缺氧誘導(dǎo)因子-1α和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與非小細(xì)胞肺癌中臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系的研究

路璐 潘峰 趙成 孫志鋼 張楠

目前,肺癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)居于首位，也是腫瘤相關(guān)性死亡的主要原因。其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌的80%以上[1]。由于當(dāng)前腫瘤TNM分期系統(tǒng)[2]缺乏足夠的預(yù)測(cè)價(jià)值，我們可以結(jié)合一些生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)患者的生存率。缺氧誘導(dǎo)因子-1α (HIF-1α)是HIF-1基因家族的成員之一，在缺氧條件下高表達(dá)，在常氧條件下降解[3]。HIF-1α可直接調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)[4]和一氧化氮合酶(NOS)[5]等基因。VEGF在血管生成中發(fā)揮核心作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，且在不同腫瘤中都有過(guò)表達(dá)[6]，并可以靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞并促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[7-8]。本研究旨在探討HIF-1α和VEGF的表達(dá)與NSCLC患者的臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，并進(jìn)一步驗(yàn)證二者表達(dá)調(diào)控的上下游關(guān)系。

資料和方法

一、一般資料

本研究共納入2009年1月至2012年12月在山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬中心醫(yī)院胸肺外科進(jìn)行肺癌切除手術(shù)的79例患者。納入標(biāo)準(zhǔn)為：1)接受根治性手術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)為鱗癌或腺癌；2)診斷為I-IIIa期非小細(xì)胞肺癌；3)無(wú)明顯手術(shù)禁忌癥。大細(xì)胞癌和腺鱗癌因樣本太少被排除在外。表1顯示了患者的臨床病理特征。本研究由山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

二、免疫組織化學(xué)法

所有非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本均取自79例患者，以鄰近非腫瘤肺組織作為對(duì)照組織。組織標(biāo)本固定在10%中性福爾馬林緩沖液中做常規(guī)處理。將石蠟包埋組織標(biāo)本切成4 μm厚的切片，用鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶(SP)法[9]檢測(cè)組織標(biāo)本中HIF-1α和VEGF的表達(dá)。簡(jiǎn)言之，標(biāo)本切片與兔抗人HIF-1α單克隆抗體(濃度1 ∶100，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司?？贵w編號(hào)：PB0245)或兔抗人VEGF單克隆抗體(濃度1 ∶100，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司?？贵w編號(hào)：BA0407)在4°C培養(yǎng)過(guò)夜，根據(jù)廠家說(shuō)明用山羊抗兔IgG抗體(濃度1 ∶100，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司?？贵w編號(hào)：BA1003)制備二抗。用半定量免疫反應(yīng)評(píng)分系統(tǒng)(IRS)測(cè)量HIF-1α和VEGF的表達(dá)水平[9-10]。將標(biāo)本分為陰性表達(dá)(IRS0～2)和陽(yáng)性表達(dá)(IRS3～6)。

三、細(xì)胞培養(yǎng)

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299從美國(guó)組織培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)和中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所獲得。細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞融合至約80%時(shí)，除去培養(yǎng)液，PBS液漂洗3次。細(xì)胞分為3組，1組細(xì)胞加入含500 μmol/L CoCl2的DMEM 2 mL，2組加入含500 μmol/LCoCl2和200 μg/mL HIF-1α抑制劑LW6(美國(guó)Millipore公司)的DMEM混合液2 mL，3組加入含500 μmol/L CoCl2和200 μg/mL抗VEGF藥物貝伐單抗(Avastin)(購(gòu)自美國(guó)Roche公司)的DMEM混合液2 mL，均置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

四、Western blotting

將細(xì)胞置于冰上，加RIPA裂解液(加蛋白酶抑制劑)裂解提取蛋白，BCA法測(cè)定濃度，95℃加熱5 min。垂直電泳槽內(nèi)每孔內(nèi)加入約20 μL蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，洗膜后加ECL顯影，Image J軟件掃描灰度值，GAPDH為內(nèi)參對(duì)照。

五、統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 13.0分析所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。HIF-1α和VEGF表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析。采用Kaplan-Meier繪制生存曲線。采用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)比較存活率，Cox多因素回歸分析判定預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HIF-1α和VEGF的免疫組化表達(dá)情況及二者與臨床病理特征的關(guān)系

HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)主要位于胞漿和胞核中(圖1)。HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率為65.8%(52/79)。表1顯示，HIF-1α的表達(dá)與腫瘤分化程度(高41.7%vs中64.0%vs低88.2%；P<0.05)、病理淋巴結(jié)(pN(-)46.4%vspN(+) 74.5%；P<0.05)和pTNM分期(pI 47.4%vspII 62.8%vspIIIa 94.1%；P<0.05)顯著相關(guān)。

