基于JAK2/STAT3信號通路探討通痹膠囊治療類風濕關節(jié)炎的作用機制

閆國強，張倩，張俊艷，金穎慧，丁洪青，尹忠英，董晶晶，李寶芬，郭煊（.河北省滄州中西醫(yī)結合醫(yī)院，河北 滄州 06000；.滄縣醫(yī)院，河北 滄州 06000）

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種主要由細胞因子參與介導的慢性炎癥疾病，其高發(fā)病率和致殘率嚴重影響人們的正常生活，而發(fā)病機制的不明確導致尚未具有較滿意的治療方法[1]。

中藥復方在RA 的治療中具有多通路、多靶點的優(yōu)勢[2]，前期試驗已證實，經通痹膠囊能改善佐劑性關節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠側足紅腫、關節(jié)炎指數等病理癥狀，其機制涉及對p38MAPK/NF-κB 信號通路的調控[3]。JAK/STAT 途徑是多種細胞生長、活化、分化、凋亡及其功能發(fā)揮過程中重要的一條細胞內信號轉導通路[4]，已有研究證實，在RA 發(fā)病過程中JAK/STAT 信號通路處于激活狀態(tài)[5]。本實驗擬通過研究通痹膠囊對AA 大鼠JAK2/STAT3 信號通路的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物

Wistar 雌性大鼠48只，SPF 級，體質量（200±20）g，均購自于河北醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK（冀）2013-1-003]，在濕度50%～60%、溫度（24±2）℃，環(huán)境下飼養(yǎng)通風環(huán)境良好，自由攝食、飲水。

1.2 試藥

通痹膠囊（河北省滄州中西醫(yī)結合醫(yī)院院內制劑，批號：180508，規(guī)格：0.3 g/粒）；雷公藤多苷片（遠大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司，批號：20170102，規(guī)格：10 mg/片）；注射用弗氏完全佐劑、烏拉坦（Sigma，USA）；白細胞介素-6（IL-6）、γ干擾素（IFN-γ）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（深圳達科為生物技術有限公 司）；p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 檢 測試劑盒（Immunoway，USA）。

1.3 儀器

SZ61TRC-1LST 型解剖鏡（日本Olympus 公司）；Fresco 低溫冷凍離心機（美國Thermo 公司）；ZCLIPSE 50i 型光學顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（日本Nikon 公司）；MultiSkan3 全自動酶標分析儀（美國Thermo 公司）；電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；電動組織勻漿器（美國Fluka 公司）。

2 方法

2.1 AA 模型的建立與分組[6]

將48 只Wistar 大鼠隨機分為6 組，即正常組，模型組，雷公藤多苷片組，通痹膠囊低、中、高劑量組，每組8 只，適應性喂養(yǎng)1周。除正常組外，其余各組均給予弗氏完全佐劑制備AA 模型，將常規(guī)消毒后的大鼠右腿伸直，在足跖部中央皮內注射0.1 mL 的弗氏完全佐劑。

2.2 給藥

造模后第8日開始給藥，連續(xù)灌胃給藥4 周，每日1 次。通痹膠囊分為低、中、高劑量組[375、750、1500 mg/（kg·d）]（分別為臨床成人劑量的2、4、8 倍），雷公藤多苷片組用量為10 mg/（kg·d），給藥體積為8 mL·kg－1，正常組、模型組給予相同體積生理鹽水。

2.3 HE 染色觀察組織病理形態(tài)學變化

給藥結束后剪下炎性腫脹足，去掉足部皮置于10%中性福爾馬林溶液中固定，經過脫鈣、脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片和HE 染色后，光學顯微鏡下觀察滑膜病理組織學變化，從滑膜炎性細胞浸潤、血管翳生成、滑膜增生、關節(jié)結構破壞等方面進行病理評分，評分標準參考文獻方法[6]。

2.4 ELISA 法檢測大鼠血清及滑膜中IL-6、IFN-γ的表達水平

大鼠眼球后靜脈叢采血2 mL，3000 r·min－1離心10 min，取血清，－80 ℃冷凍備用。取血后脫頸法處死大鼠，分離滑膜組織[7]，凍于－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩z測時，充分解凍后，將組織加入適量生理鹽水進行勻漿，3000 r·min－1離心10 min，取上清液。根據ELISA 法，嚴格按照試劑盒標準步驟檢測各組大鼠血清及滑膜中IL-6、IFN-γ的含量。

