山西老陳醋源植物乳桿菌C181對(duì)小鼠酒精肝損傷的保護(hù)作用

許 女，孫建平，陳旭峰，王佳麗，賈瑞娟，張 浩，王如福

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷030801）

近年的肝病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，酒精性肝病己成為僅次于病毒性肝炎病癥的第二大肝臟疾病。長(zhǎng)期且大量飲酒會(huì)使線粒體及微管受到損傷，從而導(dǎo)致脂肪酸及乙醇的氧化過程受到阻礙，最終脂肪酸和乙醇大量堆積在肝臟細(xì)胞中，使肝臟細(xì)胞損傷嚴(yán)重。乙醇氧化成乙醛，乙醛具有較高的毒性和反應(yīng)活性，在酒精性肝損傷中起到關(guān)鍵作用。除此之外，酒精性肝病發(fā)生之后，肝臟細(xì)胞合成與釋放大量炎癥因子能破壞腸黏膜細(xì)胞的緊密連接，增加腸道通透性，造成腸道損傷，腸道菌群異常（比如革蘭氏陰性菌增多），產(chǎn)生的內(nèi)毒素等有毒物質(zhì)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重肝臟及其他器官的損傷。

許多功能性食品有助于降低疾病風(fēng)險(xiǎn)，提高代謝性和變性疾病患者的健康質(zhì)量。其中一種具有代表性的功能性食品是益生菌。乳酸菌是一種益生菌，可抑制革蘭氏陰性菌在腸道生長(zhǎng)，維持腸道菌群平衡，保護(hù)腸道細(xì)胞，阻斷內(nèi)毒素由腸道轉(zhuǎn)向肝臟。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者把對(duì)益生菌的研究作為預(yù)防及治療酒精性肝病的新方向。雙歧桿菌被發(fā)現(xiàn)能夠抑制腸道微生物群中病原體的生長(zhǎng)，增加宿主的免疫系統(tǒng)，并具有抗肥胖、抗結(jié)腸炎和保護(hù)肝臟的作用。Zhao 等[1]報(bào)道，鼠李糖乳桿菌通過增強(qiáng)HIF 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，改善腸道上皮細(xì)胞的完整性和通透性，酒精肝的預(yù)防和治療可以通過上調(diào)miR122a 以及抑制肝細(xì)胞的凋亡等來實(shí)現(xiàn)。發(fā)酵乳桿菌則通過清除活性氧（ROS），調(diào)節(jié)一氧化氮合酶（iNOS）和熱激蛋白的表達(dá)來改善乙醇誘導(dǎo)的肝損傷[2]。Tian 等[3]也同樣證實(shí)鼠李糖乳桿菌CCFM1107 主要是清除體內(nèi)自由基，降低氧化壓力，恢復(fù)平衡腸道菌群，以達(dá)到預(yù)防治療酒精肝損傷的目的。另外，Chiu 等[4]做體外細(xì)胞試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌MYL01 可以調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞的促炎因子（如：腫瘤壞死因子-TNF 和抗炎因子IL-10）的表達(dá)，減輕酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞受損。Segawa 等[5]通過研究短乳桿菌SBC8803 的保肝、護(hù)肝作用也證實(shí)了此結(jié)論。其它益生菌（包括嗜酸乳桿菌等）在暴露于氧化應(yīng)激的小鼠體內(nèi)顯示出對(duì)肝臟的保護(hù)作用[6]。這些結(jié)果表明，益生菌通過調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子和胃、腸通透性來減輕肝臟損傷和胃炎。到目前為止，有關(guān)益生乳酸菌對(duì)酒精肝損傷的確切預(yù)防機(jī)制仍不清楚。

本文研究一株分離于山西老陳醋醋醅中的植物乳桿菌C181 對(duì)酒精肝損傷的保護(hù)作用，為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

植物乳桿菌C181（Lactobacillus plantarum C181），山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；白介素IL-6、腫瘤壞死因子TNF-α、干擾素IFN-γ 測(cè)定試劑盒，武漢貝茵萊生物科技有限公司；游離脂肪酸測(cè)定試劑盒、總RNA 提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；TaKaRa RR036A 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM II，寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 主要儀器、設(shè)備

