遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)抗氧化肽的分離純化及結(jié)構(gòu)解析

李亞會(huì)，李積華，吉宏武，周 偉，陸旭麗

（1 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東湛江524001 2 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 廣東湛江524088）

人體與外界長(zhǎng)期接觸，如呼吸、外界污染、輻射等因素不斷在體內(nèi)產(chǎn)生自由基，過(guò)量的自由基會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)失調(diào)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，造成生物大分子的氧化損傷?？寡趸锬芫徑庾杂苫鶎?duì)機(jī)體造成的損傷。近幾年，人們關(guān)注更多的天然抗氧化物質(zhì)，如從雞蛋[1]、玉米[2]、大豆[3]及牛奶[4]等蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中得到的抗氧化活性肽，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。此外，水產(chǎn)品包括蛤[2]、魷魚(yú)[5]、蝦[6]等蛋白酶解產(chǎn)物也是非常好的抗氧化活性肽的來(lái)源。

遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)屬于南海低值魚(yú)資源，具有分布廣、生長(zhǎng)快、繁殖力強(qiáng)的特點(diǎn)，其營(yíng)養(yǎng)豐富，價(jià)格低廉[7]。前期研究結(jié)果顯示遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)酶解液中的蛋白多肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性[8]，其氨基酸營(yíng)養(yǎng)豐富，具有抗疲勞，抗免疫，改善皮膚等諸多優(yōu)點(diǎn)。然而因其粗肽成分復(fù)雜，如含有未酶解的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量不同的肽段，小分子氨基酸，鹽離子等成分，故影響肽的抗氧化活性。進(jìn)一步分離純化遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)蛋白粗肽，可獲得純度更高，活性強(qiáng)的產(chǎn)物。

目前最常用的分離純化方法有凝膠過(guò)濾、離子交換層析、高效液相色譜等分離方法。本研究以分離組分的抗氧化活性及分離效果為指標(biāo)，結(jié)合快流速Q(mào) 瓊脂糖凝膠（Q-Sepharose Fast Flow-QFF）和反相色譜柱YMC-pack-OSD-AQ 色譜的分離方法，對(duì)遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)蛋白多肽進(jìn)行逐級(jí)分離。通過(guò)微量質(zhì)譜法，采用軌道阱液相質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定功能肽段的氨基酸序列，最后進(jìn)行鑒定和解析。為探索魚(yú)蛋白肽相關(guān)功效物質(zhì)提供理論基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

福林酚試劑盒，美國(guó)Sigma 公司；快流速Q(mào)瓊脂糖凝膠（Q-Sepharose Fast Flow），美國(guó)GE公司；乙腈、甲醇、乙醇（色譜級(jí)），美國(guó)Sigma 公司；反相C18 色譜柱（YMC-pack-OSD-AQ），美國(guó)GE 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AKTA-prime 蛋白質(zhì)純化儀，美國(guó)GE 公司；多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo 公司；LC1200 液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；Waters e2695 高效液相，美國(guó)沃特世公司；LC-MS，美國(guó)Thermo 公司；恒溫水浴振蕩器（SHA-82A），深化生物技術(shù)有限公司（廣州）；真空冷凍干燥機(jī)（FDU-1100），理化器械株式會(huì)社（日本東京）；旋鍋混合器（XW-80A），上海儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)蛋白多肽的制備 工藝流程：遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)→去頭去骨→酶解→滅酶（90～100 ℃）→離心→脫油→脫色、脫苦（珍珠巖）→超濾→反滲透→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→冷凍干燥→得到不同分子質(zhì)量的多肽樣品。

具體操作：將遠(yuǎn)東擬沙丁魚(yú)（100 g）去頭、皮、骨及內(nèi)臟，清洗后絞碎，勻漿，在一定條件下酶解3 h（溫度50 ℃，添加動(dòng)物蛋白水解酶0.5%、風(fēng)味酶0.1%，自然條件），之后在90～100 ℃條件下加熱10 min，使蛋白質(zhì)變性。4 000 r/min 離心，取上清液于管式離心機(jī)中脫油，加入珍珠巖脫色，得到的澄清液用截留分子質(zhì)量為10 000 u 和3 000 u的超濾膜超濾，反滲透去除H2O 等小分子物質(zhì)，得到分子質(zhì)量在100～3 000 u（F1），3 000～10 000 u（F2）和大于10 000 u（F3）的多肽樣品，將其在50℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥得到干粉，備用。

