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    槲皮苷通過(guò)Nrf2/HO-1通路抑制H2O2誘導(dǎo)人肝細(xì)胞L-02凋亡和損傷

    2021-03-08 08:49:26呂瑩郝堯坤張照蘭河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃肝膽病科鄭州450000
    中南藥學(xué) 2021年1期
    關(guān)鍵詞:槲皮苷存活率肝細(xì)胞

    呂瑩,郝堯坤,張照蘭(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 脾胃肝膽病科,鄭州 450000)

    細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡,具有壞死的生化和形態(tài)學(xué)特征,細(xì)胞凋亡不僅可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡,而且在導(dǎo)致受損組織的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起重要作用[1]。肝細(xì)胞凋亡是肝臟疾病的重要影響因素,并參與正常肝細(xì)胞的發(fā)育和控制肝臟疾病的發(fā)展[2]。槲皮苷(quercitrin),即槲皮素-3-鼠李糖苷,具有較強(qiáng)的抗氧化作用,是一種遍布植物體內(nèi)的生物大分子,為側(cè)柏[3]、魚(yú)腥草[4]、桑寄生[5]等傳統(tǒng)中藥材的主要藥物成分,其藥效作用備受人們的重視。近幾年研究發(fā)現(xiàn)槲皮苷發(fā)揮多種生物學(xué)作用,包括抗腫瘤[6]、抑制破骨細(xì)胞形成[7]、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[8]、促進(jìn)牙周再生[9]、抑制巨噬細(xì)胞炎癥[10]等。本實(shí)驗(yàn)采用過(guò)氧化氫(H2O2)處理肝細(xì)胞損傷進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究,觀察槲皮苷對(duì)肝細(xì)胞L-02 損傷的保護(hù)作用和抗凋亡機(jī)制。

    1 材料

    正常人肝細(xì)胞L-02(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所),槲皮苷(純度≥98%)、7'-dichloroflurescin diacetate(DCFH-DA)試劑盒(美國(guó)Sigma-Aldrich 公司),噻唑藍(lán)(MTT)(貨號(hào):M2128)、二甲基亞砜(DMSO)、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)GIBCO 公司),異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):KGA108)(江蘇凱基生物公司),核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子(Nrf2)、血紅素加氧酶-1(HO-1)、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)抗體(美國(guó)Cellular Signaling Technology 公司),辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(北京中杉金橋有限公司),TNF-α(貨號(hào):E-EL-H0109c)、IL-6(貨號(hào):E-ELH0102c)酶聯(lián)免疫(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司),超氧化物歧化酶(SOD)(貨號(hào):S0109)、丙二醛(MDA)(貨號(hào):S0131)檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。

    2 方法

    2.1 L-02 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

    L-02 細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的L-02 細(xì)胞分為空白組:正常培養(yǎng)的L-02 細(xì)胞;H2O2組:使用0.6 mmol·L-1H2O2處理1 h;槲皮苷處理組:L-02細(xì)胞分別使用25、50、100、200、400、800、1600、3200 μmol·L-1槲皮苷預(yù)處理3 h 后,使用0.6 mmol·L-1H2O2處理1 h,收集細(xì)胞,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

    2.2 MTT 檢測(cè)L-02 細(xì)胞增殖

    各組L-02 細(xì)胞接種于96 孔板中,密度為1×105個(gè)·mL-1,培養(yǎng)48 h 后,每孔細(xì)胞加入5 mg·mL-1的MTT 溶液20 μL,37℃培養(yǎng)4 h,加入DMSO 150 μL,37℃搖床振蕩培養(yǎng)10 min,于酶標(biāo)儀測(cè)定L-02 細(xì)胞在490 nm 處的吸光(OD)值,細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