CFX96 熒光定量PCR 儀，美國(guó)BioRad 公司；SpectraMax i3x 酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices 公司；高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigam 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酒精誘導(dǎo)肝損傷小鼠實(shí)驗(yàn)

1）受試菌液的制備 將試驗(yàn)菌株按3%接種量接于MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，8 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加無菌生理鹽水洗滌菌體細(xì)胞2 次，調(diào)OD 值使菌液濃度分別達(dá)1010，108CFU/mL 和106CFU/mL。

2）酒精誘導(dǎo)肝損傷小鼠實(shí)驗(yàn) 50 只健康的昆明小鼠被適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，將其隨機(jī)分為空白對(duì)照組、酒精肝損傷模型組、植物乳桿菌C181 低、中、高劑量組，每組10 只。植物乳桿菌低、中、高劑量組每天分別灌胃濃度為106，108CFU/mL 和1010CFU/mL 受試菌液1 mL，酒精肝模型組和對(duì)照組的小鼠用生理鹽水代替菌液，4 h 后空白對(duì)照組小鼠灌胃1 mL 純凈水，其它各組小鼠灌胃1 mL 52°紅星二鍋頭白酒。自由攝取食物和水，動(dòng)物房的溫度（22±2）℃，濕度（56±5）%，飼養(yǎng)4 周。各組小鼠在實(shí)驗(yàn)最后一天禁食12 h，稱重，摘眼球取血，將血樣3 500 r/min 離心10 min，分離制備血清。小鼠脫臼死后，取其肝臟，稱重，于-80 ℃超低溫冰箱保存，備用。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1）血清ALT、AST 活性和肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定 按試劑盒說明書測(cè)定小鼠血清ALT、AST 活性以及肝臟SOD、GSH-Px 和MDA 氧化應(yīng)激指標(biāo)。

2）肝臟甘油三酯含量的檢測(cè)[7]量取500 μL 肝臟勻漿液，充分混合于4 mL 氯仿-甲醇（體積比2∶1）脂質(zhì)抽提緩沖液中，置于4 ℃過夜，8 000 r/min 離心10 min。將下層含脂質(zhì)的有機(jī)相轉(zhuǎn)至EP 管中干燥，用甘油三酯檢測(cè)試劑盒測(cè)定分離出的脂質(zhì)。

3）肝臟游離脂肪酸含量的檢測(cè) 按照試劑盒說明書測(cè)定小鼠游離脂肪酸的含量。

4）肝臟炎癥因子的測(cè)定 按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書測(cè)定白介素IL-6、腫瘤壞死因子TNF-α、干擾素IFN-γ 的含量。

5）肝臟Nrf-2，NF-κB 和腸道ZO-1、Occludin、Claudin 基因的表達(dá) 提取肝臟和腸道組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。用CFX96 熒光定量PCR 儀測(cè)定基因表達(dá)。各引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR 引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

6）腸道菌群測(cè)定 對(duì)小鼠糞便大腸桿菌、乳桿菌和雙歧桿菌分別采用EMB、LBS 和BBL 培養(yǎng)基測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物乳桿菌C181 對(duì)酒精肝損傷小鼠肝臟甘油三酯和游離脂肪酸的影響

為研究植物乳桿菌C181 對(duì)酒精引起的小鼠肝臟脂肪堆積的影響，檢測(cè)小鼠肝臟中的甘油三酯含量，結(jié)果見圖1。酒精模型組小鼠與空白對(duì)照組小鼠相比，肝臟中TG 的含量明顯升高，而灌胃植物乳桿菌C181 后小鼠的TG 含量明顯降低。游離脂肪酸是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的主要物質(zhì)之一，活性氧自由基和活性氮自由基被游離脂肪酸誘導(dǎo)生成，造成小鼠機(jī)體內(nèi)的抗氧化機(jī)制失衡，最后損傷肝臟組織。由圖1 可知，灌胃小鼠酒精4 周，其肝臟中游離脂肪酸的含量明顯上升。植物乳桿菌能顯著降低游離脂肪酸的含量，與空白對(duì)照組相比，沒有顯著性差異。