2.5 Western blot 法檢測大鼠滑膜組織中p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 的蛋白相對表達

將大鼠關節(jié)滑膜組織用RIPA 蛋白抽提試劑進行組織蛋白提取，蛋白定量后，加入緩沖液煮沸變性，取20 μg 上樣。300 mA 橫流轉模3 h，3%BSA 封閉30 min。加p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 一抗，室溫孵育10 min，4℃過夜，室溫孵育30 min。TBST 洗膜3 min×5 次。加HRP 標記的二抗（均為1∶10 000），室溫封閉2 h，TBST洗膜3 min×6 次。ECL 發(fā)光試劑盒顯色，曝光定影后用凝膠定量分析軟件TotalLab Quant 讀取條帶的積分光密度（IOD）值，以β-肌動蛋白（β-actin）為內參照，Image 軟件分析計算其蛋白相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析，實驗數據以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 對AA 大鼠關節(jié)組織形態(tài)學的影響

正常組大鼠關節(jié)滑膜光滑，關節(jié)間隙無異常，無軟骨及骨的破壞，無滑膜組織增生、血管翳生成、炎性細胞浸潤等異常病理現象；模型組大鼠滑膜組織增生嚴重，重度血管翳形成，大量炎性細胞浸潤，軟骨及骨關節(jié)破壞明顯，出現嚴重RA 病理變化；經通痹膠囊[375、750、1500 mg/（kg·d）]、雷公虅多苷片治療后，各治療組病變程度較模型組明顯減輕，見圖1。

圖1 通痹膠囊對AA 大鼠關節(jié)組織形態(tài)學的影響（HE，×100）Fig 1 Effect of Tongbi capsule on joint histomorphology of AA rats（HE，×100）

與模型組比較，通痹膠囊低、中、高劑量組和雷公藤多苷片組大鼠關節(jié)組織病理改變均有明顯減輕（P＜0.05，P＜0.01）；與雷公藤多苷片組相比，通痹膠囊低、中劑量組關節(jié)組織病理改變差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；通痹膠囊高劑量組病理改善較為明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 AA 大鼠關節(jié)組織病理改變評分(n ＝8，± s)Tab 1 Score of pathological changes of joints in AA rats (n ＝8，± s)

表1 AA 大鼠關節(jié)組織病理改變評分(n ＝8，± s)Tab 1 Score of pathological changes of joints in AA rats (n ＝8，± s)

注（Note）：與模型組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與雷公藤多苷片組相比，▲P ＜0.05（Compared with the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01； compared with the tripterygium wilfordii polyglycoside tablets group，▲P ＜0.05）。

組別 病理改變評分模型組 2.63±0.52通痹膠囊低劑量組 1.88±0.64*通痹膠囊中劑量組 1.38±0.52**通痹膠囊高劑量組 0.88±0.64**▲雷公藤多苷片組 1.63±0.52**

3.2 對AA 大鼠血清及關節(jié)滑膜組織中IL-6、IFN-γ 含量的影響

由表2可知，模型組大鼠血清及滑膜組織中IL-6、IFN-γ的含量明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。通痹膠囊低劑量組可顯著降低模型大鼠滑膜組織中IFN-γ的含量（P＜0.01）；通痹膠囊中劑量組可顯著降低模型大鼠血清及滑膜組織中IL-6、IFN-γ的含量（P＜0.05，P＜0.01）；通痹膠囊高劑量組能夠顯著降低模型大鼠血清及滑膜組織中IL-6、IFN-γ的含量（P＜0.05，P＜0.01）；雷公藤多苷片組能明顯降低滑膜組織中IFN-γ的含量（P＜0.01）。

表2 通痹膠囊對模型大鼠血清及滑膜組織中IL-6 和IFN-γ 含量的影響(± s，n ＝8，pg·mL－1)Tab 2 Effect of Tongbi capsule on the content of IL-6 and IFN-γ in the serum and synovial tissue of model rats (± s，n ＝8，pg·mL－1)

表2 通痹膠囊對模型大鼠血清及滑膜組織中IL-6 和IFN-γ 含量的影響(± s，n ＝8，pg·mL－1)Tab 2 Effect of Tongbi capsule on the content of IL-6 and IFN-γ in the serum and synovial tissue of model rats (± s，n ＝8，pg·mL－1)

注（Note）：與正常組相比，▲▲P ＜0.01；與模型組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01（Compared with the normal group，▲▲P ＜0.01；compared with the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01）。

組別 IL-6/（pg·mL－1） IFN-γ/（pg·mL－1）血清 滑膜組織 血清 滑膜組織正常組 112.73±14.17 90.75±14.03 1583.43±180.43 1341.85±185.75模型組 138.96±9.79▲▲ 126.57±13.82▲▲ 1921.94±196.62▲▲ 1936.91±159.07▲▲通痹膠囊低劑量 142.01±19.22 135.63±15.23 1901.99±232.69 1686.77±169.62**通痹膠囊中劑量 129.46±6.23* 114.22±6.45* 1658.26±156.28* 1456.63±176.71**通痹膠囊高劑量 114.88±15.85** 103.57±20.24* 1668.24±222.11* 1477.25±220.11**雷公藤多苷片 135.95±14.61 119.45±15.50 1825.02±73.26 1406.82±224.04**