    2.3 DAPI/PI 檢測(cè)L-02 細(xì)胞凋亡

    各組L-02 細(xì)胞培養(yǎng)24 h(接種密度1×105個(gè)·mL-1),加入多聚甲醛固定,用DAPI 和PI染液染色15 min,染色后,加入甲醇洗滌,棄去甲醇,于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核染色情況,進(jìn)行DAPI/PI 雙染細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

    2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)L-02 細(xì)胞凋亡

    L-02 細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)·mL-1,參照細(xì)胞凋亡率檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟,使用500 μL 緩沖液懸浮細(xì)胞,加入Annexin V-FITC 5 μL 混勻,加入PI 5 μL 混勻,室溫遮光反應(yīng)15 min,置流式細(xì)胞儀檢測(cè)L-02 細(xì)胞凋亡。

    2.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、SOD 和MDA 的檢測(cè)

    收集各組L-02 細(xì)胞上清液,分別按照ROS、SOD 和MDA 的檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行檢測(cè)。

    2.6 ELISA 法檢測(cè)炎癥因子TNF-α 和IL-6 水平

    收集各組L-02 細(xì)胞上清液,按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TNF-α和IL-6 水平。

    2.7 Western blot 檢測(cè)Nrf2、HO-1、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)

    使用RIPA 裂解液提取各組L-02 細(xì)胞的總蛋白,用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,加入目的蛋白一抗(Nrf2、HO-1、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 均為1∶1000 稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜,次日用Tris-HCl-Tween 緩沖鹽溶液(TBST)洗膜10 min×3次,加入二抗(1∶800稀釋?zhuān)?,室溫孵? h,TBST 洗膜10 min×3 次,顯色、曝光,以β肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參蛋白,分析目的蛋白表達(dá)。

    2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析,組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn),以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 不同濃度槲皮苷對(duì)H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02存活率的影響

    與空白組比較,H2O2處理后人肝細(xì)胞L-02 存活率降低;與H2O2組比較,50 ~1600 μmol·L-1的槲皮素增加人肝細(xì)胞L-02 存活率,3200 μmol·L-1的槲皮素促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)人肝細(xì)胞L-02存活率降低(見(jiàn)表1)。其中槲皮苷100、200、400 μmol·L-1條件下的H2O2處理后人肝細(xì)胞L-02 存活率相對(duì)較高,800 μmol·L-1濃度下的存活率與100 μmol·L-1濃度差異不大,故選用槲皮苷100、200、400 μmol·L-13 個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    3.2 槲皮苷對(duì)H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02 凋亡的影響

    肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示,與空白組比較,H2O2處理后人肝細(xì)胞L-02 膜粗糙,部分膜破裂,透光度低;與H2O2組比較,槲皮苷100、200、400 μmol·L-1濃度組細(xì)胞形態(tài)明顯得到改善。DAPI 進(jìn)行細(xì)胞核染色顯示,與空白組(2.15±0.46)%比較,H2O2處理的L-02 染色質(zhì)濃縮、凝聚、斷裂,細(xì)胞凋亡(27.46±3.67)%顯著增多(P<0.05)。與H2O2組比較,槲皮苷100、200、400 μmol·L-1濃度組[(22.12±2.88)%、(16.87±2.34)%、(13.34±1.72)%]細(xì)胞凋亡顯著減少。其中槲皮苷 400μmol·L-1效果最佳(見(jiàn)圖1)。

    表1 不同濃度的槲皮苷對(duì)H2O2 處理肝細(xì)胞L-02 增殖的影響(± s,n =9)Tab 1 Effect of different concentrations of quercetin on the proliferation of hepatocytes L-02 treated with H2O2 (± s,n =9)

    表1 不同濃度的槲皮苷對(duì)H2O2 處理肝細(xì)胞L-02 增殖的影響(± s,n =9)Tab 1 Effect of different concentrations of quercetin on the proliferation of hepatocytes L-02 treated with H2O2 (± s,n =9)

    注:與空白組比較,*P <0.05;與H2O2 組比較,#P <0.05。Note:Compared with the blank group,*P <0.05;compared with the H2O2 group,#P <0.05.