VEGF陽(yáng)性表達(dá)主要位于胞漿中(圖2)。VEGF陽(yáng)性表達(dá)率為64.6% (51/79)。表1顯示VEGF表達(dá)與pT (T135.7%vsT269.1%vsT3 80.0%;P<0.05)、病理淋巴結(jié)(pN(-)42.9%vspN(+)76.5%；P<0.01)和pTNM分期(pI 36.8%vspII 67.4%vspIIIa 88.2%;P<0.05)顯著相關(guān)。

Spearman 等級(jí)相關(guān)分析顯示HIF-1α表達(dá)與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01)。49.4% (39/79)的病例呈HIF-1α和VEGF雙陽(yáng)性表達(dá)。且與pT (T121.4%vsT250.9%vsT380.0%；P<0.05)、病理淋巴結(jié)(pN(-)17.9%vspN(+)66.7%；P<0.01)和pTNM分期(pI 15.8%vspII 48.8%vspIIIa 88.2%；P<0.01)顯著相關(guān)(表1)。

二、影響5年生存率的因素分析

本組79例非小細(xì)胞肺癌患者的5年生存率為40.5%。應(yīng)用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析顯示，分化程度(P<0.05)、pN(P<0.01)、pTNM分期(P<0.01)、HIF-1α表達(dá)(P<0.01)、VEGF表達(dá)(P<0.01)以及HIF-1α和VEGF雙重表達(dá)(P<0.01)與5年生存率顯著相關(guān)(圖3，表2)。COX多因素回歸分析顯示，分化程度、pN以及HIF-1α和VEGF雙重表達(dá)是影響5年生存率的獨(dú)立因素(表3)。

表1 HIF-1α和VEGF表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系

圖1 肺癌組織切片免疫組織化學(xué)染色，顯示缺氧誘導(dǎo)因子-1α(原始放大倍數(shù)×400)

表2 影響非小細(xì)胞肺癌患者5年生存率的單因素分析

三、LW6和Avastin對(duì)HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響

在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299中，用氯化鈷(CoCl2)處理細(xì)胞，誘導(dǎo)化學(xué)缺氧環(huán)境(1組)，用HIF-1α抑制劑LW6同時(shí)處理細(xì)胞(2組)，用VEGF抑制劑Avastin 同時(shí)處理細(xì)胞(3組)，可以看到：CoCl2誘導(dǎo)化學(xué)缺氧誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)，而LW6處理(2組)可以顯著抑制HIF-1α的表達(dá) (P<0.01)，同時(shí)VEGF的表達(dá)與1組相比也顯著下降。但Avastin 處理組(3組)與1組(缺氧組)相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明LW6作為HIF-1α抑制劑，除了可以抑制HIF-1α的表達(dá)，也能抑制VEGF的表達(dá)。而Avastin作為VEGF的抑制劑，也下調(diào)VEGF的蛋白水平，但對(duì)HIF-1α的表達(dá)也沒(méi)有明顯的影響(圖4)。

表3 非小細(xì)胞肺癌患者5年生存率的Cox回歸多因素分析

圖2 肺癌組織切片免疫組化染色顯示VEGF(原始放大倍數(shù)×400)

圖3 A：Kaplan-Meier分析術(shù)后總生存率；B：根據(jù)分化程度用 Kaplan-Meier分析術(shù)后患者的總生存率；C：根據(jù)pN(-) 和 pN(+)用 Kaplan-Meier分析術(shù)后患者的總生存率；D：根據(jù)TNM分期用 Kaplan-Meier分析術(shù)后患者的總生存率；E：根據(jù)HIF-1α表達(dá)用 Kaplan-Meier分析術(shù)后患者的總生存率；F：根據(jù)VEGF表達(dá)用 Kaplan-Meier分析術(shù)后患者的總生存率；G：根據(jù)HIF-1α和VEGF雙重表達(dá)用 Kaplan-Meier分析術(shù)后患者的總生存率

圖4 Western blot檢測(cè)顯示HIF-1α和VEGF的表達(dá)

討 論

自1999年發(fā)現(xiàn)了HIF-1α在腫瘤組織中高表達(dá)后[11]，越來(lái)越多的研究報(bào)道了HIF-1α的表達(dá)與腫瘤的臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。免疫組織化學(xué)對(duì)HIF-1α表達(dá)的評(píng)估在多種類型的癌癥中得到了廣泛的應(yīng)用[12-13]。在以前的研究中，免疫組織化學(xué)顯示，40%到80%的癌癥患者的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有HIF-1α蛋白的表達(dá)[14]。然而，不同的研究表明，不同臨床特征的肺癌組織中HIF-1α的表達(dá)趨勢(shì)不同。肺癌患者HIF-1α的表達(dá)和預(yù)后存有爭(zhēng)議[15]。Yang[16]等人通過(guò)meta分析總結(jié)了17項(xiàng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)肺癌患者HIF-1α的高表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)、分化和低生存率有關(guān)。在目前的研究中，65.8%的非小細(xì)胞肺癌組織HIF-1α表達(dá)與腫瘤分化程度(高41.7% vs中64.0% vs低88.2%；P<0.05)、病理淋巴結(jié)(pN(-)46.4%vspN(+)74.5%；P<0.05)和pTNM分期(pI 47.4%vspII 62.8%vspIIIa 94.1%；P<0.05)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌患者的5年生存率為40.5%，HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)組的5年生存率明顯低于HIF-1α陰性表達(dá)組(P<0.01)。我們的研究結(jié)果符合先前提出的結(jié)論，表明HIF-1α在非小細(xì)胞肺癌中起著重要的臨床病理作用。