3.3 對AA 大鼠關節(jié)滑膜組織中p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 蛋白相對表達的影響

如圖2所示，與正常組相比，模型組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 相對表達升高（P＜0.01）；通痹膠囊低、中、高劑量組及雷公藤多苷片組均能夠顯著降低AA 大鼠滑膜組織 中p-JAK2/JAK2 及p-STAT3/STAT3 相對表達（P＜0.01）。

4 討論

圖2 通痹膠囊對大鼠滑膜組織中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達的影響Fig 2 Effect of Tongbi capsule on protein expressions of joint synovial tissue p-JAK2/JAK2 and p-STAT3/STAT3

JAK/STAT 途徑是多種細胞生長、活化、分化、凋亡及其功能發(fā)揮過程中重要的一條細胞內信號轉導通路，已有研究證實，在RA 發(fā)病過程中JAK/STAT 信號通路處于激活狀態(tài)[1]。許多細胞因子能夠激活JAK/STAT 途徑，其中包括IL-6及IFN-γ[8]。IL-6 及IFN-γ的水平在RA 滑膜組織中顯著升高，其在RA 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，這些細胞因子本身并無激酶活性[9]，但當受體與相應配體結合時，可使受體二聚體化，與酪氨酸蛋白激酶JAK 相結合、聚集，并使JAK活化，活化的JAK 使受體上酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，促使信號轉導和轉錄激活因子STAT 蛋白與受體結合，并在JAK 的催化下發(fā)生磷酸化，磷酸化STAT 與受體親和力降低，與受體分離，并形成二聚體的活性形式轉移到核內，結合到DNA的特定反應元件上誘導相應靶基因的表達[10-13]。

JAK2 是JAK 激酶家族成員之一，廣泛存在于各種組織和細胞中[14]，其在參與免疫調節(jié)和炎癥過程中發(fā)揮重要的作用[15]，STAT3 是一個關鍵性RA 致病因子，能夠抑制成纖維樣滑膜細胞（FLS）凋亡、促進T 細胞存活及抗體產生[16-17]，受促炎因子調控而失衡的STAT3 信號可導致慢性滑膜炎的產生[18]，抑制JAK2 及STAT3 的磷酸化對緩解關節(jié)炎癥狀、促進FLS 凋亡意義重大[19-22]。在本研究中，AA 大鼠血清及滑膜組織中促炎因子IL-6、IFN-γ含量明顯升高，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 相對表達升高，經通痹膠囊治療后，IL-6 及IFN-γ的含量下降，JAK、STAT 蛋白磷酸化得到抑制。

課題組前期研究表明，通痹膠囊能夠顯著降低大鼠關節(jié)炎指數及足腫脹度，有效降低大鼠血清及滑膜組織中IL-1 和TNF-α的含量，并抑制滑膜組織中p38MAPK、NF-κB 及IκBα的蛋白表達[3]。p38MAPK/NF-κB 信號通路與JAK2/STAT3信號通路在RA 的發(fā)病過程中，均處于激活狀態(tài)，活化的MAPKs、JAK/STAT 磷酸化它們的靶點轉錄因子，與相應基因的增強子結合后，啟動基因轉錄，產生炎性因子、趨化因子，造成滑膜細胞的增生及骨組織的破壞；炎性因子、趨化因子又能活化MAPKs、JAK/STAT 路徑，從而形成惡性循環(huán)，造成持久的慢性滑膜炎[5]。因此，對MAPKs 與JAK/STAT 通路的調控，將會對RA 的治療產生積極的作用。

RA 在中醫(yī)學中屬“痹癥”范疇，也稱之為“頑痹”“久痹”“骨痹”“筋痹”“歷節(jié)”“鼓槌風”“鶴膝風”等，它的病理因素主要有風、寒、濕等方面[23]，風勝為行痹、寒勝為痛痹、濕勝為著痹[24]。風寒濕邪、入侵筋脈、痹阻氣血、凝滯關節(jié)而成疼痛重著之癥，病及日久，損傷氣血，肝腎不足而成纏綿之勢。通痹膠囊能夠祛風除濕、舒筋活絡，用于風寒濕痹證。方中秦艽祛風濕、通經絡，香附為氣中之血藥，行血中之氣滯而止痛，共為君藥；羌活、獨活、制川烏祛風濕，散寒凝，止痹痛，雞血藤、絡石藤、忍冬藤取“藤以入絡”能通行絡脈、經筋以止痛，木瓜舒筋活絡，共為臣藥；桑寄生、杜仲、牛膝祛風濕兼補肝腎，當歸養(yǎng)血活血以驅邪，馬錢子加強止痛之功，共為佐藥；金錢白花蛇透骨搜風，引藥入絡，能更好地發(fā)揮藥力。中藥復方具有多成分共同起效治療疾病的特點，一般涉及多通路多靶點，對其作用機制的研究仍需更加深入。