水產(chǎn)動(dòng)物副溶血性弧菌的拮抗菌研究進(jìn)展

馮艷琴， 萬夕和， 沈 輝*， 李吉云， 蔣 葛， 喬 毅

(1. 江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007；2. 江蘇海洋大學(xué) 海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港 222000；3. 南京師范大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210000)

病害是制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素之一，我國每年因病害導(dǎo)致的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億元。水生動(dòng)物病原主要包括病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲等，其中細(xì)菌感染是影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的最重要因素之一[1]。在水產(chǎn)致病細(xì)菌中，副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)是水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物最常見的致病菌之一，主要來源于魚、蝦、蟹、貝、藻和其他水產(chǎn)品，能引起水生動(dòng)物潰瘍、炎癥、死亡等。副溶血性弧菌是一種革蘭陰性菌，呈弧狀、桿狀、絲狀等多種形狀，無芽胞，是食源性致病菌，可導(dǎo)致食物中毒并引起諸如急性腹痛和腹瀉等癥狀[2]。近年來，一種新的病原菌可引起對(duì)蝦急性肝胰腺壞死綜合癥(Acute hepatopancreas necrosis disease，AHPND)，經(jīng)鑒定為一類攜帶priA和priB毒力基因的副溶血性弧菌，該病原菌造成泰國、中國、越南等對(duì)蝦主產(chǎn)國的對(duì)蝦產(chǎn)量減半，已成為全球?qū)ξr產(chǎn)業(yè)的重要疾病之一[3-4]。目前，針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的防治方法主要有抗生素、噬菌體、中草藥和拮抗菌等，不同方法具有不同的優(yōu)勢(shì)，也各自具有一定的局限性。如抗生素的不合理使用不僅易引發(fā)細(xì)菌耐藥性，還會(huì)導(dǎo)致藥物殘留，降低養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫力，破壞水環(huán)境中微生物的生態(tài)平衡[5]；噬菌體的裂解較窄，殺菌廣譜性較弱，并且存在一定的耐受性；中草藥的治療效果較為緩慢，且使用成本較高。與以上方法相比，拮抗菌具有高效、低風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)，利用其分泌的特殊代謝物質(zhì)或改變環(huán)境條件抑制或殺滅有害微生物已經(jīng)得到了廣泛研究和應(yīng)用[6-7]。本文就副溶血性弧菌目前拮抗菌的種類、篩選拮抗菌常用的方法、拮抗菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)種類、拮抗作用機(jī)制和發(fā)展應(yīng)用前景進(jìn)行綜述，以期為水產(chǎn)動(dòng)物副溶血性弧菌拮抗菌的研究提供參考。

1 副溶血性弧菌拮抗菌主要種類

在生態(tài)系統(tǒng)中，微生物之間存在著非常復(fù)雜的相互作用，常見的有種間共處、互生、共生、拮抗、競(jìng)爭(zhēng)、寄生和捕食等。當(dāng)一種微生物能夠產(chǎn)生某種特殊的代謝產(chǎn)物或改變環(huán)境條件以抑制甚至殺死另一種微生物時(shí)被稱為拮抗菌[7]。自然界中拮抗菌和拮抗作用無處不在，水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中通常利用有益微生物對(duì)病原菌進(jìn)行抑制及疾病防控[8]。副溶血性弧菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中常見的病原菌，關(guān)于該菌的拮抗菌有較多研究，主要集中在芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、交替單胞菌屬(Alternomonas)、假單胞菌(Pseudomonas)、光合細(xì)菌(Photosyntheticbacteria)、海洋放線菌(Marineradiobacterium)以及乳酸菌(Lactobacillus)等[9-10]。

1.1 芽胞桿菌

芽胞桿菌是一類能形成芽胞的桿菌或球菌，革蘭陽性，廣泛分布于土壤、水體、空氣及動(dòng)物腸道中。相關(guān)研究表明，芽胞桿菌科(Bacillus)下多種細(xì)菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病的預(yù)防和控制都有重要意義，其中對(duì)副溶血性弧菌有良好拮抗效果的菌種有枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)、短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)及莫海威芽胞桿菌(Bacillusmojavensis)等。芽胞桿菌可形成抗逆性強(qiáng)的芽胞、產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)[11]、多肽、分泌揮發(fā)性脂肪酸(如乙酸、丙酸等)，具有很強(qiáng)的抑制革蘭陽性菌和陰性菌的能力[12]，部分菌株還可產(chǎn)生抗菌蛋白質(zhì)和抗生素，抑制和殺滅病原菌[13]。

