西南鬼燈檠UPLC-ECD指紋圖譜建立及聚類分析、主成分分析

張萍，羅敏，胡克特，王穎，顧丁，陳榮祥（遵義醫(yī)科大學，基礎醫(yī)學院，貴州 遵義 563000）

西南鬼燈檠（Rodgersia sambucifolia），為虎耳草科植物的干燥根莖，俗稱為巖陀，分布于云南、貴州、四川等地，是白族、苗族及傈族等民族常用的特色藥材，白族人稱為散藥，傈族人稱為埃陀[1]。西南鬼燈檠根莖中含有多種成分，如巖白菜素、槲皮素、山柰酚等黃酮類成分[2-4]。其中巖白菜素又稱虎耳草素，具有鎮(zhèn)咳化痰的功效，在臨床上多用于慢性支氣管炎等呼吸道系統(tǒng)疾病的治療，除此之外還具有活血調(diào)經(jīng)及祛風除濕的作用，對跌打損傷、骨折、風濕性關節(jié)炎、月經(jīng)不調(diào)、刀傷出血等疾病療效頗佳?，F(xiàn)代藥理學研究表明，西南鬼燈檠的提取物中具有抗氧化、抗心律失常、肝保護、抗炎、抑制免疫作用的功效[5-8]。

指紋圖譜是以系統(tǒng)的化學成分研究和藥理學研究為依托，以系統(tǒng)的、較強的選擇性來特征性地區(qū)分中藥的真?zhèn)闻c優(yōu)劣，將樣品指紋圖譜與建立起來的對照指紋圖譜進行相似性比較，從而對藥品質(zhì)量進行評價和控制[9-12]。超高效液相色譜（UPLC）借助于高效液相色譜（HPLC）的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、以非常低的系統(tǒng)體積及快速檢測手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量，與HPLC 相比，它縮短了分析時間、減少了溶劑用量，同時降低了分析成本。采用UPLC 繪制中藥材指紋圖譜可以大幅度縮短分析時間，有效彌補了常規(guī)HPLC 耗時較長的缺點。電化學檢測器（electrochemical detect，ECD）是測量物質(zhì)的電信號變化，可選擇性地檢測具有氧化還原性質(zhì)的化合物，如帶有硝基、巰基、酚羥基等基團的有機化合物[13]。近幾年關于西南鬼燈檠成分含量研究比較少，且測定成分單一，也并未進行不同產(chǎn)地西南鬼燈檠的成分比較與質(zhì)量分析，使用液相方法測定其成分多采用熒光檢測或者紫外檢測器，使用ECD 測定并未見報道[8，14]。以巖白菜素為代表的酚類化合物是西南鬼燈檠的主要活性成分，相較于現(xiàn)有的檢測方法，超高效液相色譜聯(lián)合電化學檢測器（UPLC-ECD）更加靈敏、準確，且減少了檢測時間，降低了分析成本。本研究采用UPLC-ECD建立了不同產(chǎn)地西南鬼燈檠藥材的指紋圖譜，并對不同產(chǎn)地的西南鬼燈檠樣品進行聚類分析和主成分分析，找尋樣品間的差異并分析其中的原因。通過以上研究，期望能夠發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的西南鬼燈檠藥材中活性成分的含量差異，為更加全面地評價西南鬼燈檠藥材質(zhì)量提供方法，為西南鬼燈檠藥材資源的開發(fā)和利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo UltiMate 3000 bio-RS 型UPLC 儀，配備ECD-3000 RS 電化學檢測器，檢測池為6011庫倫檢測池（美國賽默飛世爾科技）；GM-1.0A型真空泵（天津津騰科技有限公司）；ME104E/02型電子分析天平（美國梅特勒-托利多）；SB-5200DT 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）；Purelab Chorus 2 型純水超純水系統(tǒng)（英國埃爾格）；0.22 μm 針頭過濾器（上海安譜試驗科技股份有限公司）。

