EB病毒與膽囊癌的關(guān)系研究進(jìn)展

冉燕翠，楊翠紅，鄭春燕，孫秀威

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，哈爾濱1500810

膽囊癌是最常見的惡性膽道腫瘤，在世界范圍內(nèi)占惡性膽道腫瘤的80%～95%[1-2]，其發(fā)病隱匿，早期診斷率僅為19.1%，惡性程度高，預(yù)后差，總體5年生存率低于5%，中位生存期＜6個(gè)月[3]。目前手術(shù)治療仍然是治愈原發(fā)性膽囊癌的唯一方法，但僅有20%～30%的患者能夠獲得根治性切除。研究表明，炎癥與腫瘤之間關(guān)系密切，是誘發(fā)膽囊癌的重要因素[4]。90%的成人血清中可檢測到EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）抗體，全球1%的惡性腫瘤與EBV有關(guān)[5]。本文就EBV與膽囊癌的關(guān)系作一綜述。

1 EB V

1964年，Epstein和Barr通過電子顯微鏡在Burkitt淋巴瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了第一種與人類腫瘤相關(guān)的病毒——EBV。EBV又稱人類皰疹病毒4型，屬于皰疹病毒科的γ亞科，形態(tài)與其他皰疹病毒相似，圓形，直徑180 nm，基本結(jié)構(gòu)含核樣物、衣殼和囊膜三部分。核樣物為直徑45 nm的致密物，主要含長度約為172 kb的雙鏈DNA，分子量為108。EBV通過唾液傳播在成人人群中普遍存在，人群感染率高達(dá)90%，主要感染B淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞，以潛伏期和裂解期兩種形式存在于宿主細(xì)胞中[6]。EBV在宿主細(xì)胞中潛伏感染，干擾機(jī)體的免疫功能，刺激細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化并致癌。目前，已有研究證實(shí)EBV與傳染性單核細(xì)胞增多癥[7]、Burkitt淋巴瘤[8]、霍奇金淋巴瘤[9]、NK/T 細(xì)胞淋巴瘤[10]、鼻咽癌[11]、胃癌[12]、子宮頸癌[13]、甲狀腺腫瘤[14]等的發(fā)生有關(guān)。

2 EBV的致癌機(jī)制

EBV基因組是一條長度約為172 kb的雙鏈DNA，其通過EBV膜蛋白gp350與淋巴細(xì)胞受體CD21和人類白細(xì)胞抗原Ⅱ（human leukocyte antigenⅡ，HLAⅡ）相互作用進(jìn)入B淋巴細(xì)胞。通過上皮細(xì)胞膜受體分子神經(jīng)菌毛素1（neuropilin 1，NRP1）與病毒糖蛋白gB的C端（C-end rule，CendR）特殊結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，使得EBV以巨胞飲和脂筏依賴的內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入上皮細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主細(xì)胞的感染，并激活NRP1依賴的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）-胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號(hào)通路。EBV還可直接與感染的B淋巴細(xì)胞接觸進(jìn)入上皮細(xì)胞。在原發(fā)感染時(shí)，EBV在上皮細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞中復(fù)制，然后為了逃避免疫監(jiān)視，關(guān)閉大部分基因并進(jìn)入潛伏期，以靜息記憶B淋巴細(xì)胞為主要宿主[6]。潛伏感染時(shí)EBV基因主要表達(dá)6種核抗原（Epstein-Barr virus nuclear antigen，EBNA）（EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C和EBNALP）、3種潛伏膜 蛋 白（latent membrane protein，LMP）（LMP1、LMP2A和LMP2B）、2種EBV編碼的小RNA（EBER1和EBER2）和2組微小RNA（microRNA，miRNA）（BHRF1、BART）。

2.1 EBNA 1

EBNA1是唯一一種在所有EBV相關(guān)惡性腫瘤中都表達(dá)的病毒蛋白[12]。EBNA1基因是EBV基因組復(fù)制和維持的關(guān)鍵，可能是致癌基因，可改變細(xì)胞環(huán)境并促使基因組不穩(wěn)定。此外，EBNA1還可通過下調(diào)癌基因myc的表達(dá)，增強(qiáng)抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）和存活蛋白（survivin）的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，導(dǎo)致染色體畸變[15]。

2.2 EBNA 2

EBNA2對(duì)促進(jìn)轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞增殖和防止轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞凋亡具有重要意義，EBNA2還可與EBNA3C聯(lián)合，激活LMP1啟動(dòng)子。已有研究證實(shí)EBNA2的表達(dá)與腫瘤發(fā)生有關(guān)[16]。

2.3 EBNA 3

EBNA3的作用是抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的積累，降低抑癌基因人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，RB）基因的表達(dá)，穩(wěn)定癌基因c-myc的表達(dá)，并抑制促凋亡蛋白BIM的表達(dá)[17]。

