawberry and continuously cropped strawberry for 3 years by high-throughput sequencing were compared. The results showed that the diversity and richness of bacterial in the soil decreased after continuous cropping. Sphingomonas with the highest abundance in new soil was replaced by Arthrobacter， and Enterobacter abundance increased significantly. For fungi， the diversity and richness increased after continuous cropping. There were Alternaria and Phoma in the new soil. But after 3 years of continuous cropping， a large number of other phytopathogens were accumulated such as Acremonium， Mortierella and Fusarium. In conclusion， the decrease of bacterial diversity， the increase of fungal diversity and the accumulation of pathogenic fungi in the soil were the main causes of strawberry continuous cropping obstacles.

Keywords：continuous cropping;high-throughput sequencing;diversity analysis;strawberry

生產(chǎn)中大棚草莓種植每年都要換新苗，因此重茬在所難免。連作障害是制約草莓發(fā)展的最大因素，據(jù)調(diào)查，連作4年草莓能減產(chǎn)40%以上[1]。目前，大家公認(rèn)的連作障害的形成機(jī)理主要包括連作土壤中病原微生物積累[2]、土壤營養(yǎng)元素失衡[3]、化感作用[4-6]3個(gè)方面。而土壤微生態(tài)失衡是研究者所公認(rèn)的連作障害發(fā)生的根本。其中微生物因素在整個(gè)連作障礙發(fā)生發(fā)展過程中一直扮演著關(guān)鍵角色。

在土壤這個(gè)黑匣子中到底有多少微生物，以及他們之間的結(jié)構(gòu)信息、群體相互作用、與植物重茬障礙之間的關(guān)系等等吸引著人們持續(xù)而深入的研究。由于目前土壤中可培養(yǎng)的微生物僅占土壤微生物總數(shù)的1%左右，因此依賴于平板培養(yǎng)技術(shù)來研究土壤微生物生態(tài)顯然是不夠的[7]。近些年來，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和基因組學(xué)的蓬勃發(fā)展，以土壤中全部微生物基因組DNA序列為依據(jù)的微生物分子生態(tài)學(xué)研究方法正日益成為大家普遍接受的方法[8]。

本研究以同一個(gè)農(nóng)業(yè)園區(qū)新茬草莓大棚和連作3年的重茬草莓大棚土壤為研究對(duì)象，直接提取草莓根際土壤總DNA，通過Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)新茬土壤及重茬土壤細(xì)菌和真菌結(jié)構(gòu)及功能多樣性進(jìn)行比較分析，旨在找到重茬土壤中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和真菌類群，從微生物生態(tài)學(xué)角度研究草莓重茬障害發(fā)作時(shí)的生物學(xué)病因，為草莓重茬障礙防治提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?供試土樣

土壤樣品采自山西省太原市陽曲縣同一個(gè)農(nóng)業(yè)園區(qū)新茬草莓大棚和連作3年的重茬草莓大棚，于6月草莓剛收獲結(jié)束后采樣。每個(gè)大棚內(nèi)按“S”形于大棚中間隨機(jī)挑選草莓植株4株，整株挖出置于冰盒中用無菌袋帶回實(shí)驗(yàn)室，抖掉根部多余的土后用無菌毛刷刷取根際土，4個(gè)土樣混合成1個(gè)樣置于無菌離心管中，新茬土壤樣品命名為XJS1，重茬土壤樣品命名為CJS1。各類型選取4座大棚為采樣地，共獲得XJS1和CJS1樣本各4個(gè)，視為4次重復(fù)。

1.2?土壤微生物總DNA提取及測(cè)序

土壤微生物總DNA提取方法參考本課題組前期方法[9]。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性后用Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，DNA合格樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司完成后續(xù)多樣性測(cè)序工作。細(xì)菌多樣性測(cè)序選取V3-V4區(qū)作為靶向擴(kuò)增區(qū)域，真菌多樣性測(cè)序選取ITS1-ITS2區(qū)作為靶向擴(kuò)增區(qū)域。