1.2 試藥

沒食子酸（批號：G131992，純度：97.0%）、巖白菜素（批號：B111464，純度：98.0%）、表兒茶素沒食子酸酯（批號：E101658，純度：98.0%）對照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），乙酸銨、乙腈、冰乙酸均為色譜純，試驗用水為試驗室自制超純水。共收集鬼燈檠藥材樣品14 批，2019年9月3日采集的四川重慶地區(qū)樣本，編號為S1 ～S4；2019年12月18日采集的貴州凱里地區(qū)樣品，編號為S5 ～S8；2020年1月6日采集的貴州遵義地區(qū)的樣品，編號為S9 ～S14。樣品經(jīng)遵義醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院顧丁副教授鑒定，全部為西南鬼燈檠。將收集來的西南鬼燈檠藥材樣品烘干后粉碎，過60 目篩，密封后于陰涼干燥處保存。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；以乙腈（A）-50 mmol·L－1檸檬酸緩沖鹽溶液（pH 2.8，B）為流動相，梯度洗脫，洗脫程序為：（0 ～5 min，2.5%→7.5%A；5 ～25 min，7.5%→18%A；25 ～26 min，18%→50%A；26 ～27 min，50%→2.5%A；27 ～30 min，2.5%A）；體積流量：0.4 mL·min－1；檢測電壓：650 mV；柱溫40℃；進樣量1 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱定沒食子酸、巖白菜素、表兒茶素沒食子酸酯3 種對照品，加入甲醇溶解定容，配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL－1的混合對照品母液，－20℃儲存?zhèn)溆?。使用時再根據(jù)試驗用量所需取混合對照品母液，稀釋成所需濃度的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取“1.2”項下經(jīng)處理的樣品粉未0.2 g 于試管中，精密加入20%甲醇溶液10 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：±1 kHz）50 min，用20%甲醇補足減少的質(zhì)量，搖勻，離心后取上清液經(jīng)0.22 μm 有機微孔濾膜過濾后進樣檢測。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果8 個共有峰相對保留時間的RSD值在0.12%～0.18%，相對峰面積的RSD值在2.1%～2.4%，表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液，室溫下放置0、2、4、8、12、16、24 h 后按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果8 個共有峰相對保留時間的RSD值在0.19%～0.23%，相對峰面積的RSD值在2.5%～3.0%，表明儀器穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取樣品粉末6 份0.2 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果8 個共有峰相對保留時間的RSD值在0.11%～0.20%，相對峰面積的RSD值在2.3%～2.7%，表明本方法重復性良好。

3 結(jié)果與分析

3.1 UPLC 指紋圖譜的生成與相似度、共有峰相關性分析

3.1.1 UPLC 指紋圖譜的生成 分別取14 批藥材樣品粉末0.2 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 版）軟件對14 批藥材樣品的UPLC 圖譜進行分析，將14 批藥材樣品UPLC 圖按順序?qū)?，選定S8號樣品作為參照圖譜（見圖1B），采用中位數(shù)法，時間窗設為0.1 min，樣品圖經(jīng)多點校正后，開始進行色譜峰的匹配，生成西南鬼燈檠的指紋圖譜，詳見圖1。

圖1 西南鬼燈檠的超高效液相色譜圖Fig 1 UPLC for the Rodgersia sambucifolia

3.1.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 版），以藥材樣品的UPLC-ECD對照指紋圖譜為參照，進行整體相似度評價，結(jié)果見表1，14 批藥材樣品相似度在0.922 ～0.998，且大部分樣品的相似度在0.95 以上。

3.1.3 共有峰的指認及相關分析 14 批西南鬼燈檠藥材樣品峰面積數(shù)據(jù)經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 版）處理后，以3 號峰為參照峰，整理了共有峰相對峰面積及其RSD值，結(jié)果見表2，共得到8 個共有峰，通過與對照品峰比較后，指認出3 個峰，分別是沒食子酸（1）、巖白菜素（3）、表兒茶素沒食子酸酯（7），見圖1C。

3.2 聚類分析

使用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件SSPS 24.0 與SIMCA 14.1對14 批西南鬼燈檠藥材樣品測定的峰面積數(shù)據(jù)進行了主成分分析，數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗后得出KMO 值為0.793。取特征值＞1 且統(tǒng)計顯著水平P＜0.05的數(shù)據(jù)作為主要成分，可將西南鬼燈檠的14 批藥材樣品中的成分分為3 個主成分，如表3所示，將處理后的數(shù)據(jù)繪制散點圖，如圖2所示。

表1 14 批藥材樣品相似度評價結(jié)果Tab 1 Similarity evaluation of the 14 batches of samples

表2 14 批藥材樣品UPLC-ECD 圖譜共有峰的相對峰面積及其RSDTab 2 RSD of absolute peak areas of common peaks in UPLC chromatograms of the 14 batches of samples

