動態(tài)監(jiān)測誘導痰Tc1/Tc2比值在COPD患者中的臨床價值

鄒凡 趙云峰 劉明

慢性阻塞性肺病(chronic obstructivepulmonary disease , COPD)是一種以氣流受限為特征的疾病狀態(tài)，與肺對有害顆粒或氣體，特別是香煙煙霧的異常炎癥反應有關。長期吸煙引起的炎癥被認為是慢性阻塞性肺病的重要發(fā)病機制之一。CD8+T淋巴細胞分為殺傷性T淋巴細胞(Tc)和抑制性T淋巴細胞(Ts)兩類。Tc細胞亞群包括Tc0、Tc1和Tc2，其中Tc1主要分泌IFN-γ、IL-2，不分泌IL-4，而Tc2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，不分泌IFN-γ。目前穩(wěn)定期COPD患者的研究發(fā)現(xiàn)在COPD炎癥進展過程中Tc2細胞具有保護作用，Tc1細胞具有破壞作用，穩(wěn)定期COPD患者存在Tc1/Tc2失衡。但對于急性加重期的COPD患者是否存在Tc1/Tc2失衡以及香煙煙霧對Tc1/Tc2平衡的影響，并未深入研究。本研究動態(tài)監(jiān)測誘導痰中Tc1/Tc2比值及相關指標，探討其在COPD患者中的臨床價值。

資料與方法

一、一般資料

本研究是一項前瞻性隊列研究，納入2018年7月至2019年8月上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院呼吸內(nèi)科病房收治的COPD(C級、D級)患者90例，其中男性64例，女性26例，年齡50-76(中位64.8)歲。入組標準：符合2018年GOLD指南[1]中COPD診斷標準。排除標準：(1)嚴重各器官功能不全，各組織器官或者系統(tǒng)惡性腫瘤，使用免疫相關的藥品，除外合并相關的免疫缺陷疾病；(2)嚴重肺間質(zhì)纖維化疾病，存在嚴重的組織器官感染；(3)近期發(fā)生過心肌梗死、腦卒中，近期進行過重大的手術等；(4)近期患有傳染性疾病，或傳染性疾病恢復期；(5)其他研究者認為不宜納入的特殊人群。所有入組患者均簽署知情同意書，本研究已通過上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院倫理委員會批準。

二、分組

根據(jù)吸煙狀態(tài)不同，將COPD患者分為三組，不吸煙者為A組，戒煙者為B組，吸煙者為C組，每組各30例，A組男18例，女12例，中位年齡為67.5歲；B組男22例，女8例，中位年齡為64.8歲；C組男24例，女4例，中位年齡62.2歲。并隨機選取10名健康者(不吸煙)作為正常對照組(D組)，四組研究對象在年齡、性別方面差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。A、B、C三組患者給予吸氧、抗感染、平喘及其他對癥治療。動態(tài)監(jiān)測每組研究對象在入院時、出院時、出院6個月、出院12月的誘導痰中CD8+T淋巴細胞百分比、TC1/TC2比值以及肺功能，并記錄入組患者1年內(nèi)急性加重次數(shù)。

三、研究方法

1 誘導痰采用國際標準的誘導痰方法[2]，合格的痰標本標準：涂片檢查每低倍鏡視野見白細胞>25個，鱗狀上皮細胞<10個，無唾液成分的痰液重量>1 g。如果細胞存活率低于50%和/或鱗狀細胞污染超過20%，則認為標本不合格。痰液標本至少2 mL，加入0.1%二硫蘇糖醇(Sigma, USA)，然后加入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。 混合溶液進行過濾離心，得到的細胞再次溶于PBS中并準備進行下一步檢測。

2 誘導痰中TC1與TC2檢測 嚴格按照流式細胞儀的操作流程，應用流式細胞儀(Gallios機型，Beckman公司)檢測，擴增細胞的操作是在37℃加濕環(huán)境下5小時，利用蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑布雷非德菌素A(Enzo Life Sciences)里面加入佛波豆蔻醋酸25 ng/ml (Enzo Life Sciences; PA, USA) 和離子霉素1 μg/ml (Enzo Life Sciences) 進行細胞擴增。利用擴增完后的細胞進行處理固定，采用抗IFN-藻紅蛋白-7和抗IL-4-藻紅蛋白鼠抗人抗體(eBiosciences)對細胞進行染色，用Kaluza軟件分析，結果用CD8+T淋巴細胞的百分比以及Tc1/Tc2的比值進行表示。分泌IFN-γ的CD8+T淋巴細胞為Tc1細胞，分泌IL-4的CD8+T細胞為Tc2細胞。