自1986年以來，相關(guān)拮抗菌的研究就已有報(bào)道，Kozasa[14]從土壤中分離1株芽胞桿菌，發(fā)現(xiàn)對(duì)日本鰻鱺病原菌具有明顯的抑制作用。Balczar等[15]從凡納濱對(duì)蝦腸道分離到對(duì)副溶血性弧菌有拮抗作用的枯草芽胞桿菌UTM126，該拮抗菌對(duì)溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)和哈氏弧菌(Vibrioharveyi)也有明顯的拮抗作用。楊勝遠(yuǎn)等[16]篩選出1株枯草芽胞桿菌JNT02，在改良蘭迪培養(yǎng)基中24 h可完全殺滅共培養(yǎng)的副溶血性弧菌，其培養(yǎng)液的抗菌物質(zhì)對(duì)其拮抗作用有累積效應(yīng)。鄧書香[17]篩選出1株地衣芽胞桿菌，對(duì)副溶血性弧菌有良好的拮抗作用，可用于拮抗菌制劑的開發(fā)。同樣，韋露等[18]研究發(fā)現(xiàn)短小芽胞桿菌B1對(duì)副溶血性弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌等勻有顯著的拮抗作用，共培養(yǎng)試驗(yàn)顯示，加入等量短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)B1無菌上清液可顯著抑制副溶血性弧菌的生長(zhǎng)。劉雪飛[13]通過分離、篩選和鑒定，獲得2株對(duì)副溶血性弧菌有拮抗作用的潛在益生菌——短小芽胞桿菌和莫海威芽胞桿菌(Bacillusmojavensis)，兩株拮抗菌均能分泌胞外酶，且抗菌譜廣，抑菌試驗(yàn)表現(xiàn)出良好的效果。

1.2 假交替單胞菌

假交替單胞菌是一類海洋細(xì)菌，為革蘭陰性菌，廣泛分布于深海，常附著于海洋高等動(dòng)植物體表或體內(nèi)，該屬菌有菌毛和微莢膜，不形成芽胞，大部分能夠產(chǎn)生多種具有較強(qiáng)的蛋白酶活性的胞外活性物質(zhì)，也是重要的益生菌之一。相關(guān)研究表明，該菌屬中的許多菌種對(duì)副溶血性弧菌具有拮抗作用。王樹杉[19]從海水養(yǎng)殖環(huán)境分離出具有抑菌活性的細(xì)菌JG1，采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行體外拮抗試驗(yàn)并測(cè)定其抗菌譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株JG1抑菌譜較廣，對(duì)多株海水養(yǎng)殖病原弧菌和氣單胞菌(Aeromonas)有拮抗作用，經(jīng)鑒定該株菌為殺魚假交替單胞菌(Pseudoalteromonaspiscicida)。王春迪[20]針對(duì)南美白對(duì)蝦急性肝胰腺壞死癥副溶血性弧菌進(jìn)行拮抗菌篩選，篩得m8和a22兩株菌對(duì)該副溶血性弧菌有良好的拮抗作用，通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化以及測(cè)序等方法鑒定m8和a22均為假交替單胞菌。于敏[21]從大菱鲆養(yǎng)殖海水中篩選的金麗假交替單胞菌(Pseudoalteromonasflavipulchra)JG1，對(duì)多個(gè)種屬的細(xì)菌，如弧菌屬、芽胞桿菌屬等具有較強(qiáng)的抑菌活性，初步探討了菌株JG1抑菌活性物質(zhì)的合成途徑及對(duì)不斷變化的海洋環(huán)境的適應(yīng)能力，并發(fā)現(xiàn)多個(gè)與抑菌活性相關(guān)或代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因，丁質(zhì)酶、密度感應(yīng)信號(hào)分子降解酶等與抗微生物相關(guān)的編碼基因，以及對(duì)氧化壓力、重金屬的抵抗及對(duì)抗生素或其他藥物的抵抗相關(guān)的基因。