3?結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，重茬3年后土壤中細(xì)菌數(shù)量減少、真菌數(shù)量上升，這與前人的研究結(jié)果相似。甄文超等研究指出，連續(xù)種植草莓的農(nóng)田土壤微生態(tài)環(huán)境有利于真菌的增殖而不利于細(xì)菌和放線菌，草莓根際和根表微生物真菌種群數(shù)量上升、細(xì)菌和放線菌的增殖減少，最終導(dǎo)致連作障礙發(fā)生[10]。薛超指出重茬土壤微生物從細(xì)菌主導(dǎo)型向真菌主導(dǎo)型轉(zhuǎn)化[11]。

本研究結(jié)果表明，重茬3年后，新茬土壤中豐度最高的鞘氨醇單胞菌被節(jié)桿菌屬取代，腸桿菌屬豐度顯著升高。王志剛從植物根際獲得一株鞘氨醇單胞菌，能高效解磷和分泌IAA，促進(jìn)連作西瓜生長[12]。另外，很多文獻(xiàn)都指出鞘氨醇單胞菌和節(jié)桿菌與多環(huán)芳烴、苯酚、菲等芳香族污染物的降解有關(guān)[13-15]。而腸桿菌具有緩解鎘-砷富集對(duì)植物的脅迫[16]、降解植物的次生代謝產(chǎn)物縮合單寧（原花青素）[17]、降解除草劑阿特拉津的功能[18， 19]。因此，這可能暗示該園區(qū)土壤中有有機(jī)物污染。

本研究發(fā)現(xiàn)，重茬3年后的土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌與新茬土壤大相徑庭。原來在新茬土壤中占優(yōu)勢(shì)的真菌豐度值大幅下降，而新崛起的豐度值增高的真菌大多與植物病害發(fā)生相關(guān)。比如重茬土壤中占優(yōu)勢(shì)的絲核菌能引起多種植物（包括草莓）的黑根病、立枯病、葉腐病、莖腐等病害，是植物真菌病害防治的主要對(duì)象，也是草莓產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的病害之一[20];輪枝菌屬導(dǎo)致黃萎病[21];鐮刀菌屬可危害多種植物，破壞植物的維管束系統(tǒng)，引起植物萎蔫死亡和器官腐爛，是生產(chǎn)上防治最艱難的土傳病害之一，在草莓上可引起枯萎病[22]。另一類占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位的菌是營腐生生活的菌屬，比如青霉菌和接合菌，這類菌常生長在腐爛的蔬菜、水果、肉類和各種潮濕的有機(jī)物上。由此可以推測(cè)：重茬3年的草莓地土壤中積累了相當(dāng)數(shù)量的植物病原菌，殘枝敗葉的積累養(yǎng)育著一批腐生菌，土壤真菌環(huán)境不容樂觀。另外，值得注意的是，該園區(qū)新茬土壤中檢測(cè)到優(yōu)勢(shì)菌鏈格孢菌和莖點(diǎn)霉屬細(xì)菌，鏈格孢菌能夠引起植物黑斑病、腐爛病等，也能引起草莓采后黑腐病[23];莖點(diǎn)霉菌寄主廣泛，能夠引起多種植物葉斑病、莖枯病等，其中部分種是檢疫性植物病原菌[24]，提示該地塊雖然是第1年栽種草莓，但前茬作物留下的病原菌也不容忽視。

綜上所述，對(duì)于細(xì)菌來講，重茬3年后土壤中細(xì)菌物種多樣性及豐富度降低;變形菌門和擬桿菌門是兩種生境中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌;在屬水平上，新茬土中，豐度最高的前3位是鞘氨醇單胞菌、根瘤菌和假單胞菌，而在重茬土中，豐度最高的前3位是節(jié)桿菌、Olivibacter和根瘤菌;與新茬土相比，重茬土中鞘氨醇單胞菌、地桿菌和Skermanella豐度顯著降低，而節(jié)桿菌和腸桿菌豐度顯著升高。對(duì)于真菌來講，重茬3年后土壤中真菌物種多樣性增大;在門水平上，子囊菌門為兩種生境中的第一優(yōu)勢(shì)菌;接合菌門在新茬土壤中含量很低，但重茬3年后的土壤中該菌豐度快速增長;在屬水平上，新茬土壤中含有植物病原菌鏈格孢菌和莖點(diǎn)霉菌，重茬3年后枝頂孢屬、被孢霉屬、鐮刀菌屬等病原菌大量積累。因此，重茬土壤中細(xì)菌多樣性降低、真菌多樣性增高，病原真菌積累是引起草莓連作障礙的主要原因。

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