四、統(tǒng)計學處理

結 果

一、隨訪期間各相關指標的比較

各組時間點測量值進行球行檢驗，P>0.05，滿足“球?qū)ΨQ”假設，目前國外研究也顯示Tc1/Tc2比值等值與時間長短并未顯示相關性。A、B、C組研究對象誘導痰中CD8+T淋巴細胞百分比、Tc1/Tc2比值、FEV1%的比值與D組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。A、B、C三組研究對象組間比較：三組入院時、出院時、隨訪1年后誘導痰CD8+T淋巴細胞百分比、Tc1/Tc2比值均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。A、B、C組研究對象組內(nèi)比較：各組入院時誘導痰CD8+T淋巴細胞百分比、Tc1/Tc2比值均高于出院時和隨訪1年后，而各組入院時FEV1%低于出院時和隨訪一年后，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。A組與B組的FEV1%值在各時間點比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，C組的各時間點的FEV1%值低于A組與B組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1)。以上誘導痰中的數(shù)值均來源流式細胞分析(見圖1、2)。

圖1 流式細胞儀分析入院時各組誘導痰中Tc1/Tc2比值

圖2 流式細胞儀分析出院時各組誘導痰中Tc1/Tc2比值

表1 4組研究對象誘導痰中相關指標及肺功能的比較

二、相關性分析

隨訪1年，A、B、C三組研究對象急性加重次數(shù)統(tǒng)計分析：數(shù)值范圍(2～5次)，整體數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，A組：2.82±0.81次，B組：3.36±1.24次，C組：4.87±1.18次，兩兩比較均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。A、B、C三組研究對象誘導痰中的Tc1/Tc2比值與FEV1%以及1年內(nèi)急性加重次數(shù)的相關性研究顯示：誘導痰中Tc1/Tc2比值與FEV1%呈負相關(P<0.05)，與COPD患者1年內(nèi)急性加重次數(shù)呈正相關(P<0.05)(見表2)。

討 論

COPD是一種具有不完全可逆的氣流受限、進行性進展的慢性炎癥性疾病，可累及到氣道、肺實質(zhì)和肺血管。吸煙是公認的引起COPD最重要的危險因素之一，香煙煙霧可以引起組織慢性炎癥反應外，還可以使蛋白水解酶的活力增強、氧化應激水平增高、氣道上皮細胞凋亡與增生的失衡[3-5]。

CD8+T淋巴細胞介導肺組織細胞死亡和組織損傷，在肺組織的炎癥反應中，誘導痰中的指標較血液樣本更準確以及重復性更好。在某些免疫炎癥指標的檢測中，肺泡灌洗液和血液樣本會因為緩沖液等的稀釋，誘導痰中的相關炎癥指標較前兩者高3～5倍。另外細胞學檢測中，相較于全身來源的血液樣本，誘導痰受相關炎癥介導激活的有效細胞更高[6]。目前國內(nèi)外已經(jīng)出現(xiàn)一些對于穩(wěn)定期COPD患者誘導痰中相關炎癥指標的研究，但急性期以及動態(tài)監(jiān)測CD8+T淋巴細胞水平則罕有報道。Anders Andersson等關于吸煙與COPD患者CD8+分子的相關研究中顯示[7]：吸煙的COPD患者較非吸煙的COPD患者激活更多的CD8+T淋巴細胞。Cheng的研究也顯示[8]：COPD患者的血液樣本中CD8+T淋巴細胞的量與肺通氣功能成負相關，CD8+T淋巴細胞在肺組織的浸潤是一個全身性的炎癥活動，而不僅僅存在于呼吸氣道中。我們的研究顯示：A、B、C三組研究對象組內(nèi)比較時誘導痰中CD8+T淋巴細胞百分比入院時明顯高于出院時、出院6個月及出院12個月。CD8+T淋巴細胞反映了COPD患者的炎癥水平，介導了COPD氣道炎癥損傷的病理過程[9-10]，我們的研究結果與國外的研究結果一致。另外，在不同吸煙狀態(tài)下的COPD患者誘導痰中CD8+T淋巴細胞百分比數(shù)據(jù)比較中發(fā)現(xiàn)，C組患者氣道炎癥水平明顯高于A組、B組，說明在煙霧的刺激下，吸煙的COPD患者處于更高的CD8+T淋巴細胞介導的炎癥免疫狀態(tài)，對于氣道、肺組織產(chǎn)生破壞，并在呼吸道感染等因素影響下，介導更嚴重的炎癥反應。