    組別 細(xì)胞存活率/%空白組 100.84±3.13 H2O2 組 59.29±3.71*H2O2 +槲皮苷25 μmol·L-1 組 62.05±4.75 H2O2 +槲皮苷50 μmol·L-1 組 68.88±5.86#H2O2 +槲皮苷100 μmol·L-1 組 73.12±4.63#H2O2 +槲皮苷200 μmol·L-1 組 77.44±5.26#H2O2 +槲皮苷400 μmol·L-1 組 84.19±3.44#H2O2 +槲皮苷800 μmol·L-1 組 74.08±3.35#H2O2 +槲皮苷1600 μmol·L-1 組 66.39±3.11#H2O2 +槲皮苷3200 μmol·L-1 組 52.21±4.34#

    3.3 槲皮苷對(duì)H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02 凋亡和凋亡蛋白的影響

    與空白組比較,H2O2誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞L-02凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)量明顯升高,Bcl-2 蛋白水平顯著降低,Bax/Bcl-2 比率顯著升高(P<0.05,見(jiàn)表2和圖2)。與H2O2組比較,100、200、400 μmol·L-1槲皮苷明顯減少H2O2誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞L-02 凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)量,顯著提高Bcl-2 蛋白水平,降低Bax/Bcl-2 比率,并呈濃度依賴(lài)性(P<0.05,見(jiàn)表2和圖2)。

    3.4 槲皮苷對(duì)H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02 氧化應(yīng)激的影響

    與空白組比較,H2O2處理后人肝細(xì)胞L-02 中ROS 含量和MDA 水平顯著升高,SOD 活性明顯降低(P<0.05,見(jiàn)表3)。與H2O2組比較,100、200、400 μmol·L-1槲皮苷明顯降低H2O2損傷的L-02 細(xì)胞的ROS 和MDA 水平,顯著提高SOD 活性,并呈濃度依賴(lài)性(P<0.05,見(jiàn)圖3和表3)。

    3.5 槲皮苷對(duì)H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02 炎癥因子分泌的影響

    與空白組比較,H2O2組人肝細(xì)胞L-02 中TNF-α和IL-6 水平顯著升高(P<0.05)。與H2O2組比較,100、200、400 μmol·L-1槲皮苷明顯降低H2O2處理的人肝 細(xì) 胞L-02 的TNF-α和IL-6 水平,并呈濃度依賴(lài)性(P<0.05,見(jiàn)表4)。

    3.6 槲皮苷對(duì)H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02 Nrf2/HO-1 通路的影響

    圖1 槲皮苷對(duì)H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02 凋亡的影響(DAPI,×200)Fig 1 Effect of quercetin on the apoptosis of human hepatocytes L-02 treated with H2O2 (DAPI,×200)

    圖2 槲皮苷對(duì)人肝細(xì)胞L-02 凋亡(A)和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)(B)的影響Fig 2 Effect of quercetin on the apoptosis of human hepatocytes L-02 (A)and expression of apoptosis-related proteins(B)

    圖3 探針?lè)z測(cè)人肝細(xì)胞L-02 中ROS 熒光強(qiáng)度(×100)Fig 3 Fluorescence intensity of human hepatocyte L-02 ROS detected by probe method(×100)

    與空白組比較,H2O2處理人肝細(xì)胞L-02 中Nrf2 和HO-1 蛋白水平顯著升高(P<0.05);與H2O2組比較,槲皮苷100、200、400 μmol·L-1濃度組Nrf2 和HO-1 蛋白水平顯著升高,并呈濃度依賴(lài)性(P<0.05,見(jiàn)圖4及表5)。

    4 討論

    表2 槲皮苷對(duì)H2O2 處理肝細(xì)胞L-02 凋亡和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(x±s,n =9)Tab 2 Effect of quercetin on H2O2-treated hepatocyte L-02 apoptosis and apoptosis-related protein expression (x±s,n =9)

