正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化玉液湯煎膏劑中葛根素和總皂苷提取工藝及制備工藝的研究*

韓瑞偉，張彥雨，何 禮，田 明，馮月男**

（1.四川中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校 川西北藥用資源與利用實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽(yáng)621000；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150040）

前 言

糖尿病是因胰島素分泌相對(duì)或絕對(duì)不足所導(dǎo)致的一種復(fù)雜且特異的代謝性臨床綜合征[1]。近年來(lái)糖尿病的發(fā)病率迅速升高，國(guó)際糖尿病聯(lián)盟2019年調(diào)查結(jié)果顯示，全球約有4.63億糖尿病患者，中國(guó)約有1.16億成年人患有糖尿病且面臨罹患危及生命的并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重危害人民健康和生存質(zhì)量[2～4]，同時(shí)，給個(gè)人以及家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療糖尿病強(qiáng)調(diào)疾病的微觀區(qū)分，通過(guò)癥狀和檢查確定疾病類(lèi)型，探索致病因素，準(zhǔn)確定位致病器官并始終以相同的方式治療相同的疾病，在治療糖尿病方面，主要集中在血糖調(diào)節(jié)，但很少考慮高血糖的病因。相反，中醫(yī)藥在治療糖尿病時(shí)強(qiáng)調(diào)辨證論治，著重于整體觀念，并考察癥狀和造成疾病的原因，中醫(yī)中藥在預(yù)防和治療糖尿病方面經(jīng)驗(yàn)豐富，有整體調(diào)節(jié)、綜合治療且毒副作用小等優(yōu)勢(shì)[5]。玉液湯出自張錫純所著《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，是治療消渴的名方，現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)及臨床觀察均證實(shí)其對(duì)糖尿病具有良好療效[6～10]。

隨著現(xiàn)代技術(shù)的快速發(fā)展，玉液湯臨床仍以傳統(tǒng)煎煮服用形式為主，雖是最經(jīng)典的制備方法，但對(duì)于需長(zhǎng)期服藥的糖尿病患者，具有服用量大，儲(chǔ)存和攜帶不便等缺點(diǎn)。中藥煎膏劑從提取工藝到服用方式，即保留了原方用藥特點(diǎn)，又能發(fā)揮現(xiàn)代劑型的優(yōu)勢(shì)[11～13]，具有劑量小、口感佳，質(zhì)量可控等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)煎膏劑的制備工藝較其他劑型來(lái)說(shuō)較為簡(jiǎn)便[14]，為使其更好應(yīng)用于臨床，擬在中醫(yī)理論的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)玉液湯煎膏劑，本文主要研究玉液湯煎膏劑提取、濃縮和成型工藝，為進(jìn)一步研究與生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

黃芪、山藥、知母、雞內(nèi)金、葛根、五味子、天花粉飲片（亳州市瑞輝醫(yī)藥有限公司，批號(hào)均為：20180301，經(jīng)鑒定符合《中國(guó)藥典》2015版一部要求）；黃芪甲苷對(duì)照品（上海寶曼生物科技有限公司）、葛根素對(duì)照品（上海寶曼生物科技有限公司）；木糖醇（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；甲醇（格里斯醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司，色譜純）；甲醇（格里斯醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司、分析純）、乙醇（天津市大茂化學(xué)制劑廠）、高氯酸（天津市福晨化學(xué)試劑廠）、冰醋酸（常州恒光化學(xué)試劑有限公司）、氯仿（洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司）；超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

名稱(chēng)高效液相色譜儀紫外-可見(jiàn)分光光度儀多功能提取罐電熱恒溫水浴鍋電子天平分析天平數(shù)顯控溫電熱套電熱恒溫減壓干燥箱超聲波清洗儀廠家美國(guó)Waters日本島津湖南合信制藥設(shè)備有限公司上海一恒科學(xué)儀器有限公司上海蒲春計(jì)量?jī)x器有限公司賽多利斯科學(xué)儀器有限公司北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司上海一恒科學(xué)儀器有限公司深圳市超潔實(shí)業(yè)科有限公司型號(hào)Waters1515 UV-2550 DGQ-6m3 HWS-12 JEA102 BSA224S SXKW DHG-9030A CJ-060-3

