心陽(yáng)片通過(guò)抑制NLRP3炎性小體保護(hù)慢性心力衰竭腎臟炎性損傷的作用及機(jī)制研究?

王俊巖，王陵軍，梁碧容，張 璐，冼紹祥，汪朝暉

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院， 廣州 510405； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 廣州 510405； 3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心， 廣州 510405； 4. 廣東省普通高校慢性心力衰竭中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510405； 5. 廣州市慢性心力衰竭中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510405)

慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)是常見(jiàn)的心血管疾病終末期階段，具有高發(fā)病率、高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康和生存質(zhì)量。由于CHF心臟搏出量不足，導(dǎo)致全身血液灌注不足以及回流受阻，進(jìn)一步導(dǎo)致組織器官缺血缺氧以及水鈉潴留，最終合并多種并發(fā)癥[1]。其中心腎綜合征是常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，屬于中醫(yī)學(xué)“心水”“水腫”等范疇。認(rèn)為心陽(yáng)不足無(wú)以溫腎，腎水不能上蒸無(wú)以榮心，心腎不交而加重本病的進(jìn)展[2-3]。對(duì)于慢性心力衰竭的治療臨床多采用益氣溫陽(yáng)活血利水治法進(jìn)行防治，課題組長(zhǎng)期從事心力衰竭及其并發(fā)癥防治工作，形成了一系列中醫(yī)藥防治心力衰竭的治法及方藥。心陽(yáng)片是益氣溫陽(yáng)活血利水的代表藥物，前期研究證實(shí)其能有效改善心功能、水鈉潴留等[4-5]。NOD樣受體蛋白3 (nOD-like receptor protein 3, NLRP3)是NLRs家族中的一員，與凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白(apoptosisassociated Speck-like Protein Cotaining, ASC)以及caspase1等形成炎癥復(fù)合體，介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)性疾病[6]。本研究從NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)為切入點(diǎn)，觀察益氣溫陽(yáng)活血利水中藥心陽(yáng)片對(duì)慢性心力衰竭小鼠腎功能保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

60只C57BL/6 J小鼠，體質(zhì)量(25±3) g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(粵)2018-0034。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由攝食與飲水。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(20190226030)。

1.2 藥物、試劑與儀器

心陽(yáng)片(批號(hào)20180401)及培哚普利叔丁胺片(雅施達(dá))由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部提供，由紅參、黃芪、益母草、毛冬青等組成。血肌酐、尿素氮檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；TNF-α、IL-6 Elisa試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；NF-κB p65 antibody、NLRP3 antibody、caspase1 antibody、IL1β antibody購(gòu)自武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司。二甲苯、無(wú)水乙醇購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠；免疫組化試劑盒、抗原修復(fù)液、DAB顯示液、蘇木素染色液、鹽酸乙醇均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。小動(dòng)物超聲(Vevo，2100)；PCR儀(Applied Biosystems，QuantStudio 3)；組織切片機(jī)(lecia)；酶標(biāo)儀(Tecan，M200 pro)；顯微鏡(Nikon，DS-Ri2)。

2 方法

2.1 分組、造模及干預(yù)

60只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、中藥低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組。采取主動(dòng)脈縮窄(TAC)術(shù)構(gòu)建壓力負(fù)荷型慢性心力衰竭模型，小鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，并在連接到呼吸機(jī)時(shí)進(jìn)行開(kāi)胸手術(shù)，使用27G針和8-0 縫線(xiàn)將主動(dòng)脈結(jié)扎在右無(wú)名動(dòng)脈和左頸總動(dòng)脈之間，使腹主動(dòng)脈截面積縮窄至原來(lái)的25%～30%左右，造成腹主動(dòng)脈縮窄，關(guān)閉胸腔。假手術(shù)組僅開(kāi)胸、穿線(xiàn)不結(jié)扎。按照人與小鼠體表面積換算給藥等效劑量，給予相應(yīng)劑量灌服。中藥低劑量組給予等效劑量治療，即0.34 g/kg，中藥中劑量組給予2倍等效劑量治療，即0.68 g/kg，中藥高劑量給予4倍等效劑量治療，即1.36 g/kg，陽(yáng)性對(duì)照組給予培哚普利等效劑量治療，即0.607 mg/kg，假手術(shù)組合模型組給予等量生理鹽水灌胃。給藥8周后，小動(dòng)物超聲檢測(cè)心功能，分離小鼠血清及腎臟組織分別固定于4%多聚甲醛中和-80 ℃冰箱中待測(cè)。