表2 3組患者誘導痰Tc1/Tc2比值與有關指標的相關性分析

CD8+T淋巴細胞在COPD患者氣道炎癥中起著重要的作用。CD8+Tc的兩個亞型為Tc1(產(chǎn)生IFN-γ)和Tc2(產(chǎn)生IL-4)，國外研究發(fā)現(xiàn)[11]：穩(wěn)定期和急性期COPD患者中促炎CD8+T淋巴細胞以Tc1細胞為主，均高于健康非吸煙患者，而Tc2細胞在穩(wěn)定期COPD患者中顯著減少，吸煙能開啟激活和擴增CD8+T淋巴細胞的“扳機點”。日本學者Toshihiro Shirai等[12]對穩(wěn)定期COPD患者進行研究，結果顯示：在COPD炎癥進展過程中Tc2細胞具有保護作用，Tc1細胞具有破壞作用。Forsslund的研究更是指出[13]：吸煙能誘導降低Tc2細胞的表達水平。吸煙促進COPD患者的炎癥加重，導致破壞性細胞增多與保護性細胞減少。COPD患者存在Tc1/Tc2細胞失衡，且是以Tc1爆發(fā)為主的慢性炎癥性疾病。我們的研究顯示：A、B、C組患者入院時，誘導痰CD8+T淋巴細胞百分比、Tc1/Tc2比值均高于出院時以及1年內(nèi)各隨訪時間節(jié)點上數(shù)值，COPD的急性加重期與穩(wěn)定期存在Tc1與Tc2兩種細胞的不平衡分化，C組入院時CD8+T淋巴細胞百分比、Tc1/Tc2比值高于A組、B組，說明不同吸煙狀態(tài)下的COPD患者氣道也存在Tc1/Tc2失衡，這種免疫狀態(tài)的不協(xié)調(diào)導致機體在抗擊外來病原體的同時損傷了自身的組織細胞，大量Tc1細胞在肺和氣道黏膜的局部聚集可能導致持續(xù)性慢性炎癥。

Cheng[8]的研究顯示香煙煙霧促進了CD8+T淋巴增殖并抑制其凋亡，同時促進調(diào)節(jié)T細胞的增殖和凋亡，其作用效果可以被毒蕈堿激動劑和拮抗劑所模擬。吸煙的作用類似于反復的病毒感染或其他的急性加重原因誘發(fā)或直接導致COPD患者的急性加重[14]。我們的研究顯示：C組患者的FEV1%明顯低于A組和B組，而急性加重次數(shù)則高于其他組。不同的吸煙狀態(tài)影響COPD患者的通氣功能以及急性加重次數(shù)。我們將誘導痰Tc1/Tc2比值與COPD患者肺功能指標及1年內(nèi)急性加重次數(shù)進行相關性分析顯示：誘導痰中Tc1/Tc2比值與患者的肺功能FEV1%呈負相關，與COPD患者1年內(nèi)急性加重次數(shù)呈正相關性。COPD患者誘導痰中Tc1/Tc2比值增大、出現(xiàn)失衡能對COPD患者通氣功能以及病情嚴重程度具有一定的預測作用。

綜上所述，吸煙導致COPD患者氣道呈現(xiàn)高的炎癥水平，誘導痰中Tc1/Tc2失衡可能與COPD患者急性加重相關，可能作為一種新的生物學標記物用來評估COPD患者病情嚴重程度。本研究不足之處為單中心、小樣本的臨床研究，今后還需進一步設計擴大樣本量、干預性的試驗，并開展多中心、隨機、雙盲的對照研究，以進一步探討誘導痰Tc1/Tc2失衡影響COPD患者急性加重的確切關系及內(nèi)在機制。