1.3 乳酸菌

乳酸菌是一類厭氧或兼性厭氧無芽胞的革蘭陽性菌，是重要的益生菌，廣泛應(yīng)用于日常生活和養(yǎng)殖生產(chǎn)中[22]。乳酸菌在生長(zhǎng)和代謝過程中可產(chǎn)生有機(jī)酸、乳酸和細(xì)菌素等代謝物質(zhì)，并滲透至致病菌細(xì)胞內(nèi)，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)；該菌株還可降低對(duì)蝦腸道的pH值，阻止和抑制有害細(xì)菌定殖，增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力[23-25]。Bussarin等[26]從高溫處理后的健康對(duì)蝦中分離到2株乳酸菌菌株，分別為腸道原著植物乳桿菌和外來乳酸短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，均對(duì)弧菌等病原菌有拮抗作用，并可作為耐熱益生菌候選菌株添加到凡納濱對(duì)蝦飼料中，能較好地降低水環(huán)境中的病原菌數(shù)量，并改善水質(zhì)。周海平等[27]使用平板稀釋抑菌圈法，研究了乳酸桿菌LH代謝產(chǎn)物對(duì)一系列致病性弧菌，包括副溶血性弧菌等具有明顯的抑制作用，在模擬養(yǎng)殖水體實(shí)驗(yàn)中取得了良好的效果。此外，乳酸桿菌具有提高動(dòng)物的免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群的功能，還能產(chǎn)生一系列維生素、各種消化酶(蛋白酶等)、Y-氨基酸、胞外多糖、共軛亞油酸，這些乳酸菌分泌物或合成的胞外產(chǎn)物，可直接為宿主提供必要的營養(yǎng)成分，促進(jìn)對(duì)蝦的生長(zhǎng)[28-30]。Chiu等[31]研究表明，投喂含植物乳桿菌(Lactobacillusplanterum)的飼料，可提高凡納濱對(duì)蝦的免疫能力和抗弧菌感染能力。文金順[29]從海南熱帶海洋環(huán)境的223株土著菌株中篩選出2株乳酸菌，在養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦拌料投喂的試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，上述乳酸菌可適應(yīng)對(duì)蝦消化道環(huán)境，對(duì)病原性弧菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，且對(duì)凡納濱對(duì)蝦無毒無害，為開發(fā)適用于凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖的熱帶土著乳酸菌制劑提供參考。

1.4 海洋放線菌

海洋放線菌是一類具有高G+C含量的革蘭陰性菌，可產(chǎn)生豐富的次生代謝活性產(chǎn)物[32-33]，屬于中等耐鹽菌，適于海洋環(huán)境條件。目前已發(fā)現(xiàn)的生物活性物質(zhì)多源于海洋淺海區(qū)海底沉積物中的放線菌[34-35]。海洋放線菌通過抑制弧菌菌膜形成，預(yù)防和治療因弧菌引起的對(duì)蝦病害，具有較大的應(yīng)用潛力[36]。Kesarcodi等[37]發(fā)現(xiàn)，海洋放線菌可產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，如耐熱耐干燥的孢子、維生素及酶，以抑制病原菌的增殖，還可以降解對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中淀粉和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。You等[38-39]分離的海洋放線菌中，有66.1%可裂解弧菌細(xì)胞壁，63.8%含有蛋白酶，56.5%具有酯酶可降解弧菌生物膜，這些功能可能與其分泌的蛋白質(zhì)水解酶或細(xì)菌細(xì)胞壁裂解酶有關(guān)，同時(shí)海洋放線菌可以降低蝦體中抗性基因橫向轉(zhuǎn)移機(jī)會(huì)，降低了對(duì)蝦致病微生物對(duì)抗生素的耐藥性，這在對(duì)蝦養(yǎng)殖中具有很大的應(yīng)用潛力。王書錦等[40]從遼寧近海12個(gè)地區(qū)的128個(gè)定位點(diǎn)的海水和海泥中分離到上萬株海洋放線菌，通過初步鑒定發(fā)現(xiàn)這些菌株以鏈霉菌屬為主，占分離到海洋放線菌總數(shù)的95%，多株具有抗菌活性，其中幾株對(duì)致病性弧菌等包括副溶血性弧菌有很強(qiáng)的抑制與殺滅效果。

