一個新的ABO*A 等位基因導致的AwB 亞型及其分子機制研究

周 璐，雷 航，洪 葉，金 爽，董永勤，王學鋒，蔡曉紅

（1.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院舟山分院輸血科，浙江 舟山 316000；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院輸血科，上海 200025）

ABO 血型血清學鑒定是臨床輸血前必須進行的重要檢測，而ABO 血型亞型是導致血型血清學實驗中正反定型不一致、定型困難的重要原因。很多ABO 亞型者具有特異性的表型，以血型血清學試驗顯示為抗原性弱為主要特征，而經血型血清學確定為紅細胞相同ABO 亞型者，經抗原分子水平、糖基轉移酶和基因水平等研究亦證實其存在著異質性[1]。本研究團隊在對1 例ABO 血型正反定型不一致的患者及其家系進行鑒定分析時，發(fā)現(xiàn)了1 個新的導致AwB 亞型的ABO*A 等位基因，現(xiàn)報道如下。

對象與方法

一、對象

先證者為健康體檢者，女性，53 歲，漢族，既往無特殊病史，無輸血獻血史，家族中無遺傳病史。因先證者的ABO 血型鑒定初次檢測正反定型不一致，后采用試管法進行復檢。并采集先證者的外周靜脈血標本5 mL，用K2-EDTA 抗凝后進行分析。

二、方法

1.試劑和儀器：本研究所用試劑包括單克隆抗-A、抗-B (批號20200201)、抗-H 血清 (批號20190114)、抗-A1血清(批號20101207)和ABO 反定型紅細胞 (批號20215310)(購自上海血液生物醫(yī)藥有限公司)，人源性抗-A、抗-B 試劑(上海血液中心參比實驗室饋贈)，血液基因組DNA 提取試劑盒(批號R6703，天根生物產品)，通用型DNA 純化回收試劑盒(批號S8202，天根生物產品)；所用儀器包括細胞洗滌離心機(KA-2200 型，日本久保田)和測序儀(ABI377，美國Applied Biosystems)。

2.血型血清學檢測：ABO 正反定型和抗體篩選使用全自動血型儀Biovue (美國強生公司)和IH1000(美國BioRad 公司)進行初次檢測，按血型參比實驗室標準操作方法進行試管法ABO 血型復檢[2]。

3.基因組DNA 提取和PCR 擴增：使用天根血液DNA 基因組抽提試劑盒抽提受檢者的外周血基因組DNA,按試劑盒說明書操作。對先證者進行ABO 基因擴增。PCR 檢測中使用的引物根據ABO基因序列 (GenBank Accession Number N_000009)參照文獻[3]進行設計，擴增條件為，95 ℃3 min；95 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃60 s，共30 個循環(huán)；最后72 ℃，延伸8 min。

4.PCR 產物克隆及測序：采用通用型DNA 純化回收試劑盒(天根生物產品)純化PCR 產物，并使用ABI377 測序儀(美國Applied Biosystems 公司)對ABO 基因7 個外顯子序列進行直接測序。將先證者第6 至第7 外顯子的PCR 純化產物克隆入pMD18-T 載體(TaKaRa 公司產品)，進行單倍型鑒定。

5.ABO 等位基因命名：根據國際輸血協(xié)會(International Society of Blood Transfusion,ISBT)的命名方式對ABO 等位基因和突變進行命名。

6.突變對GTA 蛋白結構影響的預測：對檢出新突變導致的A 酶突變體GTA-p.L280F 進行結構模擬分析。以人類糖基轉移酶A(GTA，PDBID：3SXE，對應基因型A1.02)的晶體結構為分子模型，采用Chimera 軟件(版本1.1University of California，S1.2，San Francisco，CA)進行突變體構建，并對突變后的分子結構進行分析[4]。GTA蛋白3D結構圖的繪制采用PyMol軟件[DeLano，W.L.the PyMOL Molecular Graphics System(2003-2011)，版本1.4.1，DeLanoScientific，San Carlos，CA]。