    表3 槲皮苷對(duì)H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02 中ROS 熒光強(qiáng)度、SOD 和MDA 水平的影響(± s,n =9)Tab 3 Effect of quercetin on ROS fluorescence intensity,SOD and MDA levels in human hepatocytes L-02 treated with H2O2 (± s,n =9)

    表3 槲皮苷對(duì)H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02 中ROS 熒光強(qiáng)度、SOD 和MDA 水平的影響(± s,n =9)Tab 3 Effect of quercetin on ROS fluorescence intensity,SOD and MDA levels in human hepatocytes L-02 treated with H2O2 (± s,n =9)

    注:與空白組比較,*P <0.05;與H2O2 組比較,#P <0.05。Note:Compared with the blank group,*P <0.05;compared with the H2O2 group,#P <0.05.

    組別 ROS 熒光強(qiáng)度(UFI) SOD 活性/(U·mL-1) MDA 含量/(μmol·L-1)空白組 493.38±78.83 32.40±1.26 2.34±0.67 H2O2 組 1305.59±102.80* 11.31±1.77* 9.57±0.85*H2O2 +槲皮苷100 μmol·L-1 組 1155.47±92.73# 16.98±1.35# 6.23±0.63#H2O2 +槲皮苷200 μmol·L-1 組 989.52±82.12# 21.34±1.49# 5.36±0.47#H2O2 +槲皮苷400 μmol·L-1 組 795.65±73.40# 24.55±1.18# 4.62±0.59#

    表4 槲皮苷對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞L-02 中TNF-α 和IL-6 分泌的影響(± s,n =9)Tab 4 Effect of quercetin on the secretion of TNF-α and IL-6 in human hepatocytes L-02 induced by H2O2 (± s,n =9)

    表4 槲皮苷對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞L-02 中TNF-α 和IL-6 分泌的影響(± s,n =9)Tab 4 Effect of quercetin on the secretion of TNF-α and IL-6 in human hepatocytes L-02 induced by H2O2 (± s,n =9)

    注:與空白組比較,*P <0.05;與H2O2 組比較,#P <0.05。Note:Compared with the blank group,*P <0.05;compared with the H2O2 group,#P <0.05.

    組別 TNF-α 含量/(ng·L-1)IL-6 含量/(ng·L-1)空白組 16.54±2.92 10.26±1.05 H2O2 組 52.33±5.45* 26.64±3.08*H2O2 +槲皮苷100 μmol·L-1 組 44.65±4.03# 22.15±2.60#H2O2 +槲皮苷200 μmol·L-1 組 37.25±4.68# 20.56±2.23*H2O2 +槲皮苷400 μmol·L-1 組 31.06±3.97# 15.22±2.18#

    圖4 槲皮苷對(duì)人肝細(xì)胞L-02 Nrf2/HO-1 蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Effect of quercetin on the expression of L-02 Nrf2/HO-1 proteins in human hepatocytes

    在肝細(xì)胞損傷過(guò)程中,ROS 與細(xì)胞內(nèi)大分子(蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等)以及細(xì)胞膜、細(xì)胞器結(jié)合破壞其生物活性,誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡,在多種肝臟疾病發(fā)生起重要作用[11]。目前關(guān)于肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的病理機(jī)制尚未完全闡明,既往研究顯示抑制肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及肝細(xì)胞凋亡可有效保護(hù)肝細(xì)胞免受氧自由基損傷[12-13],本研究主要探討槲皮苷對(duì)肝細(xì)胞H2O2損傷的作用機(jī)制,為研發(fā)抗H2O2損傷的新型藥物提供新方向。

    表5 槲皮苷對(duì)H2O2 處理肝細(xì)胞L-02 中Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)的影響(± s,n =9)Tab 5 Effect of quercetin on H2O2-treated hepatocyte L-02 Nrf2 and HO-1 protein expression (± s,n =9)

    表5 槲皮苷對(duì)H2O2 處理肝細(xì)胞L-02 中Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)的影響(± s,n =9)Tab 5 Effect of quercetin on H2O2-treated hepatocyte L-02 Nrf2 and HO-1 protein expression (± s,n =9)

    注:與空白組比較,*P <0.05;與H2O2 組比較,#P <0.05。Note:Compared with the blank group,*P <0.05;compared with the H2O2 group,#P <0.05.