表3 3 個主成分因子的特征固有值和方差貢獻率Tab 3 Eigen values and variance contribution rates of 3 principalcomponents

3.3 主成分分析

將14 批西南鬼燈檠藥材樣品的主要成分進行提取分析之后，繼續(xù)將14 批西南鬼燈檠藥材樣品進行聚類分析，使用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件SSPS 24.0，采用系統(tǒng)聚類法，聚類方法為組間聯(lián)接法，聚類距離為平方歐式距離為對樣品進行分類，結(jié)果如圖3所示，可將14 批樣品分成兩大類。編號為S1、S2、S4、S7 號樣品可聚類成第一大類，其中S1、S2 號樣品，S4、S7 號樣品各自聚成小類。S3、S9、S11、S12號樣品與S5、S6、S8、S13 號樣品各自聚成小類，與S10、S14 號樣品聚類成第二大類，樣品間關系較近。

圖2 14 批藥材樣品主成分因子得分散點圖Fig 2 Scattering plot of principal component factors of the 14 batches of samples

4 討論

4.1 提取條件的優(yōu)化

試驗分別考察了不同提取溶劑（體積分數(shù)0%～100%甲醇，間隔10%）、不同超聲提取時間（10、20、30、40、50、60 min）和提取料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶80 g/mL）對提取效率的影響。結(jié)果表明，在20%甲醇作為提取溶劑，料液比為1∶50，超聲提取時間為50 min 的條件下，西南鬼燈檠樣品中的化學成分的提取效率最高，色譜峰最多且總峰面積最大。因此選用該條件作為試驗中的樣品提取條件。

圖3 14 批藥材樣品聚類分析樹狀圖Fig 3 Dendrogram of cluster analysis of 14 batches of samples

4.2 檢測器的選擇

由于ECD 選擇性檢測易于發(fā)生氧化還原反應的化合物，在直流模式下施加正向檢測電壓可以特異性檢測酚酸、黃酮等還原性較強的化合物。而西南鬼燈檠色譜圖中的主要色譜峰來自于酚酸、黃酮，其他干擾組分較少。文獻報道以巖白菜素為代表的酚類化合物是西南鬼燈檠的主要藥理活性成分，以UPLC-ECD 建立的指紋圖譜特異性針對其中的酚類化合物，色譜峰數(shù)量相對于紫外檢測器較多，更易于進行譜峰分離和成分檢測，對于西南鬼燈檠質(zhì)量評價和資源開發(fā)具有積極的意義。

4.3 共有峰相似度分析

UPLC-ECD 構(gòu)建的西南鬼燈檠指紋圖譜共指認出8 個共有峰，并且確定了1 號峰為沒食子酸、3 號峰為巖白菜素、7 號峰為表兒茶素沒食子酸酯，且8個共有峰的相似度在0.922 ～0.998，大部分在0.95以上，所有的共有峰面積RSD值都在69%以上，表明14 批藥材樣品質(zhì)量雖有差異但也相對穩(wěn)定。導致不同樣本之間差異性的原因可能與地理環(huán)境、溫度、采集時間、保存方式的不同有關。因為不同產(chǎn)地的降水量、光照、人文認知的不同，導致西南鬼燈檠藥材產(chǎn)品出現(xiàn)一定的品質(zhì)差異，生態(tài)地理環(huán)境的差異也會在植株生長過程中產(chǎn)生一定的影響，進而導致其植株的初生及次生代謝物的累積差異。

4.4 聚類分析與主成分分析

因巖陀為民族特色藥材，且在西南地區(qū)使用較為常見，故筆者總共收集了重慶與貴州兩個地區(qū)的樣本，樣品塊莖的大小不一。按照樣品中各成分的含量，在聚類分析與主成分分析中將14 個樣品分為兩大類。總的趨勢上來講，四川地區(qū)的為一類，貴州地區(qū)的為一類，因樣品都產(chǎn)自西南地區(qū)，兩地氣候相近，故出現(xiàn)了部分樣品聚類時地區(qū)交叉的現(xiàn)象。聚類分析和主成分分析的結(jié)果可顯示兩地之間的西南鬼燈檠藥材質(zhì)量差異不大，但是兩地藥材成分含量相對來講，四川地區(qū)巖陀藥材的成分含量較高。

綜上所述，本研究所建UPLC-ECD 指紋圖譜及聚類分析和主成分分析結(jié)果可為西南鬼燈檠藥材的質(zhì)量控制提供參考。