結果

一、血型血清學鑒定

先證者體檢時自動血型檢測系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)其紅細胞與單克隆抗A、抗B 試劑反應分別呈弱陽性(2+)和強陽性(4+)，與抗A1 血清反應呈陰性，先證者血漿與試劑A 細胞和B 細胞反應，結果分別為弱陽性(0.5+)和陰性，不規(guī)抗體篩查未見異常。進行試管法復檢，結果發(fā)現(xiàn)先證者的血清學表現(xiàn)為正反不符，人源性抗A 和抗B 分別呈弱陽性(2.5+)、強陽性(4+)，其紅細胞上的H 抗原較正常A 型紅細胞無明顯增強，抗H-Bc、抗H-Oc、抗H-Pc 分別為0.5+、2+、0.5+。由于缺乏先證者的唾液樣本，所以無法確定明確的表型。

二、DNA 測序及克隆分析

先證者A 等位基因與ABO*A1.01 相比，第7外顯子存在c.467C>T 和c.838C>T 錯義突變(見圖1)。這2 個突變分別被報道為ABO*A1.02 和ABO*A3.03 等位基因的關鍵位點，但兩者順式表達的等位基因在ISBT 數(shù)據庫和既往國內外文獻中均未見報道。此先證者基因型為ABO*Avar/B.01。

圖1 先證者PCR 測序結果

三、GTA 空間模型分析

基因測序和克隆結果分析顯示，本例先證者在A3.03 等位基因的基礎上發(fā)生c.467C>T，而相較于A1.01 等位基因，A1.02 基因第7 外顯子第467 位發(fā)生C>T 堿基突變(c.467C>T)突變，使第156 位的脯氨酸(Pro)變成亮氨酸(Leu)(p.P156L)突變不影響蛋白結構和功能[5]，故本次GTA 功能發(fā)生改變可能是c.8238C>T(p.L280F)突變導致的。對p.L280F突變進行3D 分子模型構建與局部結構分析，發(fā)現(xiàn)該突變未導致GTA 蛋白整體結構的改變(見圖2A、2B)，但卻改變了280 位氨基酸與鄰近氨基酸的靜電作用力，L280 可分別與276 位、284 位氨基酸形成氫鍵(見圖2C)，而F280 則可與283 位及284 位形成氫鍵(見圖2D)，改變了鄰近氨基酸間的作用力，導致局部構象的改變。

圖2 野生型GTA 與p.L280F 突變GTA 的分子模型

討 論

一、先證者血清學鑒定結果顯示為AwB 亞型

ABO 血型亞型是由于基因突變，導致紅細胞表面A 抗原或B 抗原表達數(shù)目減少，與抗A 或抗B血清反應出現(xiàn)凝集強度減弱的現(xiàn)象，具有遺傳基礎和明確的血清學特點[6]。正常A 型紅細胞與抗A1的凝集強度可達到4+，但本例先證者的紅細胞與抗A1幾乎無反應[7]；A 亞型與抗H 凝集強度普遍強于正常同型紅細胞[8]。A3型紅細胞的典型特征是出現(xiàn)混合視野凝集[9]，有些亞型如Ax、Ael，其血清中經常存在抗A1抗體[10]，可以作為與其他A 亞型進行鑒別的特征；Ael亞型常規(guī)的實驗方法檢測不出A 抗原，但吸收放散實驗能夠檢出弱的A 抗原[11]。類孟買血型也存在紅細胞A 或B 抗原缺失或弱表達，但類孟買型紅細胞由于缺乏H 抗原，一般不與抗H發(fā)生凝集，因此，可應用抗H 加以區(qū)分[12]。本研究先證者為抗A 弱陽性，抗A1陰性，抗B 強陽性，人源性的抗A 和抗B 也分別為弱陽性和強陽性，抗H無明顯加強。因該先證者存在一個正常的B 等位基因，故其紅細胞上的H 抗原可不增強[13]。本研究由于缺乏先證者的唾液樣本，無法確定明確的表型。