2 方法與結(jié)果

2.1 處方的確定

玉液湯原方（《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》記載）按照現(xiàn)代單位換算，確定現(xiàn)代處方用量，即：山藥30g，知母18g，黃芪15g，五味子9g，天花粉9g，雞內(nèi)金6g，葛根5g[15]。

2.2 提取工藝研究

以預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)采取回流提取的方法，將出膏率、醇浸出物、總皂苷和葛根素含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“四要素”），從加水量、浸泡時(shí)間、提取次數(shù)、提取時(shí)間四方面對(duì)藥材的提取工藝進(jìn)行考察，以選擇最優(yōu)提取方案。

2.2.1 浸泡時(shí)間考察

玉液湯總藥材量為92g，按處方量的1/10量取藥材8份，即每份9.2g，每份加10倍量水，將藥材浸泡時(shí)間設(shè)梯度，在10～100min之間每10min取一份藥材、濾過(guò)，計(jì)算不同浸泡時(shí)間藥材的吸水率。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1浸泡時(shí)間與吸水率結(jié)果Fig.1 The results of soaking time and water absorption

結(jié)果顯示，玉液湯中藥材隨浸泡時(shí)間增加吸水率呈上升狀態(tài)，直到浸泡80min后吸水率不再上升，呈吸水飽和狀態(tài)，故將玉液湯的浸泡時(shí)間選為80min。

2.2.2 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝

根據(jù)玉液湯煎膏劑提取工藝的主要影響因素，選擇正交設(shè)計(jì)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，考察因素和水平如表1所示。

表1玉液湯煎膏劑提取工藝的正交設(shè)計(jì)Table 1 The orthogonal design of extraction process of Yuye decoction agent

處方量藥材，按照上述表格對(duì)應(yīng)各因素水平，每項(xiàng)首次加水時(shí)浸泡80min，按設(shè)計(jì)次數(shù)進(jìn)行回流提取并收集提取藥液，濃縮，定容置200mL，測(cè)出膏率、醇浸出物、總皂苷含量和葛根素的含量。

2.2.3 指標(biāo)成分的測(cè)定[16]

（1）出膏率的測(cè)定：精確量取100mL“2.2.2”項(xiàng)下玉液湯提取液，按加水量設(shè)計(jì)方案每個(gè)因素水平量取一份后分別置于蒸發(fā)皿中蒸干，蒸干后置于烘箱中干燥至恒重，最后將其置于干燥器干燥30min后迅速稱(chēng)重，計(jì)算出膏率。將所得干燥藥品研細(xì)，用于下一步研究。

（2）醇溶浸出物的測(cè)定：稱(chēng)取3.5g上一步干燥藥粉，將其溶于95%乙醇中，按照《中華人民共和國(guó)藥典》醇溶性浸出物測(cè)定法（通則2201）測(cè)定，得醇溶浸出物含量。

（3）總皂苷含量的測(cè)定[17]

供試品A溶液的制備：精確稱(chēng)取“2.2.2”項(xiàng)下玉液湯三個(gè)因素水平的提取液，每個(gè)因素一份，每份100mL，分別置于分液漏斗中每次50mL氯仿萃取，共三次。將萃取所得藥液用蒸發(fā)皿蒸干，藥渣置于具塞錐形瓶中加入25mL水飽和正丁醇，超聲60min，抽濾，再將濾液蒸干后加10mL水溶解殘?jiān)?，殘?jiān)螪101大孔吸附樹(shù)脂柱，按照50mL水洗脫、50mL 70%乙醇順序洗脫，收集洗脫液，將其置于水浴鍋上蒸干，殘?jiān)?mL甲醇溶解后定容至5mL，混勻，即為供試品溶液。