1.3.2 超濾各組分的抗氧化活性

1.3.2.1 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定 將1.5 mL 不同質(zhì)量濃度樣品溶液與等體積的含0.2 mmol/L DPPH 的95%乙醇置于試管中振蕩，混勻。在25℃避光30 min，于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)吸光度（AS）[9]。DPPH 自由基清除率以Y1（%）表示。以1.5 mL 95%乙醇加入1.5 mL 蒸餾水調(diào)零。

式中，As——樣品與1.5 mL 含DPPH 的95%乙醇反應(yīng)后的吸光度；A0——樣品和1.5 mL 95%乙醇反應(yīng)后的吸光度；A——蒸餾水和1.5 mL 含DPPH 的95%乙醇反應(yīng)后的吸光度。

1.3.2.2 ABTS 自由基清除能力的測(cè)定 將1 mL ABTS 溶液（7.4 mmol/L）和等體積2.6 mmol/L K2S2O4混合，黑暗處?kù)o置16 h，用pH 7.4 的0.1 mol/L 磷酸緩沖液稀釋40～50 倍，測(cè)定該混合液在734 nm 處的吸光度。通過(guò)稀釋不同倍數(shù)來(lái)調(diào)整吸光度范圍至0.7±0.02，得到ABTS+工作液。將1 980 μL ABTS+與20 μL 樣品混勻，靜置6 min，在波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)定吸光度[10]。ABTS 自由基清除率以Y2（%）表示。清除率計(jì)算公式：

式中，A0——ABTS+和蒸餾水反應(yīng)后的吸光度；A——ABTS+和樣品反應(yīng)后的吸光度。

1.3.2.3 羥基自由基清除能力的測(cè)定 在反應(yīng)體系中加入0.5 mL FeSO4溶液（9 mmol/L）和1 mL水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/L），加樣品溶液1 mL+超純水5 mL，最后加入0.5 mL H2O2（8.8 mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，于37 ℃條件下預(yù)熱30 min。對(duì)照組中以超純水替代樣品，以超純水為參比液，在波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定其吸光度，記為AS[11]。清除率以Y3（%）表示。

式中，As——上述所測(cè)得吸光度；A0——采用超純水代替樣品所測(cè)吸光度；AC——超純水代替雙氧水所測(cè)吸光度。

1.3.3 快流速Q(mào) 瓊脂糖凝膠（Q-Sepharose Fast Flow，QFF）強(qiáng)陰離子交換分離純化 采用l.6 cm×64 cm QFF 強(qiáng)陰離子層析柱，以0.05 mol/L Tris-HCl 作為緩沖液，對(duì)鹽溶液的pH 值、洗脫方式，樣品質(zhì)量濃度和上樣體積等進(jìn)行優(yōu)化[12]，在波長(zhǎng)214 nm 處檢測(cè)，以提升樣品的純度和活性為最終目的，確定最佳的分離條件。

1.3.3.1 不同pH 值的流動(dòng)相對(duì)QFF 分離效果的影響 在相同樣品質(zhì)量濃度10 mg/mL，樣品體積5 mL，樣品流速1 mL/min 的條件下，篩選不同pH值條件的Tris-HCl 溶液。采用線(xiàn)性洗脫，洗脫流速為5 mL/min，得到分離圖4。

1.3.3.2 上樣質(zhì)量濃度對(duì)QFF 分離效果的影響由1.3.3.1 確定最適合Tris-HCl 的pH 值為9.5，洗脫速度5 mL/min，上樣流速1 mL/min，上樣體積5 mL，篩選上樣質(zhì)量濃度，得到分離圖5。

1.3.3.3 上樣體積對(duì)QFF 分離效果的影響 在以上確定條件下，為了增大樣品得率，繼續(xù)增加上樣體積，根據(jù)分離效果收集濃度更高的分離組分，如圖6所示。

1.3.3.4 洗脫方式對(duì)QFF 分離效果的影響 通過(guò)線(xiàn)性洗脫得到的分離圖譜，進(jìn)一步采用梯度洗脫液進(jìn)行分離，選擇離子強(qiáng)度為0.13，0.28，0.5，1 mol/L NaCl 的0.05 mol/L Tris-HCl 和離子強(qiáng)度為0.07，0.18，1 mol/L NaCl 進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖7。