二、先證者基因型為ABO*Avar/B.01

血型血清學試驗不能作為患者ABO 血型亞型的結論，還應進行ABO 血型基因分型及基因測序，完成家系調查，明確亞型形成的遺傳學原因?；驕y序分析顯示，本研究中先證者的A3.03 等位基因存在c.467C>T 突變。我國臺灣地區(qū)報道的A3B 型個體中也發(fā)現(xiàn)了c.838C>T 錯義突變，預測編碼的A1.01 等位基因第280 位亮氨酸(Leu)轉變成苯丙氨酸(Phe)[14]，該等位基因被命名為A3.03 等位基因。區(qū)別于已報道的病例，本研究中先證者在A3.03 等位基因存在c.467C>T(p.P156L)突變。

A3亞型紅細胞最大特征為鏡下呈混合視野凝集，即A3紅細胞與抗A 及大多數(shù)抗AB 孵育后出現(xiàn)一些有數(shù)個紅細胞形成的小凝集塊，并被絕大部分游離的非凝集紅細胞包圍[15]。雖然經測序證實，本研究中先證者標本含有罕見的A3等位基因，但其未出現(xiàn)A3亞型經典的混合視野，因此血清學鑒定為AwB 型。這提示血清學表現(xiàn)存在個體差異，血清學和基因型結果并不完全對應。此現(xiàn)象在ABO亞型中并不少見，即同樣的基因型可以有不同的血清學表現(xiàn)[16-18]，尤其是在和不同的ABO 等位基因共表達時[19]。如有研究曾報道，ABO*A3.07 等位基因表型未檢出混合視野 (3 例ABO*A3.07/B.01，2 例ABO*A3.07/O01.01，1 例ABO*A3.07/O01.02)[20-21]，被認為可能與不同實驗室使用的抗血清試劑存在差異有關[18]，也可能是由于血型血清學鑒定結果明顯受血樣本新鮮程度限制，而分子生物學技術分析可不受影響[9]。

三、p.L280F 導致GTA 局部構象改變

另外，針對c.838C>T(p.L280F)突變，本研究對先證者突變蛋白的結構和功能，進行了相關研究。在模擬的GTA 的3D 分子模型分型中，發(fā)現(xiàn)其未導致GTA 蛋白整體結構的改變，但卻改變了280 位氨基酸與鄰近氨基酸的靜電作用力，L280 可分別與276 位及284 位氨基酸形成氫鍵，而F280 則是與283 位及284 位形成氫鍵，導致局部構象的改變，這可能是導致該先證者出現(xiàn)AwB 亞型的原因。

c.838C>T(p.L280F)突變，即A3.03，在人群中較為罕見，既往報道出現(xiàn)在A3B 型個體中[14,22]。c.467C>T(p.P156L)突變，在我國漢族人群中很常見，主要見于A1.02 等位基因，其出現(xiàn)頻率為0.197 8[23]，相應表型為正常A 型，但該突變生成的糖基轉移酶并不影響酶活性[24]，也不影響蛋白結構和功能,所以該突變點并非導致AwB 亞型的根本原因。基因突變造成其編碼的糖基轉移酶結構和活性改變，導致血型抗原合成異常，客觀解釋了血型抗原抗體在質和量的差異性原因[25]。所以可知，c.838C>T(p.L280F)突變是導致本研究先證者A 型糖基轉移酶活性極大降低的原因。

總之，p.L280F 突變可能通過改變鄰近氨基酸間的作用力，導致A 酶活性減弱，在與B 等位基因共表達時形成AwB 亞型。但該突變如何進一步導致酶活性減弱的機制，還需要進一步行體外實驗證實。更重要的是針對AwB 亞型，對其突變與功能關系進行研究，了解其分子機制，為血型鑒定與安全輸血提供科學依據，是未來精準醫(yī)療不可缺少的部分。