對(duì)照品B溶液的制備：黃芪甲苷對(duì)照品經(jīng)精密度為1/100000的分析天平精密稱(chēng)取，用甲醇溶解成濃度為0.5mg/mL的溶液，即得。

選擇測(cè)量波長(zhǎng)及測(cè)定吸光度值[18]：將50μL A溶液和50μL B溶液分別置于具塞試管中，揮干溶劑后加0.3mL 5%冰醋酸和0.7mL高氯酸，蓋塞密閉，用60℃水浴鍋加熱20min，取出冷卻，加冰醋酸5mL，使用全波長(zhǎng)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描測(cè)定。二者均在560nm處有最大吸收，故將560nm設(shè)為測(cè)定波長(zhǎng)，計(jì)算總皂苷含量。

（4）葛根素含量的測(cè)定[19]

色譜條件：色譜柱:Lichrospher-C18（4.6×150mm，5μm）柱；流動(dòng)相:甲醇-0.4%醋酸溶液（26∶74）；流速:1mL·min-1；柱溫:30℃；檢測(cè)波長(zhǎng):250nm。

對(duì)照品C溶液的制備：用精密度為1/100000的分析天平精密稱(chēng)取葛根素對(duì)照品加35%乙醇制成50μg/mL的溶液，即得對(duì)照品C溶液。

供試品D溶液的制備：取1g“2.2.3”項(xiàng)下備用干膏研細(xì)，加50mL 35%乙醇，稱(chēng)重，超聲20min，再次稱(chēng)重，用35%乙醇補(bǔ)足缺少質(zhì)量，抽濾，即得。

測(cè)定方法：10μL C溶液和10μL D溶液分別進(jìn)高效液相色譜儀測(cè)定分析。

2.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2玉液湯煎膏劑提取工藝正交設(shè)計(jì)結(jié)果表Table 2 The orthogonal design results of Yuye decoction agent extraction process

正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，以出膏率為標(biāo)準(zhǔn)的最佳提取條件為A2B3C3條件組合；以浸出物為標(biāo)準(zhǔn)的最佳提取條件為A2B3C3組合；以總皂苷為標(biāo)準(zhǔn)的最佳提取條件為A2B3C3組合；以葛根素為標(biāo)準(zhǔn)的最佳提取條件為A3B3C3組合。

德國(guó)哲學(xué)家康德在1781年首次提出了圖式的概念。1932年英國(guó)心理學(xué)家巴特利特提出“圖式”在心理學(xué)中的定義。隨后，教育家皮亞杰，魯姆哈特，Carrell，Nunan等人的研究奠定了圖式理論的理論基礎(chǔ)。這些理論基礎(chǔ)被廣泛應(yīng)用于后來(lái)的研究中。

從試驗(yàn)結(jié)果可知，綜合考慮加水量、提取次數(shù)和提取時(shí)間對(duì)玉液湯煎膏劑的四要素的影響，最終選取最優(yōu)提取工藝為A2B2C3組合，即10倍水量回流提取120min、8倍回流提取90min，共兩次，將兩次提取液合并，供下一步使用。

2.3 濃縮工藝研究

依據(jù)煎膏劑的用量及其規(guī)格，最終確定將提取物濃縮至25mL。在該實(shí)驗(yàn)中，將出膏率、醇浸出物濃度和總皂苷含量作為研究指標(biāo)，考察常壓和減壓下不同溫度、溫度相同不同壓力下對(duì)指標(biāo)的影響，選擇最佳濃縮工藝。