1.3.4 YMC-pack-OSD-AQ 分離純化 采用反相高效液相色譜，通過(guò)反相C18 色譜柱（YMC-pack-OSD-AQ）對(duì)QFF 強(qiáng)陰離子分離組分進(jìn)行分離純化。以乙腈和超純水為流動(dòng)相，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的流速、乙腈與水的比例，以提高分離樣品的純度和得率，最終確定最佳的分離條件。

1.3.5 氨基酸測(cè)序 將收集到的組分冷凍濃縮后凍干成粉，采用微量質(zhì)譜法，利用軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，在噴霧電壓3 kV、蒸發(fā)溫度200 ℃和毛細(xì)管溫度300 ℃、鞘氣流速和輔助氣流速分別為30 mL/min 和5 mL/min 的條件下，對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)[13]。通過(guò)檢測(cè)得到一級(jí)質(zhì)譜，篩選主要成分進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜的檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖10～13。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，其結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用Origin 8.6 作圖和SPSS 軟件進(jìn)行多重比較和方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 超濾后各組分抗氧化活性分析

肽的分子質(zhì)量與其抗氧化活性有較大的相關(guān)性，一般而言，隨著分子質(zhì)量的減小，其對(duì)自由基清除能力逐漸增強(qiáng)[14]。在同一質(zhì)量濃度條件下，不同分子質(zhì)量區(qū)間的組分對(duì)DPPH、ABTS 自由基均有較強(qiáng)的清除能力（圖1、2），且F1 與另外兩個(gè)組分（F2、F3）相比，表現(xiàn)出更強(qiáng)的清除能力，其清除率在55%以上。圖3 結(jié)果顯示，各組分對(duì)羥自由基的清除能力相對(duì)較低，其中F1 比F2、F3 的清除能力要稍強(qiáng)，F(xiàn)3 的清除能力最差，說(shuō)明分子質(zhì)量較小的組分顯示的抗氧化活性反而更強(qiáng)，當(dāng)F1 質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)，其清除能力在40%以上。最終選擇組分F1 進(jìn)行分離純化。

2.2 QFF 強(qiáng)陰離子色譜柱分離條件對(duì)組分分離效果的影響

2.2.1 不同pH 值的流動(dòng)相對(duì)QFF 分離效果的影響 由圖4 可知，以穿透峰面積占整個(gè)峰面積值的比例判斷樣品在色譜柱中的吸附程度，穿透峰面積比例越小，其吸附效果越好。不同pH 值的Tris-HCl 溶液對(duì)QFF 分離效果不同，其原因是流動(dòng)相pH 值決定樣品的離子狀況，在不同的電荷條件下，樣品與填料離子之間的相互作用不同，直接決定其分離狀況，選擇pH 值分別為8.0，8.5，9.0，9.5 的Tris-HCl 溶液，結(jié)果如圖4所示。根據(jù)圖4 結(jié)果分析，最后確定pH 9.5 為最佳分離條件。

圖1 不同質(zhì)量濃度F1、F2、F3 的DPPH 自由基清除率Fig.1 DPPH radical scavenging rates of different mass concentrations of F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3

圖2 不同質(zhì)量濃度F1、F2、F3 的ABTS 自由基清除率Fig.2 ABTS radical scavenging rates of different mass concentrations of F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3

圖3 不同質(zhì)量濃度F1、F2、F3 的羥基自由基清除率Fig.3 Hydroxy radical scavenging rates of different mass concentrations of F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3

圖4 不同pH 值的Tris-HCl 溶液對(duì)QFF 分離效果的影響Fig.4 Effect of Tris-HCl solutions with different pH value on QFF separation

2.2.2 上樣質(zhì)量濃度對(duì)QFF 分離效果的影響從圖5 可知，當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為5，10，20 mg/mL時(shí)，其穿透峰面積較小，說(shuō)明樣品都能較好的吸附在色譜柱上，隨著上樣濃度降低，其穿透峰越小，說(shuō)明分離效果越好。當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，穿透峰面積最小，吸附效果最佳。最終選擇上樣質(zhì)量濃度為5 mg/mL。

2.2.3 上樣體積對(duì)QFF 分離效果的影響 由圖6可知，隨著上樣體積的增加，穿透峰面積逐漸增大，分離效果較差。在盡可能獲得最大得率條件下選擇最大的上樣體積。當(dāng)上樣體積為40 mL 時(shí)，穿透峰高于洗脫峰，說(shuō)明樣品吸附不好，直接被洗脫。最終選擇最佳上樣體積30 mL。