圖1 植物乳桿菌C181 對(duì)酒精肝損傷小鼠肝臟甘油三酯和游離脂肪酸的影響Fig.1 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on liver triglyceride and free fatty acid in chronic alcohol-induced mice

2.2 植物乳桿菌C181 對(duì)酒精肝損傷小鼠的血清中的ALT、AST 活性和肝臟氧化應(yīng)激的影響

ALT 和AST 是肝細(xì)胞重要的酶，診斷肝細(xì)胞受損重要的指標(biāo)。正常條件下，小鼠的血清中這兩種酶的活性很低。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞膜的通透性增加，這兩種酶進(jìn)入血液中，血清中的酶活性顯著增強(qiáng)，反映出肝細(xì)胞受損程度，是重要的檢測(cè)肝功能的指標(biāo)[7]。由圖2 可知，酒精肝損傷模型組小鼠的血清中AST 和ALT 活性顯著高于對(duì)照組小鼠，植物乳桿菌C181 能夠顯著降低酒精引起的血漿AST 和ALT 活性的升高，并與劑量呈正相關(guān)。綜上，植物乳桿菌C181 能改善過量酒精攝入引起的小鼠肝損傷。

圖2 植物乳桿菌C181 對(duì)小鼠血清中AST、ALT活性的影響Fig.2 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on serum ALT，AST in chronic alcohol-induced mice

肝臟中的脂肪病變能夠產(chǎn)生活性氧，對(duì)肝臟造成氧化損傷，從而加重非酒精性脂肪肝的病變程度。線粒體是脂肪氧化的主要場(chǎng)所，脂肪在肝細(xì)胞中積累的主要原因是線粒體發(fā)生異常，而線粒體異常使活性氧增多，加劇脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞因子的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這是一種惡性循環(huán)，因此及時(shí)有效清除非酒精性脂肪肝產(chǎn)生的大量活性氧，對(duì)延緩/治療非酒精性脂肪肝具有十分重要的意義[9]。Forsyth 等[10]利用慢性酒精性肝損傷模型證明益生菌LGG 能有效降低酒精引起的氧化應(yīng)激，維持腸屏障功能，改善內(nèi)毒素血癥和肝損傷，進(jìn)而改善酒精性脂肪性肝病。由圖3 可知，與正常組相比，酒精模型組SOD 和GSH 水平顯著降低，MDA 含量顯著升高。給予植物乳桿菌C181灌胃后，各項(xiàng)指標(biāo)均顯著改善，其中，中劑量組和高劑量組與對(duì)照組相比，無顯著差異。本研究結(jié)果與先前的報(bào)道[11-12]相似，證明益生菌可改善酒精引起的肝臟嚴(yán)重氧化損傷，也說明植物乳桿菌C181具有很強(qiáng)的抗氧化能力。

圖3 植物乳桿菌C181 對(duì)酒精肝損傷小鼠肝臟中SOD、GSH、MDA 的影響Fig.3 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on liver SOD、GSH and MDA in chronic alcohol-induced mice

2.3 植物乳桿菌C181 對(duì)酒精肝損傷小鼠肝臟炎癥因子的影響

大量研究認(rèn)為，在酒精性肝病發(fā)生、發(fā)展過程中細(xì)胞炎癥因子具有非常重要的作用。內(nèi)毒素對(duì)Kupffer 細(xì)胞（庫弗氏細(xì)胞，定居于肝臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞，在酒精性肝病中扮演重要角色）的激活除了會(huì)產(chǎn)生大量的自由基外，還會(huì)產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin 6，IL-6）、γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）等細(xì)胞炎性因子，它們損害人體正常細(xì)胞和組織，進(jìn)而通過多種途徑引起肝損傷。具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子TNF-α，是重要的調(diào)節(jié)因子，與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)相關(guān)。研究表明，TNF-α 可通過與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，增加胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)量，這些活性氧能夠損傷線粒體成分，如蛋白質(zhì)、磷脂和線粒體DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。