    組別 Nrf2 蛋白 HO-1 蛋白空白組 0.21±0.02 0.14±0.02 H2O2 組 0.33±0.04* 0.24±0.03*H2O2 +槲皮苷100 μmol·L-1 組 0.45±0.03# 0.41±0.05#H2O2 +槲皮苷200 μmol·L-1 組 0.49±0.06# 0.46±0.05#H2O2 +槲皮苷400 μmol·L-1 組 0.66±0.07# 0.71±0.07#

    槲皮苷具有抗氧化、抗炎和改善藥物代謝等作用,國(guó)內(nèi)外研究顯示槲皮苷通過(guò)降低ROS 含量和細(xì)胞毒性發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[14]。細(xì)胞凋亡過(guò)程受到多種基因調(diào)控,研究表明caspase-3 可參與肝細(xì)胞凋亡過(guò)程,活化成Cleaved caspase-3 時(shí)可發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[15-16]。本研究通過(guò)使用H2O2處理L-02 細(xì)胞模擬其在體內(nèi)環(huán)境,細(xì)胞增殖率降低,Cleaved caspase-3、Bax 的蛋白水平升高,Bcl-2 的蛋白水平降低,細(xì)胞凋亡率升高;槲皮苷可促進(jìn)細(xì)胞存活,抑制H2O2誘導(dǎo)L-02 細(xì)胞凋亡,降低Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)量,升高Bcl-2 蛋白水平。

    機(jī)體在應(yīng)對(duì)氧自由基損害時(shí),形成完善的氧化應(yīng)激應(yīng)答防御系統(tǒng),該系統(tǒng)受抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant responsive element,ARE)位于抗氧化保護(hù)基因的上游調(diào)控區(qū)域調(diào)控[17]。氧化應(yīng)激是肝細(xì)胞損傷的重要原因之一,細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)ROS 水平升高,可加重肝細(xì)胞凋亡,MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物,細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)促使MDA 水平升高從而進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激損傷,SOD 屬于抗氧化酶類(lèi)且具有清除氧自由基能力[18-20]。研究表明,IL-6、TNF-α水平降低可減輕體內(nèi)炎癥反應(yīng)從而減弱細(xì)胞損傷程度[21]。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮苷可顯著升高SOD 活性,降低ROS、MDA、TNF-α、IL-6 水平。

    Nrf2/HO-1 途徑是參與機(jī)體氧化應(yīng)激調(diào)控的重要信號(hào)通路,ROS 的大量產(chǎn)生可刺激Nrf2 表達(dá),促進(jìn)下游HO-1 等抗氧化基因表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力[22-23]。Nrf2/HO-1 途徑已被證實(shí)在H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中激活,其激活是啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化途徑之一[24]。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮苷處理組Nrf2 和HO-1 表達(dá)水平顯著高于H2O2,提示槲皮苷可能通過(guò)激活Nrf2/HO-1 途徑進(jìn)而對(duì)H2O2誘導(dǎo)L-02 細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

    綜上所述,研究表明槲皮苷對(duì)H2O2損傷的肝細(xì)胞具有保護(hù)作用,抑制肝細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能為槲皮苷通過(guò)抑制H2O2引起的氧化應(yīng)激和炎癥因子分泌,與Nrf2/HO-1 通路激活密切相關(guān)。

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