2.2.4 洗脫方式對(duì)QFF 離效果的影響 在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別選擇梯度洗脫為0.13，0.28，0.5，1 mol/L NaCl 和0.07，0.18，1 mol/L NaCl，結(jié)果發(fā)現(xiàn)梯度洗脫比之前的線(xiàn)性洗脫分離效果好，其可能原因是在不同濃度的氯化鈉條件下，樣品與填料間的相互作用有所改變，顯示峰型有較大的變化。從圖7 可知，分離條件T2 時(shí)，穿透峰面積小于分離條件T1 時(shí)的，說(shuō)明樣品吸附能力較好，得率較高，最終選擇最佳梯度洗脫條件為0.07，0.18，1 mol/L NaCl。

圖5 不同上樣質(zhì)量濃度對(duì)QFF 分離效果的影響Fig.5 Effect of different sample mass concentration on QFF separation

圖6 不同上樣體積對(duì)QFF 分離效果的影響Fig.6 Effect of different volume of simple on QFF separation

圖7 不同NaCl 濃度對(duì)QFF 分離效果的影響Fig.7 Effect of different elution concentration of simple on QFF

最終確定QFF 的分離條件為：pH 9.5 的Tris-HCl 溶液，上樣質(zhì)量濃度5 mg/mL，上樣體積30 mL，上樣流速1 mL/min。采用濃度為0.07，0.18，1 mol/L NaCl，洗脫流速5 mL/min。在相同條件下集中收集峰a、峰b 后測(cè)定其抗氧化活性，結(jié)果見(jiàn)圖8。

由圖8 可知，將收集得到的峰a，峰b 進(jìn)行濃縮，在一定條件下測(cè)定其對(duì)DPPH 自由基、羥自由基及ABTS 自由基清除能力，結(jié)果顯示：峰b 對(duì)3種自由基的清除能力都比峰a 強(qiáng)。最終選擇峰b進(jìn)行下一步分離純化。

2.3 反相色譜柱YMC-pack-OSD-AQ 分離純化

將收集得到的峰b 采用反相色譜柱YMCpack-OSD-AQ 分離純化。通過(guò)不同體積分?jǐn)?shù)（7%，11%，20%）的乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以11%的乙腈作為流動(dòng)相，其分離效果最佳，結(jié)果如圖9。

從圖9 可看出，由YMC-pack-OSD-AQ 分離得到的6 個(gè)峰，收集2 個(gè)主要峰（1 和6），在相同蛋白含量條件下，檢測(cè)其對(duì)ABTS 自由基的清除能力。結(jié)果顯示：b-f1 和b-f6 對(duì)ABTS 自由基清除能力分別為（81.22±4.12）%，（76.35±3.32）%，2個(gè)峰的活性沒(méi)有太大的差異，說(shuō)明這2 個(gè)主要峰中都含有起抗氧化作用的成分。將這2 個(gè)峰收集、濃縮后進(jìn)一步測(cè)定其氨基酸序列。

2.4 氨基酸測(cè)序

采用軌道阱-液相質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定，將得到的b-f1 和b-f6 干粉溶解，用微量進(jìn)樣品器進(jìn)樣，霧化處理形成氣體，進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)得到一級(jí)質(zhì)譜。根據(jù)樣品的特性及分離效果，篩選主要的離子峰作為母離子，進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)。經(jīng)惰性氣體碰撞，分子間相互碰撞的程度不同，其肽段沿肽鏈斷裂方式也不同。研究表明，可通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜所得碎片離子峰之間的質(zhì)量差值推斷其可能的肽序列[15]。以Fohlman 和Roepstorff 提出的命名方式[16-17]，N端用字母a、b、c 等表示，C 端用x、y、z 等表示。碎片離子可能發(fā)生脫水、脫氨，形成非常規(guī)的離子峰，還會(huì)形成支鏈丟失或者兩端斷裂等離子，產(chǎn)生多組不同類(lèi)型的碎片離子峰[18]，使分析氨基酸序列更具難度。對(duì)于CID 質(zhì)譜，利用從頭測(cè)序法[19]，根據(jù)肽鍵的斷裂方式，一般會(huì)形成完整的b/y 系列離子，也會(huì)有些碎片離子丟失。同一鄰近元素之間的相對(duì)分子質(zhì)量之差為一個(gè)氨基酸殘基相對(duì)分子質(zhì)量，根據(jù)上述2 個(gè)信息推斷整個(gè)多肽序列。

