基于Box-Behnken法的天麻凍干工藝優(yōu)化研究

付偉，楊群，薄雯映，沈華*（1.湖北金貴中藥飲片有限公司，武漢 430051；.九州通醫(yī)藥集團 九信（武漢）中藥研究院有限公司，武漢 430050）

天麻為蘭科屬植物天麻Gastrodia elataB1.的干燥塊莖，是我國傳統(tǒng)珍貴藥材之一，具有息風止痙、平抑肝陽和祛風通絡的作用，常用于治療小兒驚風、癲癇抽搐、頭痛眩暈、手足不遂、肢體麻木和風濕痹痛等癥[1]，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品[2]，其炮制方法最早記載于《雷公炮炙論》[3]：“修事天麻十兩，焙之，細剉，單搗然用”。2020年版《中國藥典》[1]收載的天麻，其飲片【炮制】項下規(guī)定天麻的加工方式為采挖，清洗，蒸透，干燥，潤透，切片，干燥。該方法操作復雜，過程重復，耗時費力，有效成分損失較大，制成的飲片質(zhì)地堅硬，易變色，且氣味特異或有酸味，嚼之有黏性，需蒸煮服用，食用不便，采用真空冷凍干燥方法處理可以有效地解決上述問題。真空冷凍干燥方法的加工過程為將采挖的鮮藥材洗凈后直接放入低溫下冷凍，當樣品完全冷凍后抽真空，低溫干燥。由于整個過程都是在低溫條件下進行，能夠較好地保留藥材的外觀品質(zhì)、顏色、氣味，同時使有效成分保留率高，溶出速度快，開袋即食，使用方便，具有較好的發(fā)展前景[4-7]。大量試驗表明，預凍時間、預凍溫度、干燥溫度、一次干燥時間等因素均可影響凍干樣品的質(zhì)量[8-11]。本試驗擬用Box-Behnken 中心組合設計方法，以浸出物、天麻素、對羥基苯甲醇及巴利森苷類含量的綜合評分作為指標，考察預冷凍時間、干燥溫度、一次干燥時間3 個因素對天麻真空冷凍干燥工藝的影響，優(yōu)選天麻凍干工藝。

1 材料

1.1 試藥

天麻素（批號：110807-201809，純度：96.7%）、對羥基苯甲醇（批號：111970-201702，純度：99.4%）（中國食品藥品檢定研究院）；巴利森苷A（批號：PS011129，含量＞98.0%）、巴利森苷B（批號：PS011138，含量＞98.0%）、巴利森苷C（批號：PS011140，含量＞98.0%）、巴利森苷E（批號：PS190918-01，含量≥98.0%）（成都普斯生物科技股份有限公司）；甲醇、乙腈均為色譜級，乙醇、磷酸均為分析級，水為超純水。

鮮天麻由金寨九州天潤中藥產(chǎn)業(yè)有限公司提供，經(jīng)九信（武漢）中藥研究院有限公司吳衛(wèi)剛高級工程師鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elataB1.的干燥塊莖。

1.2 儀器

LGJ-10E 型冷凍干燥機[四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司]；1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；UPT-11-10T 優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 響應面法試驗指標成分的測定

2.1.1 浸出物測定 天麻浸出物的測定方法參照2020年版《中國藥典》通則2201 項下熱浸法測定[12]，浸出物溶劑為稀乙醇。

2.1.2 含量測定 天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E指標成分的測定方法參照2020年版《中國藥典》天麻項下特征圖譜的方法測定[1]，天麻樣品與混合對照品的HPLC 對比鏡像圖見圖1。

圖1 天麻樣品與混合對照品HPLC 鏡像圖Fig 1 HPLC mirror image of Gastrodiae Rhizoma sample and mixed reference substance

2.2 響應面法優(yōu)選天麻冷凍真空干燥工藝

根據(jù)前期試驗，選擇預凍時間（A）、干燥溫度（B）和一次干燥時間（C）3 個因素為響應面法考察因素，以浸出物、天麻素、對羥基苯甲醇含量及巴利森苷類含量的綜合評分為評價指標，根據(jù) Box-Benhnken 中心組合試驗設計原理，以單因素的最佳值為中心，上下區(qū)域各給定1 個水平值，該3 個值作為響應面試驗設計水平，設計3 因素3 水平17 個試驗點的響應面分析，其中零點試驗重復5 次，試驗設計因素及水平見表1。試驗結(jié)果采用 Design-Expert 11 軟件進行回歸分析，優(yōu)化天麻的真空冷凍干燥工藝。

表1 中心組合試驗設計方案中的因素及水平Tab 1 Factors and levels of the Box-Behnken design

3 結(jié)果與分析

3.1 響應面設計方案及結(jié)果

由于響應面試驗使用的評價指標數(shù)量較多，為盡可能客觀地反映各個因素之間的關(guān)系及各個因素水平對天麻真空冷凍干燥工藝的影響，擬采用綜合加權(quán)評分法，將各個指標以一個綜合指標（OD）的形式綜合考察，以綜合指標進行直觀分析。根據(jù)各指標成分的重要性，確定浸出物（x1）與對羥基苯甲醇（x3）的權(quán)重系數(shù)均為0.1，天麻素（x2）的權(quán)重系數(shù)為0.3。巴利森苷類（x4）由于成分較多，權(quán)重系數(shù)為0.5。綜合評分（OD）＝0.1x1/x1max＋0.3x2/x2max＋0.1x3/x3max＋0.5x4/x4max。Box-Benhnken 試驗設計方案及結(jié)果見表2。