2.3.1 相對(duì)密度測(cè)定

按照《中華人民共和國(guó)藥典》相對(duì)密度測(cè)定法（0601）進(jìn)行測(cè)定。

2.3.2 供試品溶液制備

10倍量處方藥材，按照正交試驗(yàn)確定的最佳提取條件，即10倍水量回流提取120min、8倍回流提取90min進(jìn)行提取，收集提取液，備用。

2.3.3 常壓濃縮考察

2.3.4 減壓濃縮考察

壓力相同溫度不同的考察：量取4份供試品溶液各650mL，減壓0.09MPa，分別在溫度60℃、70℃、80℃、90℃條件下濃縮至25mL。測(cè)出膏率、醇浸出物和總皂苷含量、相對(duì)密度。

同溫度不同壓力考察：3份上述藥材，溫度70℃、在壓力分別為0.07、0.08、0.09MPa時(shí)進(jìn)行濃縮，濃縮25mL。測(cè)定出膏率、醇浸出物、總皂苷含量，相對(duì)密度。

結(jié)果表明，壓力在0.09MPa下，溫度在60～90℃條件下，90℃時(shí)的出膏率、浸出物、總皂苷的含量略高于60～80℃時(shí)的，但差異不顯著；溫度70℃，壓力0.07～0.09MPa對(duì)于出膏率、浸出物、總皂苷的含量影響很小，差異不顯著。因此，實(shí)際生產(chǎn)中，可以采用常壓90～100℃，或在減壓0.07～0.09MPa、溫度60～90℃條件下濃縮，相對(duì)密度不低于1.22。

2.4 矯味劑的篩選與用量

因玉液湯中藥材味多酸、苦，故濃縮液味道欠佳，需加矯味劑改善口感。綜合多方面考慮，選擇阿斯巴甜、木糖醇和三氯蔗糖三種矯味劑，分別加入1%煎膏量的矯味劑，其中木糖醇口感最好。接下來(lái)又對(duì)木糖醇的用量進(jìn)行考察，分別添加了12.5%、22.2%、30.0%、36.4%的木糖醇，結(jié)果顯示以木糖醇含量30.0%、36.4%口感最佳，但36.4%的流動(dòng)性較差，故選用含量為30.0%。

2.5 制劑處方和工藝確定

玉液湯一個(gè)處方藥材重92g，一個(gè)處方可制備煎膏劑50mL，一日服用2次，即每次服用25mL，按1000個(gè)制劑單位（即1000mL）規(guī)范確定處方，即20倍原方藥材回流煎煮兩次，分別為加入10倍水量、浸泡80min、回流提取120min和加入8倍水量回流提取90min，將兩次藥液合并，采用常壓90～100℃，或在減壓0.07～0.09MPa、溫度60～90℃條件下濃縮，相對(duì)密度不低于1.22，加入處方量30%的木糖醇，加適量水至1000mL，混勻，灌裝，滅菌，即得。

3 結(jié)論

本課題在優(yōu)選玉液湯煎膏提取工藝時(shí)，為了保證藥材提取效果，對(duì)浸泡時(shí)間采取單因素試驗(yàn)進(jìn)行考察，確定了浸泡時(shí)間為80min；以出膏率、浸出物、總皂苷含量和葛根素含量作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)采取正交實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行考察，確定了最優(yōu)提取工藝為10倍水量回流提取120min、8倍回流提取90min，共兩次，將兩次提取液合并；對(duì)常壓和減壓下不同溫度、溫度相同不同壓力對(duì)指標(biāo)的影響進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，最終確定了常壓90～100℃，或在減壓0.07～0.09MPa、溫度60～90℃條件下濃縮；對(duì)三種矯味劑進(jìn)行了用量考察，最終選用木糖醇做甜味劑，含量為30.0%。實(shí)驗(yàn)確定了玉液湯煎膏劑的最佳制備工藝，取得了一些積極的成果，但還有許多不全面的地方，對(duì)于其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和穩(wěn)定性的研究還應(yīng)進(jìn)一步完善，從而使玉液湯煎膏劑擁有更廣闊的市場(chǎng)。