2.4 LMP 1

LMP1是由BNLF1基因編碼的一種跨膜病毒蛋白，是EBV的主要致癌蛋白，是將靜止的原代B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為增殖性淋巴母細(xì)胞所必需的蛋白。LMP1是一種組成性激活的CD40受體，可激活參與記憶B淋巴細(xì)胞分化和抗凋亡蛋白表達(dá)的下游信號(hào)通路，這些下游信號(hào)通路包括核因子κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell，NF-κB）、促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/ERK、磷脂酰肌醇3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）、Notch和JAK激酶（Janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）[18]。

2.5 LMP 2

LMP2是一種親水性膜蛋白，由于起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子不同而形成兩種不同的表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)MP2A和LMP2B。研究表明，LMP2B能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞的擴(kuò)散，增強(qiáng)其能動(dòng)性[19]。LMP2A能夠通過抑制轉(zhuǎn)化 生長 因 子 -β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，激活NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)survivin及細(xì)胞周期蛋白E（cyclin E）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[20-22]。

2.6 miRNA

EBV編碼的miRNA是一種非編碼RNA，在EBV感染的細(xì)胞中大量表達(dá)，其在病毒感染、細(xì)胞凋亡、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。研究表明，促凋亡蛋白（如BIM）[23]、凋亡相關(guān)基因受體（如Bax受體TOM22）[23]、Bcl-2基因[24]、凋亡終末剪切酶胱天蛋白酶3（caspase 3）[25]是miRNA的直接靶點(diǎn)，可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。miRNA可通過抑制抑癌基因PTEN的表達(dá)和調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），影響腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[26-28]。此外，miRNA還通過激活白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號(hào)通路，下調(diào)細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑p21和p27的表達(dá)，促進(jìn)耐藥[29]。

3 EBV與膽囊癌

段建峰等[30]研究表明，35例膽囊癌患者中，EBV感染患者16例（45.7%）；35例膽囊良性疾病患者中，EBV感染患者3例（8.6%）。膽囊癌患者EBV感染的發(fā)生率高于膽囊良性疾病患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示膽囊癌與EBV感染有關(guān)，且膽囊癌和膽囊良性疾病患者EBV感染的發(fā)生率不同，為臨床診斷及治療提供了理論基礎(chǔ)。

4 以EBV為靶點(diǎn)的治療

在大部分EBV相關(guān)惡性腫瘤中，幾乎所有的腫瘤細(xì)胞內(nèi)都包含病毒基因組，同時(shí)，宿主體內(nèi)其他部位存在的EBV陽性非腫瘤細(xì)胞數(shù)量非常少，使得以EBV基因組為靶點(diǎn)治療EBV相關(guān)惡性腫瘤成為可能。目前抗EBV治療的方法主要包括藥物治療、免疫治療和病毒靶向治療。

4.1 藥物治療

目前常用的抗皰疹病毒藥物主要是嘌呤核苷類似物，如阿昔洛韋（acyclovir，ACV）、更昔洛韋（ganciclovir，GCV）和伐昔洛韋（famcyclovir，F(xiàn)CV），它們是抗病毒前體藥物。EBV在腫瘤細(xì)胞中保持潛伏感染，這些腫瘤細(xì)胞對(duì)抗皰疹病毒前體藥物不敏感。在丁酸等裂解期基因表達(dá)誘導(dǎo)劑的存在下，潛伏的EBV表達(dá)激酶，將前體藥物轉(zhuǎn)化為有活性的形式，如單磷酸化更昔洛韋（ganciclovir monophosphate，GCV-p），在病毒DNA復(fù)制時(shí)，三磷酸化更昔洛韋（ganciclovir triphosphate，GCV-TP）可以競爭性地結(jié)合到病毒DNA鏈上，使聚合酶鏈反應(yīng)終止，細(xì)胞周期停滯，最終導(dǎo)致被EBV感染的細(xì)胞凋亡[31]。

4.2 免疫治療

隨著研究者對(duì)EBV相關(guān)惡性腫瘤發(fā)生機(jī)制的不斷探索，免疫治療成為EBV相關(guān)惡性腫瘤治療的新方向。腫瘤免疫治療包括腫瘤疫苗、過繼性免疫治療、免疫檢查點(diǎn)抑制劑等。