1.5 其他拮抗菌

假單胞菌(Pseudomonas)是海水環(huán)境中常見的革蘭陰性菌，能產(chǎn)生大量的次生代謝物，可抑制包括副溶血性弧菌在內(nèi)的多種病原菌。Chythanya等[41]篩選出1株對(duì)哈氏弧菌、河流弧菌、副溶血性弧菌、美人魚弧菌和創(chuàng)傷弧菌均有抑制作用的假單胞菌I-2，經(jīng)分離鑒定，發(fā)現(xiàn)其抑菌物質(zhì)具有熱穩(wěn)定性好、溶于氯仿的特性，其活性物質(zhì)為一種耐受蛋白酶的小分子化合物。Vijayan等[42]從半咸水湖泊中分離到1株假單胞菌PS-102，該菌株能夠抑制多種蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的病原性弧菌，對(duì)其溫度、pH和鹽度的廣泛耐受研究后發(fā)現(xiàn)，該菌株具有對(duì)蝦養(yǎng)殖優(yōu)良益生菌的潛質(zhì)。李繼秋[43]從中國明對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中分離到1株煙草節(jié)桿菌(Arthrobaternicotianae)XE-7，該菌株對(duì)副溶血性弧菌、鰻弧菌和沙蠶弧菌都有明顯拮抗作用，其抑制水體弧菌的效果與氯霉素相當(dāng)，添加到飼料中能提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)率和對(duì)副溶血性弧菌的抵抗力。Balczar等[15]從凡納濱對(duì)蝦腸道中分離1株玫瑰桿菌(Roseobactergallaecienciensis)SLV03，該菌對(duì)致病性副溶血性弧菌PS-017有明顯的拮抗作用。張玲[44]從耐受白斑病毒的中國明對(duì)蝦腸道中分離到1株嗜鹽單胞菌(Halomonaas)B12，在飼料中添加7.18×1010cfu/g的嗜鹽單胞菌B12可顯著提高中國明對(duì)蝦腸道總菌數(shù)，降低腸道中弧菌數(shù)量，提高中國明對(duì)蝦幼體的成活率和對(duì)哈氏弧菌及副溶血性弧菌的抗病力，改善對(duì)蝦養(yǎng)殖水體水質(zhì)。楊世平等[45]將對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中分離到的沼澤生紅冬孢酵母(Rhodosporidiumpaludigenum)添加到凡納濱對(duì)蝦基礎(chǔ)飼料中，可顯著減少對(duì)蝦腸道內(nèi)弧菌數(shù)以及弧菌與總細(xì)菌的比例。

2 篩選拮抗菌的常用方法

目前，通常采用體外拮抗試驗(yàn)進(jìn)行拮抗工業(yè)生產(chǎn)篩選，首先在瓊脂培養(yǎng)基上共培養(yǎng)候選菌株檢測(cè)是否存在拮抗效果[37,46]。常用方法如紙片擴(kuò)散法[47-48]、牛津杯法[49]、平板打孔法等[50-51]。王文君[49]采用牛津杯法從對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘分離篩選出1株對(duì)病原菌有拮抗作用的枯草芽胞桿菌菌株，并對(duì)其進(jìn)行了體外拮抗試驗(yàn)。韋露等[18]利用平板打孔法篩選到1株無溶血性且對(duì)多株病原菌具有拮抗作用的海洋細(xì)菌短小芽胞桿菌B1。王春迪[20]采用濾紙片法篩選到1株對(duì)攜帶毒力基因PirA和PirB的副溶血性弧菌具有拮抗性的假交替單胞菌。由于紙片擴(kuò)散法簡(jiǎn)單方便，多采用該方法驗(yàn)證及篩選拮抗菌。