由表2 可知，酒精模型組促炎因子TNF-α、IL-6 和IFN-γ 的水平顯著升高，抗炎因子IL-10的水平顯著降低。灌胃植物乳桿菌C181 后，促炎因子分泌量顯著降低，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)接近正常對(duì)照組水平，其中IFN-γ 的含量甚至低于對(duì)照組，而IL-10 的水平顯著升高。多項(xiàng)研究表明，益生菌通過促進(jìn)促炎和抗炎因子的平衡來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫失衡。Segawa 等[5]試驗(yàn)結(jié)果顯示，口服加熱至死的短乳桿菌SBC8803，可以降低酒精誘導(dǎo)小鼠肝臟中TNF-α 的mRNA 表達(dá)量。Hong 等[14]也發(fā)現(xiàn)灌胃鼠李糖乳桿菌R0011 和嗜酸乳桿菌R0052 或者其發(fā)酵上清液，可以顯著降低酒精肝損傷小鼠肝臟中TLR4，TNF-a 和 IL-1 等炎癥因子的表達(dá)。

表2 植物乳桿菌C181 對(duì)酒精肝損傷小鼠肝臟炎癥因子的影響Table 2 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on liver inflammation factors in chronic alcohol-induced mice

2.4 植物乳桿菌C181 對(duì)酒精肝損傷的小鼠中肝臟Nrf-2，NF-κB 基因表達(dá)的影響

紅細(xì)胞核因子（Nrf-2）是最近被認(rèn)為的治療酒精肝損傷的靶因子。Nrf-2 作為核轉(zhuǎn)錄因子，通過與抗氧化反應(yīng)元件的相互作用，在多種防御基因：解毒酶、抗氧化酶等防御基因中起重要作用[15]。Nrf-2 與細(xì)胞質(zhì)中的特異性抑制因子相結(jié)合，導(dǎo)致Nrf-2 的活性受到抑制。在氧化刺激下，Nrf-2 與抑制因子分離，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核并與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。然后，Nfr-2 復(fù)合物與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，促進(jìn)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。乙醇誘導(dǎo)的氧化壓力及腸道屏障破壞引起的內(nèi)毒素、脂多糖升高，從而導(dǎo)致炎癥，它們是酒精肝損傷的重要病理指標(biāo)。腸屏障損傷被認(rèn)為是酒精性內(nèi)毒素血癥的主要原因之一。腸屏障損傷引起的腸內(nèi)脂多糖（LPS）增加，可能通過促進(jìn)肝臟炎癥過程在ALD的發(fā)病中起重要作用，這種增強(qiáng)的炎癥反應(yīng)會(huì)進(jìn)一步損害腸道屏障功能。脂多糖與Toll 樣受體TLR4 結(jié)合誘導(dǎo)了NF-κB 基因的活性，促使細(xì)胞因子（cytokines）和趨化因子（chemokines）等炎癥因子的產(chǎn)生，這些過度產(chǎn)生的分子最終導(dǎo)致肝臟慢性炎癥的惡性循環(huán)[16]。

本研究結(jié)果表明：植物乳桿菌C181 顯著提高了酒精誘導(dǎo)小鼠肝臟中Nrf-2 基因的表達(dá)水平，并且降低了NF-κB 的表達(dá)水平。Ahmed 等[17]研究了Nrf-2 和NF-κB 的相互作用，證明Nrf-2 的激活可以抑制NF-κB 的表達(dá)。