4.2.1 腫瘤疫苗 腫瘤疫苗是指用無致瘤性但有抗原性的瘤苗誘導(dǎo)患者產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的一種主動(dòng)免疫，包括預(yù)防性疫苗和治療性疫苗。1976年Epstein[32]首先提出采用疫苗預(yù)防EBV相關(guān)惡性腫瘤或降低其發(fā)病率。目前大多數(shù)研制預(yù)防性疫苗的工作都集中在EBV gp350上，因?yàn)镋BV通過gp350與CD21結(jié)合感染細(xì)胞，同時(shí)gp350是EBV和被感染細(xì)胞中最豐富的糖蛋白，也是產(chǎn)生中和性抗體抵御病毒感染的首要靶標(biāo)[33]。一項(xiàng)Ⅰ/Ⅱ期臨床研究表明，應(yīng)用病毒糖蛋白gp350重組體制作的EBV疫苗可誘導(dǎo)人類產(chǎn)生中和抗體[34]。Sokal等[35]研究表明，疫苗能夠減少與EBV相關(guān)的疾病的發(fā)生，但不一定能預(yù)防感染。治療性疫苗的作用是誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。輸注EBV特異性T淋巴細(xì)胞可延長霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和鼻咽癌患者的生存期，這為治療性疫苗的應(yīng)用提供了證據(jù)。Smith等[36]應(yīng)用EBV特異性自體T淋巴細(xì)胞治療鼻咽癌轉(zhuǎn)移患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接受細(xì)胞治療患者的中位總生存期明顯長于未接受細(xì)胞治療的患者。另有一項(xiàng)研究納入35例鼻咽癌患者，所有患者均接受化療和EBV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（Epstein-Barr virus specific cytotoxic T lymphocyte，EBV-CTL）治療，其有效率為71%，2年和3年生存率分別為63%和37%[37]。因此，一種能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生EBV特異性T淋巴細(xì)胞的疫苗可能會(huì)提高EBV相關(guān)腫瘤患者的生存率。由此推測，EBV疫苗可能在EBV陽性膽囊癌患者的預(yù)防與治療中具有重要作用。

4.2.2 過繼性免疫治療過繼性免疫治療是指從腫瘤患者體內(nèi)分離出有活性的免疫細(xì)胞，在體外經(jīng)篩選及擴(kuò)增后誘導(dǎo)產(chǎn)生高度特異性的具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞，再將其回輸給患者，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。EBV相關(guān)惡性腫瘤中可表達(dá)EBNA、LMP、EBER等病毒蛋白，它們均可作為EBV-CTL治療的靶抗原，且EBV-CTL的抗腫瘤效應(yīng)已經(jīng)得到證實(shí)[38]。假設(shè)部分膽囊癌與EBV的感染有關(guān)，應(yīng)用EBV-CTL治療膽囊癌理論上會(huì)取得一定的療效。但目前國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較為罕見，需經(jīng)研究證實(shí)。

4.2.3 免疫檢查點(diǎn)抑制劑免疫治療是最近十年針對(duì)腫瘤治療的重大突破之一。免疫治療的目的在于發(fā)生免疫反應(yīng)時(shí)，機(jī)體能保持自我耐受和防止組織受損。腫瘤細(xì)胞可利用免疫檢查點(diǎn)的激活來逃避免疫監(jiān)視。通過封鎖免疫檢查點(diǎn)，重建正常的抗腫瘤免疫系統(tǒng)是一種新型、有前景的治療腫瘤的方法[39]。目前的研究中效果最顯著的是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4）、程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）及程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）免疫檢查點(diǎn)，免疫檢查點(diǎn)抑制劑能重新激活抗腫瘤免疫，促進(jìn)腫瘤消退。許多臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，在實(shí)體腫瘤中利用免疫檢查點(diǎn)抑制劑阻斷CTLA4/PD-1/PD-L1信號(hào)通路可以獲得良好的療效和安全性[40-43]。目前CTLA4單克隆抗體伊匹單抗（ipilimumab）已被美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于治療不可切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，PD-1抑制劑派姆單抗（pembrolizumab）和納武單抗（nivolumab）已被FDA批準(zhǔn)用于治療晚期黑色素瘤和轉(zhuǎn)移性肺鱗癌。研究表明，EBV感染的鼻咽癌患者腫瘤組織中CTLA4、PD-1及PD-L1的表達(dá)水平均明顯高于非腫瘤組織，且與患者預(yù)后有關(guān)[44]。目前尚不清楚CTLA4、PD-1及PD-L1在EBV相關(guān)的膽囊癌中的表達(dá)情況，有待進(jìn)行此方面的研究。