3 拮抗菌活性物質(zhì)的種類

自1945年報(bào)道枯草芽胞桿菌可產(chǎn)生拮抗物質(zhì)以來，研究者們已從枯草芽胞桿菌的不同菌株中分離出數(shù)十種抗菌物質(zhì)，主要有抗菌肽(bacitracin)[52]和大環(huán)脂(cycleopetite)[53-54]，是由不同成分組成的蛋白性的抗菌物質(zhì)[55]。細(xì)菌在生產(chǎn)代謝過程中有可能產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，目前研究較多的拮抗物質(zhì)為細(xì)菌素、抗生素以及細(xì)菌的次生代謝產(chǎn)物。張立娜[56]發(fā)現(xiàn)1株具有抑菌效果的拮抗菌——蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)，其在生長(zhǎng)代謝過程中分泌的胞外抑菌物質(zhì)包括生物表面活性劑、肽類抗生素、細(xì)菌素、溶菌酶和其他小分子拮抗物質(zhì)，根據(jù)抑菌物質(zhì)種類和性質(zhì)的不同，其分離和純化的方法也有差異[57]。國內(nèi)外有很多關(guān)于細(xì)菌分泌胞外抑菌活性成分的分離純化及性質(zhì)的研究報(bào)道[58-59]。

3.1 細(xì)菌素類物質(zhì)

細(xì)菌素是由核糖體合成的抗菌蛋白或多肽，可抑制或殺死不同細(xì)菌系或親緣種的細(xì)菌[60-61]。其成分主要包括蛋白質(zhì)、多肽、核苷酸、生物堿類等，細(xì)菌素類物質(zhì)主要作用是抑菌而非溶菌或者殺菌[62-63]。細(xì)菌素的產(chǎn)生受染色體基因和質(zhì)?；螂p重調(diào)控，部分細(xì)菌素的產(chǎn)生與分泌的胞外多糖有關(guān)[38]?？莶菅堪麠U菌抑菌物質(zhì)主要以蛋白類為主[16]，乳酸菌也能產(chǎn)生作為天然生物防腐劑的細(xì)菌素衍生物，研究表明對(duì)這些細(xì)菌素進(jìn)行生物工程改造可增強(qiáng)細(xì)菌素的抗菌活性、抗菌譜和理化性質(zhì)[64-65]。1925年，Gratia[66]從類細(xì)菌抑制物質(zhì)(BLIS)中分離到具有抑制其他大腸菌生長(zhǎng)的大腸菌素，即“真正的”細(xì)菌素——大腸菌素樣細(xì)菌素。郝彥利等[67]篩選到1株具有廣譜抑菌活性的拮抗菌，初步鑒定其抑菌物質(zhì)可能為兩種新型抗菌肽，分子量分別為6.5～9.5、27.0～35.0 kDa。Xu等[58]、石廣舉等[68]從納豆中篩選到1株產(chǎn)抗菌肽的枯草芽胞桿菌(NT-6)，在飼料中添加適量NT-6的抗菌脂肽物質(zhì)不僅可以促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)，還可抑制副溶血性弧菌的生長(zhǎng)。于敏[21]發(fā)現(xiàn)金麗假交替單胞菌菌株JG1發(fā)酵液的石油醚層、乙酸乙酯層萃取樣品及水層樣品均具有抑菌活性，JG1的抑菌物質(zhì)中既含有某種小分子物質(zhì)如脂類、糖類、色素類(6-溴吲哚-3-乙酸)化合物，也含有大分子蛋白類物質(zhì)，這兩類物質(zhì)協(xié)同產(chǎn)生抑菌活性。

