HPLC-DAD 法同時測定益腎健骨丸中5 種成分

王雪梅，劉校栓，王寶才，李喜香，李盛華，戴 剛

（甘肅省中醫(yī)院，甘肅蘭州 730000）

益腎健骨丸是甘肅省中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由當(dāng)歸、枸杞子、蘇木、丹參、白芍、生地黃、秦艽、女貞子、土鱉蟲等18 味中藥組成，方中酒茱萸、鎖陽溫補(bǔ)腎陽；枸杞子、女貞子、生地黃滋補(bǔ)腎陰，填精益髓；龍骨、牡蠣平肝潛陽，收斂固澀而益腎；蘇木、丹參、土鱉蟲活血化瘀，通絡(luò)止痛；秦艽祛風(fēng)通絡(luò)；當(dāng)歸、杭白芍平肝健脾養(yǎng)血，諸藥合用，共奏補(bǔ)益肝腎、固本強(qiáng)筋、壯骨蠲痹功效，用于治療腎虛型膝骨性關(guān)節(jié)炎，療效顯著［1］。

復(fù)方制劑藥效是組方藥物多成分共同作用的結(jié)果，僅靠單一指標(biāo)含量難以客觀評價其質(zhì)量，而多指標(biāo)測定更為適合［2］。前期有報(bào)道采用HPLC 法對芩龍降壓膠囊中龍膽苦苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷，以及益經(jīng)顆粒中阿魏酸、芍藥苷、毛蕊花糖苷進(jìn)行定量分析［3-4］，故本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-DAD 法同時測定益腎健骨丸中龍膽苦苷、馬錢苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷的含量，以期為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高和完善提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent Technologies 公司）；360EP 型、125SM 型電子天平（德國Satorius 公司）；LA753 型實(shí)驗(yàn)室純化水機(jī)（上海威立雅水務(wù)設(shè)備安裝工程有限公司）；SB-320DTDN 型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 龍膽苦苷（批號110770-201716，純度97.1%）、馬錢苷（批號111640-201706，純度99.2%）、芍藥苷（110736-201337，純度95.7%）、阿魏酸（批號110773-20614，純度99.0%）、毛蕊花糖苷（111530-201310，純度92.5%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。益腎健骨丸（40 g／瓶，批號191201、191202、191203），由甘肅省中醫(yī)院制劑中心制備。甲醇為色譜純（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；磷酸、甲醇等試劑為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水（LA753 型實(shí)驗(yàn)室純化水機(jī)制備）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取龍膽苦苷、馬錢苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷對照品適量，甲醇制成每1 mL 分別含五者1.272、1.180、1.605、0.413、1.155 mg 的貯備液，精密吸取適量，置于同一10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得（每1 mL 分別含五者381.60、35.40、240.75、12.375、34.65 μg）。

2.1.2 供試品溶液 取丸劑適量，研細(xì)，精密稱取5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，密塞，超聲（220 W、40 kHz）處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按照處方工藝，制得缺秦艽、山茱萸、白芍、當(dāng)歸、生地黃的陰性樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～20 min，14% A；20～30 min，14%～20%A；30～44 min，20%～22%A；44～54 min，22%～32%A；54～66 min，32%～40%A；66～70 min，40%～42% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長230 nm（0～55 min，龍膽苦苷、馬錢苷、芍藥苷）、330 nm（55～70 min，阿魏酸、毛蕊花糖苷）；進(jìn)樣量10 μL。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分均能達(dá)到基線分離（分離度＞1.5），陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下貯備液適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容，制成分別含龍膽苦苷 63.6、127.20、254.40、381.60、508.80、636.00 μg／mL，馬錢苷5.90、11.80、23.60、35.40、47.20、59.00 μg／mL，芍藥苷40.125、80.25、160.50、240.75、321.00、401.25 μg／mL，阿魏酸 2.062 5、4.125、8.250、12.375、16.500、20.625 μg／mL，毛蕊花糖苷5.775、11.55、23.10、34.65、46.20、57.75 μg／mL的對照品溶液，分別精密吸取10 μL，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.4”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度對照品溶液適量，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測定6 次，測得高質(zhì)量濃度下龍膽苦苷、馬錢苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷峰面積RSD分別為0.45%、0.86%、0.72%、0.94%、1.07%，中質(zhì)量濃度下分別為0.98%、1.23%、1.09%、1.28%、1.36%，低質(zhì)量濃度下分別為1.67%、1.88%、1.54%、1.92%、2.03%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取丸劑（批號191201）適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、4、8、12、16、24 h 在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得龍膽苦苷、馬錢苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷峰面積RSD 分別為0.65%、1.48%、0.87%、1.76%、0.94%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批丸劑（批號191201）6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得龍膽苦苷、馬錢苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷峰面積RSD 分別為 1.28%、2.23%、2.52%、1.07%、2.06%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的丸劑（批號191201）適量，研細(xì)，精密稱取粉末2.5 g，共6 份，置于具塞錐形瓶中，按100%水平精密加入“2.1.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

2.9 樣品含量測定 取3 批丸劑適量，每批3 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表3 各成分含量測定結(jié)果（μg／g， n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（μg／g， n＝3）

3 討論

秦艽中含有大量龍膽苦苷，具有保肝、益肝、抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理作用［5］；酒茱萸中馬錢苷在抗血栓、抗炎、抗氧化應(yīng)激損傷等方面都有顯著活性［6］；芍藥苷作為白芍主要有效成分，具有補(bǔ)血、抗抑郁、鎮(zhèn)痛、解痙等功效［7］；當(dāng)歸成分阿魏酸具有抗血小板聚集、增強(qiáng)前列腺素活性、鎮(zhèn)痛緩解血管痙攣等活性［8］；毛蕊花糖苷是熟地黃特有藥效成分，具有很強(qiáng)的抗炎、抗氧化作用，并可調(diào)節(jié)骨代謝［9-10］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇龍膽苦苷、馬錢苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷作為含量測定指標(biāo)成分。

5 種成分紫外吸收波長的差異較大［11］，分別為龍膽苦苷254 nm、馬錢苷240 nm、芍藥苷230 nm、阿魏酸316 nm、毛蕊花糖苷334 nm。為了使這些成分在一次進(jìn)樣中同時得到測定，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定230、330 nm 檢測通道，可有效得到分離。

本實(shí)驗(yàn)首先考察了甲醇-0.1% 磷酸、甲醇-0.2%磷酸，最終確定后者作為流動相，此時各成分分離效果最佳，峰型較好。再考察了柱溫25、30 ℃，發(fā)現(xiàn)龍膽苦苷、馬錢苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷在2 種柱溫下的分離效果和峰型均較好，但芍藥苷僅在25 ℃下峰型理想，故選擇柱溫為25 ℃。