4.3 病毒靶向治療

在大多數(shù)EBV相關(guān)惡性腫瘤中，絕大部分腫瘤細(xì)胞都含有病毒基因組，而在正常組織中EBV感染率極低，這種腫瘤特異性為研究治療策略提供了理論依據(jù)。在EBV感染的裂解階段，EBV感染的細(xì)胞中胸苷酸激酶可將前體藥物GCV轉(zhuǎn)化為有活性的細(xì)胞毒性形式?；钚訥CV可干擾病毒和宿主DNA聚合酶的合成，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制的終止，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這使得EBV暴露于宿主免疫監(jiān)測中，并且磷酸化的GCV可以轉(zhuǎn)移到相鄰的細(xì)胞中，從而誘導(dǎo)其他EBV陽性腫瘤細(xì)胞的凋亡[45]。因此，在EBV陽性的腫瘤細(xì)胞中，誘導(dǎo)EBV進(jìn)入裂解周期可能成為治療EBV相關(guān)腫瘤的一種新方法。目前，佛波酯（如TPA）、丁酸鈉（sodium butyrate，SB）[46]、曲古抑菌素 A（trichostatin A，TSA）[47]、5-氮雜胞苷（5-azacytidine，5-aza）[48]是誘導(dǎo)EBV裂解基因表達(dá)的常用藥物。TPA是蛋白激酶C的激動(dòng)劑，可促進(jìn)BZLF1和BRLF1基因轉(zhuǎn)錄因子的激活[49]，表觀遺傳抑制劑（如SB、TSA和5-aza）可以在BZLF1和BRLF1基因的啟動(dòng)子處打開染色質(zhì)，TPA與表觀遺傳抑制劑聯(lián)合使用可誘導(dǎo)EBV進(jìn)入裂解周期。特定的抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)EBV裂解復(fù)制，并使腫瘤細(xì)胞對(duì)核苷類抗病毒藥物敏感。亞色胺苯胺羥肟酸是一種組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑 ，可通過干擾BZLF1和BRLF1基因沉默促進(jìn)EBV的重新激活，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，而GCV增強(qiáng)了其在體外和荷瘤裸鼠體內(nèi)殺死EBV陽性淋巴瘤細(xì)胞的能力[50-51]。部分凋亡誘導(dǎo)劑如吉西他濱、多柔比星、依托泊苷和淫羊藿苷，可誘導(dǎo)EBV的重新激活，吉西他濱和多柔比星可激活BZLF1和BRLF1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。另外，PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路也參與了誘導(dǎo)EBV的裂解和復(fù)制。研究表明，依托泊苷可引起Akata細(xì)胞中EBV的重新激活[52]。另有研究表明，淫羊藿苷可通過抑制LMP1介導(dǎo)的AKT/STAT3信號(hào)通路，誘導(dǎo)EBV裂解基因的表達(dá)[53]。研究表明，利妥昔單抗和地塞米松聯(lián)合作用于EBV陽性和CD20陽性的淋巴瘤細(xì)胞時(shí)，EBV早期抗原的表達(dá)量明顯增加，可以誘導(dǎo)EBV從潛伏期進(jìn)入裂解期，然后聯(lián)合抗皰疹病毒藥物（如GCV），可以達(dá)到較好的抗腫瘤效果[54]。Tikhmyanova等[55]在66 840個(gè)小分子化合物中發(fā)現(xiàn)了5種四氫咔唑衍生物，被稱為C09、C50、C53、C60、C67，它們能夠有效地激活各種類型細(xì)胞中潛在的EBV，這5種化合物與GCV聯(lián)合應(yīng)用顯示了病毒靶向治療的前景。Choi等[56]對(duì)50 240種小分子有機(jī)化合物進(jìn)行了高通量篩選，以確定EBV陽性上皮惡性腫瘤中EBV裂解周期的最強(qiáng)誘導(dǎo)劑。因此，誘導(dǎo)EBV裂解藥物聯(lián)合抗皰疹病毒藥物（如GCV）的應(yīng)用已被認(rèn)為是治療EBV陽性腫瘤的一種新策略，這為EBV相關(guān)性膽囊癌的治療提供了一個(gè)新的治療思路。目前國內(nèi)有關(guān)病毒靶向治療與EBV相關(guān)性膽囊癌的研究尚不多見，需要大量研究證實(shí)。

5 小結(jié)與展望

EBV相關(guān)惡性腫瘤是世界范圍內(nèi)一個(gè)重要的健康問題，在東南亞和中國的發(fā)病率較高。膽囊癌是最常見的惡性膽道腫瘤，其惡性程度高，預(yù)后差。目前國內(nèi)外有關(guān)EBV與膽囊癌關(guān)系的研究較少，只證實(shí)部分膽囊癌患者存在EBV感染，但EBV是獨(dú)立的致癌因素，還是在其他高危致癌因素下促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，以及其具體的致癌機(jī)制尚待深入研究。免疫治療及病毒靶向治療在EBV相關(guān)惡性腫瘤的治療中具有較好的前景，也許能為膽囊癌的治療提供新的思路，從而提高患者的生存率，改善患者的生活質(zhì)量。