3.2 抗生素及次生代謝產(chǎn)物

放線菌在新型活性物質(zhì)的發(fā)掘研究中占據(jù)了重要地位，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前臨床上應(yīng)用的抗生素有一半以上來源于放線菌[32-36，69]。研究人員發(fā)現(xiàn)，海洋放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物除具有抗菌活性外，部分放線菌菌株還具有抗腫瘤、抗病毒、抑制酶作用等非抗菌活性[33]。目前海洋放線菌產(chǎn)活性物質(zhì)在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害上的研究報(bào)道還較少，關(guān)于有益拮抗菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)的分析研究有待進(jìn)一步深入。肖支葉[70]采用紙片法對(duì)內(nèi)生真菌(Phomopsisamygdali)發(fā)酵液的抑菌活性進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)3種致病細(xì)菌(溶血性葡萄球菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽胞桿菌)具有明顯的抑菌作用，并發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌因其多樣性、復(fù)雜性和特殊性的特點(diǎn)使其可以產(chǎn)生化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、具有多種生物活性的次生代謝產(chǎn)物。王蓉等[71]運(yùn)用多種層析方法從海南紫海膽腸道鏈霉菌HDa2中尋找抗石斑魚病原弧菌的活性分子，獲得4個(gè)雷鎖辛類脂化合物，其中1，3-二羥基-5-異十五烷基苯和1，3-二羥基-5-異十六烷基苯在濃度為10 mg/mL 時(shí)具有抑菌活性，1，3-二羥基-5-異十六烷基苯的活性更強(qiáng)。

4 拮抗菌的抑菌機(jī)制

拮抗菌的抑菌機(jī)制較為復(fù)雜，主要是通過分泌特殊代謝產(chǎn)物或者改變環(huán)境條件來抑制或者殺滅其他微生物的生長(zhǎng)。相關(guān)研究表明，拮抗物質(zhì)的作用機(jī)制主要是通過致病原菌畸形、產(chǎn)生泡狀物、破壞病原菌的細(xì)胞壁、引起細(xì)胞內(nèi)含物外溢，或造成菌絲扭曲、原生質(zhì)凝聚、生長(zhǎng)點(diǎn)膨大、細(xì)胞壁破裂、菌絲崩潰，抑制孢子萌發(fā)等完成的[6]。

4.1 抗生作用

拮抗菌可通過抗生作用產(chǎn)生一類代謝產(chǎn)物，如抗生素、有機(jī)酸等抑制其他微生物生長(zhǎng)發(fā)育，其產(chǎn)生的抗菌類代謝產(chǎn)物多達(dá)百種，對(duì)病原菌的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生抑制作用，并能引起細(xì)胞內(nèi)溶。李海峰等[72]從水稻葉片表面分離到的枯草芽胞桿菌7Ze3能夠產(chǎn)生表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturinA)和環(huán)二肽等抗菌活性物質(zhì)，表現(xiàn)出較好的拮抗效果。Yang等[73]發(fā)現(xiàn)生防細(xì)菌熒光假單胞菌HC1-07通過產(chǎn)生氯霉素抑制病原菌，防治小麥根部病害，拮抗細(xì)菌發(fā)揮生防作用的主要機(jī)制是產(chǎn)生具有毒性的次生代謝物質(zhì)。王文君[49]將培養(yǎng)液中的菌體與胞外產(chǎn)物分別做抑菌實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌BL1的抑菌活性成分主要存在于其胞外產(chǎn)物中，分析推斷菌株BL1是通過抗生作用即分泌代謝產(chǎn)物到胞外產(chǎn)生抑菌作用。

4.2 競(jìng)爭(zhēng)作用

部分拮抗菌具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)和繁殖速度快等特性，可占用更多的生存空間和營養(yǎng)，從而抑制病原菌生長(zhǎng)和繁殖。芽胞桿菌分泌的多種酶能降解黏液和生物膜，使芽胞桿菌及其抗生素滲透到革蘭陰性菌周圍的黏液層中，競(jìng)爭(zhēng)宿主營養(yǎng)，從而抑制其他細(xì)菌的快速生長(zhǎng)[5]。周海平等[27]對(duì)乳酸桿菌(Lactobacillusspp.)LH的拮抗活性研究后發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可黏附或者定殖在胃腸道中，在腸道中占據(jù)生態(tài)位，對(duì)其他有害細(xì)菌在胃腸道中的生存形成干擾。另外，乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸，還能有效降低胃腸道的pH值，從而抑制其他耐酸性較弱的細(xì)菌在胃腸道中的存活，從而提高機(jī)體的免疫力[29]。乳酸菌在胃腸道內(nèi)還可利用一些糖類發(fā)酵并產(chǎn)生CO2使胃腸道形成厭氧環(huán)境，對(duì)其他需氧的有害微生物具有一定的抑制作用。此外，乳酸菌還可以分泌細(xì)菌素，包括羊毛硫抗菌素、小分子的熱穩(wěn)定肽、大分子的熱不穩(wěn)定肽、復(fù)合細(xì)菌素，這些細(xì)菌素可與有害微生物的細(xì)胞膜相互作用，從而實(shí)現(xiàn)抑菌作用[74]。Fekaninova等[75]的研究表明乳酸菌不僅可以顯著抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖常見的病原菌生長(zhǎng)，還能有效改善養(yǎng)殖水質(zhì)。