研究表明，HIF-1α可以調(diào)控至少60個(gè)下游靶基因，包括VEGF[17]。作為最有效的血管生成因子之一，VEGF可介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增強(qiáng)血管通透性[18]。許多研究報(bào)道VEGF在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，這已成為肺癌治療的重要靶點(diǎn)[6,19]。本研究采用免疫組織化學(xué)方法觀察了VEGF在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示64.6%的非小細(xì)胞肺癌組織中有VEGF的表達(dá)。VEGF在腫瘤組織中的表達(dá)與pT (T135.7%vsT269.1%vsT380.0%;P<0.05)、病理淋巴結(jié)(pN(-)42.9%vspN(+)76.5%;P<0.01)和pTNM分期(pI 36.8%vspII 67.4%vspIIIa 88.2%;P<0.05)顯著相關(guān)。VEGF陽(yáng)性表達(dá)組的5年生存率明顯低于VEGF陰性表達(dá)組(P<0.01)。我們的結(jié)果表明VEGF的表達(dá)促進(jìn)了非小細(xì)胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

以往的報(bào)道大多是單獨(dú)研究HIF-1α或VEGF的表達(dá)，很少將它們結(jié)合起來(lái)研究[20-21]。Karetsi[22]等人采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)55例肺癌組織中HIF-1α和VEGF的表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)僅在肺腺癌中，T分期與HIF-1α和VEGF的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。并且HIF-1α和VEGF的表達(dá)與總生存期之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，VEGFR2是VEGF的特異性受體，兩者結(jié)合后通過(guò)一系列生物調(diào)控誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞增值，促進(jìn)腫瘤血管生長(zhǎng)。在腫瘤血管生成過(guò)程中，HIF-α/VEGF/VEGFR2通路在腫瘤血管生成中起重要作用[23]。如上所述，VEGF是HIF-α的靶基因，上調(diào)HIF-α的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤新生血管的增殖。在本研究中，癌組織中HIF-1α的表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01)。49.4%的病例HIF-1α和VEGF呈雙陽(yáng)性表達(dá)，與pT、病理淋巴結(jié)和pTNM分期顯著相關(guān)。瘤體較大組的HIF-1α和VEGF雙陽(yáng)性表達(dá)明顯高于瘤體較小組(T121.4%vsT250.9%vsT380.0%;P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(66.7%)的HIF-1α和VEGF雙陽(yáng)性表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(17.9%;P<0.01)。另外，局部晚期組的HIF-1α和VEGF雙陽(yáng)性表達(dá)明顯高于早期組(pI 15.8%vspII 48.8%vspIIIa 88.2%；P<0.01)。在對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)的單因素分析顯示，HIF-1α和VEGF雙陽(yáng)性表達(dá)組的5年生存率顯著低于陰性表達(dá)組(P<0.01)。為排除混合因素對(duì)統(tǒng)計(jì)分析的影響，采用多因素分析確定預(yù)后因素，結(jié)果顯示分化程度、pN以及HIF-1α和VEGF雙重表達(dá)是影響5年生存率的獨(dú)立因素，是預(yù)后不良的相關(guān)獨(dú)立因素。我們的數(shù)據(jù)表明，在非小細(xì)胞肺癌患者中，HIF-1α和VEGF的雙陽(yáng)性表達(dá)與轉(zhuǎn)移潛能和低生存率有關(guān)。

我們進(jìn)一步研究了HIF-1α抑制劑LW6和抗VEGF藥物Avastin對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549和H1299中HIF-1α和VEGF的影響，我們結(jié)果表明LW6可以抑制HIF-1α的表達(dá)，Avastin對(duì)HIF-1α的表達(dá)沒(méi)有明顯的影響；LW6和Avastin均可以抑制VEGF的表達(dá)。結(jié)果進(jìn)一步證明了在非小細(xì)胞肺癌中，VEGF的表達(dá)受到來(lái)自HIF-1α的調(diào)控，針對(duì)HIF-1α的抑制劑或其他干預(yù)手段可以同時(shí)抑制VEGF的表達(dá)及活性。

綜上所述，聯(lián)合檢測(cè)HIF-1α和VEGF可更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后。而開(kāi)發(fā)針對(duì)HIF-1α干預(yù)手段可能成為治療非小細(xì)胞肺癌患者的更有意義的研究方向，因?yàn)槠淇梢酝瑫r(shí)抑制VEGF引起的血管形成，當(dāng)然這還需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)和臨床研究。