2.5 植物乳桿菌C181 對(duì)酒精肝損傷小鼠腸道菌群的影響

2009年，Keshavarzian 等[18]通過慢性酒精性肝損傷大鼠模型實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)酒精引起肝損傷外腸道出現(xiàn)損傷，大鼠腸道的通透性增加，內(nèi)毒素腸滲漏。在酒精性肝病中出現(xiàn)腸道損傷的原因可以用“肝腸軸”原理解釋。酒精性肝病發(fā)生后，肝臟細(xì)胞合成并釋放大量炎癥因子，破壞腸黏膜細(xì)胞的緊密連接，造成腸道損傷。酒精性肝病造成腸道損傷后，患有酒精肝的小鼠腸道中內(nèi)毒素透過小腸黏膜進(jìn)入血液，并進(jìn)入肝臟，加重肝臟的損傷。本文對(duì)大腸桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌進(jìn)行定量分析，研究腸道菌群變化與酒精肝損傷之間的關(guān)系。各組糞便樣品中細(xì)菌定量分析結(jié)果見圖5。正常對(duì)照組和酒精模型組相比，大腸桿菌數(shù)量顯著增高了1 個(gè)數(shù)量級(jí)，攝入植物乳桿菌C181 后大腸桿菌的數(shù)量顯著下降，與對(duì)照組比差異不顯著。與對(duì)照組相比，酒精模型組中的乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量呈現(xiàn)顯著下降，下降1 個(gè)數(shù)量級(jí)。攝入植物乳桿菌C181 后，乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量都顯著提高，高劑量組接近對(duì)照組，其中乳酸桿菌的數(shù)量甚至高出對(duì)照組2 個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖4 植物乳桿菌C181 對(duì)酒精肝損傷小鼠肝臟Nrf-2，NF-κB mRNA 表達(dá)的影響Fig4 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on liver Nrf-2，NF-κB mRNA levels in chronic alcohol-induced mice

圖5 植物乳桿菌C181 對(duì)酒精肝損傷小鼠腸道菌群的影響Fig.5 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on intestinal floras in chronic alcohol-induced mice

2.6 植物乳桿菌C181 對(duì)酒精肝損傷小鼠腸道相關(guān)基因表達(dá)的影響

Zhong 等[19]通過酒精性肝病小鼠模型證明慢性酒精會(huì)導(dǎo)致腸道緊密連接受損，腸道通透性升高，進(jìn)而導(dǎo)致脂多糖吸收量增加，最終導(dǎo)致肝臟損傷。Kirpich 等[20]發(fā)現(xiàn)益生菌通過調(diào)整腸道菌群和肝臟酶活水平緩解患者的酒精性肝損傷。腸上皮細(xì)胞屏障主要由緊密連接控制，它是腸黏膜屏障具有選擇通透性的基礎(chǔ)，以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。由于緊密連結(jié)蛋白ZO-1、Occludin、Claudin 是構(gòu)成緊密連結(jié)的重要組成成分[21]，因此對(duì)ZO-1、Occludin、Claudin 的表達(dá)情況進(jìn)行研究。圖6 結(jié)果顯示，4 周慢性酒精攝入后，ZO-1、Occludin、Claudin 的mRNA 表達(dá)水平明顯下降。加入植物乳桿菌C181 后，三者mRNA 的表達(dá)水平明顯升高，并與劑量呈正相關(guān)，表明植物乳桿菌C181 能有效改善慢性酒精引起的腸道屏障完整性、通透性相關(guān)基因的表達(dá)水平。

圖6 植物乳桿菌C181 對(duì)酒精肝損傷小鼠腸道ZO-1、Occludin 和Claudin 基因表達(dá)的影響Fig.6 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on intestinal ZO-1，Occludin and Claudin mRNA levels in chronic alcohol-induced mice

3 結(jié)論

本研究表明：山西老陳醋源植物乳桿菌C181可以通過上調(diào)酒精誘導(dǎo)小鼠肝臟中紅細(xì)胞核因子Nrf-2，下調(diào)NF-κB 基因的表達(dá)水平，從而調(diào)節(jié)肝臟的氧化應(yīng)激和炎癥因子的分泌，改善緩減酒精引起肝損傷。另外，C181 還顯著提高了腸道緊密連接蛋白相關(guān)基因ZO-1、Claudin 和Occludin 的表達(dá)，增強(qiáng)了腸道黏膜屏障功能，維持腸道菌群平衡和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，達(dá)到預(yù)防酒精性肝病的目的。本文為益生菌的酒精肝損傷預(yù)防機(jī)制以及保肝護(hù)肝微生態(tài)制劑的開發(fā)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。