4.3 寄生作用和誘導(dǎo)抗性

拮抗菌常以吸附生長(zhǎng)、纏繞、侵入、消解等多種形式侵入到寄主體內(nèi)獲得營養(yǎng)籍以生存和繁殖，從而抑制病原菌。部分拮抗菌以一種機(jī)制為主，而多數(shù)拮抗菌同時(shí)依賴多種機(jī)制抑制病原菌。楊淑專等[76]用宿主雙層瓊脂平板法，測(cè)定海洋噬菌蛭弧菌對(duì)25株對(duì)蝦病原菌和大腸埃希菌、綠膿桿菌及金黃色葡萄球菌的寄生作用，結(jié)果表明盡管不同的噬菌蛭弧菌菌株導(dǎo)致寄生的范圍不同，但所有供試寄主細(xì)菌都能被某些蛭弧菌寄生從而形成清晰的噬斑。另外，許多拮抗菌還可通過誘導(dǎo)抗性，在寄主菌體內(nèi)產(chǎn)生抗病相關(guān)酶活性，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)。李娜等[77]以青脆李果實(shí)為研究對(duì)象，研究了膜醭畢赤酵母(Pichiamembranaefaciens)和檸檬形克勒克酵母(Kloeckeraapiculata)對(duì)其采后主要侵染性病害褐腐病的生物防治作用，膜醭畢赤酵母和檸檬形克勒克酵母可以誘導(dǎo)果實(shí)苯丙烷代謝途徑，促進(jìn)果實(shí)中活性酶的上升，進(jìn)而導(dǎo)致木質(zhì)素、酚類物質(zhì)和類黃酮的大量積累，提高果實(shí)自身的控病能力。目前，利用誘導(dǎo)抗性作用的微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性病害防治的應(yīng)用還鮮見報(bào)道。

5 展 望

隨著綠色可持續(xù)發(fā)展理念的深入，人們愈發(fā)關(guān)注基于拮抗作用的生物病害防治，從而實(shí)現(xiàn)高效、環(huán)保的疾病防治。隨著對(duì)拮抗細(xì)菌和病原菌相互作用的深入研究，拮抗菌理論上應(yīng)具備以下條件：①繁殖快、生命力強(qiáng)；②性狀穩(wěn)定、不易突變、適應(yīng)性強(qiáng)；③抗菌譜廣；④綠色環(huán)保；⑤適宜于商業(yè)生產(chǎn)和使用，適于與化學(xué)農(nóng)藥混合使用[6]。

目前關(guān)于拮抗菌的研究主要集中在對(duì)病原菌具有顯著抑制作用的益生菌篩選研究上，而對(duì)其拮抗物質(zhì)的作用機(jī)制研究報(bào)道還較少[78]。在拮抗菌相關(guān)抗病害基因和遺傳作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用，可顯著提高拮抗菌的篩選效率及拮抗能力的研發(fā)，并可以進(jìn)一步分析研究其拮抗活性物質(zhì)特性，從而為藥物合成提供理論支撐。此外，由于微生物發(fā)酵技術(shù)還不完善，造成拮抗菌拮抗效果不顯著且不穩(wěn)定，嚴(yán)重阻礙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此，對(duì)拮抗菌發(fā)酵條件的探索及改進(jìn)優(yōu)化是當(dāng)務(wù)之急，對(duì)于促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，提高經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益有著廣闊的發(fā)展前景。