圖8 QFF 分離組分的自由基清除能力Fig.8 Free radical scavenging capacity of QFF fractions

圖9 YMC-pack-OSD-AQ 的分離圖譜Fig.9 Separation chromatogram of YMC-pack-OSD-AQ

根據(jù)圖10、11，初步推斷得到b-f1（437.2）的氨基酸序列可能是Arg-Phe-Asp（RFD）或者Trp-Thr-Met（WTM）。其母離子（M+H）+=437.1，說(shuō)明其氨基酸序列的分子質(zhì)量約437 u。

根據(jù)圖譜碎片分析，若命名b1=159.1，b2=303.1，則其中可能含有氨基酸殘基Phe（b2-b1+20=164 與Phe=165 相近），y1=133（Asp）和y2=279（缺失），能夠找到y(tǒng)2-H2O=261 的相關(guān)離子碎片，此時(shí)推測(cè)其可能的氨基酸序列為Arg-Phe-Asp，分子質(zhì)量為436 u，與母離子的m/z=437 u 基本吻合。

圖10 ESI-MS（b-f1）的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.10 The primary mass spectrogram of ESI-MS（b-f1）

圖11 ESI-MS-MS（b-f1-437.2）的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.11 The secondary mass spectrogram of ESI-MS（b-f1-437.2）

若命名y2=303.1，y1-COOH=159.1，則y1=203.1與碎片離子為202.9 相近，可能存在的氨基酸殘基為y2-y1=100，還可能存在氨基酸Thr（y2-y1+20=120 與氨基酸Thr=119 相近）。根據(jù)y 型離子質(zhì)譜和b 型離子質(zhì)譜相互轉(zhuǎn)換公式 m（y）+ m（b）=m（s）+ m（H），m（s）為母離子的相對(duì)分子質(zhì)量；計(jì)算b1=132，b2=233 缺失，然而可以找到a2=b2-CO=205 與離子碎片202.9 相近，最終推斷其可能氨基酸序列為T(mén)rp-Thr-Met（WTM），其分子質(zhì)量為436，與母離子的m/z=437.2 基本吻合。

根據(jù)圖12 和圖13 初步推斷b-f6（701.7）可能的氨基酸序列為Phe-Ala-His-Asp-Asp-Pro。其母離子（M+H）+=701.7，說(shuō)明其分子質(zhì)量在701.7左右。根據(jù)主要離子碎片的分子質(zhì)量683.5，588.4，475.3，362.3，推算其可能含有氨基酸殘基Pro（683.5-588.4+20）、Asp（588.4-475.3+20=133.1與Asp 相近）、Asp（475.3-362.3+20=133）。最后推斷其中的離子碎片對(duì)應(yīng)的b，y 離子，b5=570.4，b4=493.4，b3=362.3；y5-NH=588.4；y4-NH=475.3；x3=y3+28=344.3，其它碎片離子均缺失，最后推斷其可能的氨基酸序列為Phe-Ala-His-Asp-Asp-Pro，分子質(zhì)量為700 u，與主離子701.5 基本吻合。

圖12 ESI-MS（b-f6）的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.12 The primary mass spectrogram of ESI-MS（b-f6）

圖13 ESI-MS-MS（b-f6-701.7）的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.13 The secondary mass spectrogram of ESI-MS（b-f6-701.7）

3 結(jié)論

選用離子色譜和凝膠色譜對(duì)超濾后的組分F1（100～3 000 u）進(jìn)行分離純化，用軌道阱液質(zhì)聯(lián)用對(duì)收集組分進(jìn)行氨基酸結(jié)構(gòu)測(cè)序，得到以下結(jié)論：逐級(jí)分離后獲得2 個(gè)活性較強(qiáng)、純度較高的組分b-f1 和b-f6。b-f1 分子質(zhì)量為436 u，其氨基酸序列是Arg-Phe-Asp（RFD）或Trp-Thr-Met（WTM）；b-f6 的分子質(zhì)量為700 u，其氨基酸序列為Phe-Ala-His-Asp-Asp-Pro。