3.2 模型的建立與顯著性檢驗

采用Design-Expert 11 軟件對結(jié)果進行模型擬合，擬合分析結(jié)果見表3，由結(jié)果可知該模型適合采用二次方程。以浸出物、天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 含量的綜合評分為響應值，對試驗結(jié)果進行回歸擬合后，各試驗因子對響應值的影響可以用回歸方程表示為：Y1＝0.8556 ＋0.0148A＋0.0648B＋0.0448C＋0.0443AB－0.0862AC＋0.0158BC－0.1402A2－0.0267B2－0.0427C2。方差分析結(jié)果見表4。

表2 Box-Behnken 試驗設計方案及結(jié)果Tab 2 Design and data of the Box-Behnken test

表3 多種模型擬合分析Tab 3 Multiple model fitting analysis

由表4可知，回歸方程使用的模型P＜0.0001，表明此模型有效可靠。失擬項是用來表示模型與試驗擬合的程度，本次模型的失擬項P值為0.0706＞0.05，表明該模型無失擬因素存在，模型與實際值能較好地擬合。R2＝0.9909，說明該模型能解釋99.09%響應值的變化；R2Adj＝0.9792，說明可信度較好，可以運用該模型分析。

該模型中，干燥溫度（B）、干燥時間（C）、預凍時間-干燥時間（AB）、預凍時間-干燥溫度（AC）、A2、C2極顯著；干燥溫度-干燥時間（BC）、預凍時間（A）、B2顯著；說明在綜合評分作為評價指標的情況下，各影響因素之間不僅存在線性關(guān)系，還存在交互影響。不同考察因素與綜合評分的響應面分析見圖2～4。圖2及圖3的響應面圖坡度較陡，表明預凍時間與干燥時間、預凍時間與干燥溫度交互作用較強，對綜合評分的影響顯著。圖4的響應面圖坡度平緩，表明干燥時間與干燥溫度的交互作用較弱，對綜合評分的影響較小。

根據(jù) Design-Expert 11.0 軟件計算結(jié)果分析可知，天麻凍干的最佳工藝為預凍時間10 h，干燥時間18 h，干燥溫度47.2℃，理論計算得分為0.915，為方便試驗操作，將最佳工藝調(diào)整為冷凍10 h，在溫度45℃條件下干燥 18 h。

3.3 驗證試驗

表4 回歸模型方差分析結(jié)果Tab 4 Variance analysis in regression model

圖2 預凍時間和一次干燥時間及其交互作用對綜合評分影響的等高線圖和三維曲面圖Fig 2 3D response surface plot and contour plot of pre-freezing time and primary drying time

圖3 預凍時間和干燥溫度及其交互作用對綜合評分影響的等高線圖和三維曲面圖Fig 3 3D response surface plot and contour plot of pre-freezing time and drying temperature

通過Box-Behnken 試驗確定天麻凍干的最佳工藝為冷凍 10 h，在溫度45℃條件下干燥 18 h，在此凍干條件下，預估天麻的浸出物含量為35.0%，天麻素含量為0.44%，對羥基苯甲醇含量為 0.02%，巴利森苷類含量為 3.58%。稱取天麻鮮品 3 份，每份 700 g，按照最優(yōu)的工藝制備樣品，測定其含量，驗證凍干工藝的可行性。結(jié)果顯示天麻浸出物的含量平均為34%，天麻素的含量平均為0.45%，對羥基苯甲醇的含量平均為0.03%，巴利森苷類的含量平均為3.57%，與預估值基本一致。說明該回歸模型可信度高，預測效果較好，具有可重復性和可操作性，可用于天麻凍干飲片制備。

圖4 干燥溫度和一次干燥時間及其交互作用對綜合評分影響的等高線圖和三維曲面圖Fig 4 3D response surface plot and contour plot of drying temperature and primary drying time

4 討論

天麻素、對羥基苯甲醇為天麻的主要有效成分，具有抗抑郁、鎮(zhèn)靜催眠、降壓等作用[13-18]。2020年版《中國藥典》將天麻素與對羥基苯甲醇含量之和列為控制指標，評價天麻的質(zhì)量。研究表明[19-22]，天麻中亦含有大量的巴利森苷類化合物，該類化合物可以明顯改善大腦的學習記憶，具有抗抑郁、抗衰老等藥理作用，是天麻的重要成分。為了更有效、客觀地評價各因素對真空冷凍干燥工藝條件的影響，本文以浸出物、天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷 E 的含量作為優(yōu)化天麻真空冷凍干燥工藝的評價指標。

通過前期試驗確定預凍時間、干燥時間和干燥溫度3 因素對天麻質(zhì)量影響較大，故選擇該3個因素作為Box-Behnken 響應面法試驗設計的因素，確定天麻的最佳真空冷凍干燥工藝條件為：預凍時間 10 h，干燥溫度45 ℃，干燥時間 18 h。凍干工藝得到的天麻產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可以有效防止藥效成分在干燥過程中被分解，同時最大限度地保留了產(chǎn)品原有的色、香、味，而且在生產(chǎn)過程中沒有添加任何防腐劑，保證了產(chǎn)品的食用安全性，極大地提高了產(chǎn)品的商業(yè)價值。

由于凍干天麻含水量低，在高濕條件下易吸潮變色，不易保存，故對包裝要求比較高，前期摸索發(fā)現(xiàn)鋁箔材質(zhì)及低溫條件下可以較好地防止凍干天麻吸水受潮，后期將會開展凍干天麻的儲藏期試驗，擬尋找凍干天麻的最適包裝及最佳儲存條件，為凍干天麻工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。