2.2 心功能測(cè)定

采用小動(dòng)物超聲檢測(cè)小鼠心功能水平。小鼠異氟烷麻醉后，脫毛膏將頸部至胸部皮毛脫掉后涂抹耦合劑后采用相應(yīng)探頭進(jìn)行超聲觀察，并計(jì)算小鼠射血分?jǐn)?shù)(EF)、收縮分?jǐn)?shù)(FS)值。

2.3 血清腎功能生化指標(biāo)檢測(cè)

采用深圳邁瑞B(yǎng)S-380全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平。將血清肌酐和尿素氮試劑加入儀器試劑區(qū)，取出凍存的血清，室溫融化后放入樣本區(qū)，設(shè)置儀器進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清TNF-α和IL-6水平

采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)各組小鼠血清TNF-α和IL-6水平變化，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.5 腎臟組織Masson染色

將4%多聚甲醛固定的腎臟組織進(jìn)行石蠟包埋后切片，染色前將石蠟切片脫蠟至水，蘇木素染細(xì)胞核5 min后自來(lái)水沖洗，1%鹽酸乙醇分化，自來(lái)水沖洗反藍(lán)，麗春紅染色5 min，蒸餾水快速漂洗，磷鉬酸水溶液處理約3 min，苯胺藍(lán)液復(fù)染5 min，1%冰醋酸處理1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后封片，顯微鏡下觀察并拍照分析。

2.6 免疫熒光法檢測(cè)腎臟NLRP3表達(dá)水平

將-80 ℃凍存的心臟組織進(jìn)行OTC包埋后行冰凍切片，染色前將冰凍切片進(jìn)行復(fù)溫，在組織周?chē)妹庖呓M化筆畫(huà)圈防止液體流走，山羊血清封閉30 min，室溫下一抗孵育1 h，PBS中洗3次，每次5 min；避光條件下室溫孵育熒光二抗30 min，PBS中洗3次，每次5 min；DAPI染色液室溫避光孵育10 min，PBS中洗3次，每次5 min，切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)NLRP3及DAPI表達(dá)情況并采集圖像。

2.7 免疫組化法檢測(cè)相關(guān)蛋白水平

采用免疫組化法檢測(cè)小鼠腎臟NF-κB p65、NLRP3、caspase1、IL1β蛋白表達(dá)情況。將4%多聚甲醛固定24 h后的腎臟組織進(jìn)行石蠟包埋，行6 μm厚度切片，烘片后進(jìn)行脫蠟復(fù)水后進(jìn)行免疫組化染色，將脫蠟復(fù)水的切片進(jìn)行抗原熱修復(fù)，3%過(guò)氧化氫溶液去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，BSA封閉，4 ℃一抗(1∶100稀釋)孵育過(guò)夜，次日PBS中洗3次，每次3 min；室溫下二抗孵育1 h，PBS中洗3次，每次3 min，除去PBS，切片上滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶試劑，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min，除去PBS，切片上滴加新鮮配制的DAB顯色試劑顯色，自來(lái)水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，PBS反藍(lán)，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2.8 RT-PCR法檢測(cè)腎臟組織相關(guān)mRNA水平表達(dá)

表1示，取30 mg腎臟組織，采用離心柱法提取總RNA，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，測(cè)定濃度后將所有樣本總RNA濃度稀釋為200ng/μL后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法加入擴(kuò)增反應(yīng)體系，40個(gè)循環(huán)后采用△△CT法進(jìn)行相對(duì)定量分析，檢測(cè)相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列表

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠EF、FS變化情況

小動(dòng)物超聲結(jié)果顯示，造模及治療8周后，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠心臟EF、FS水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及陽(yáng)性治療組治療后，小鼠心臟EF、FS水平明顯升高(P<0.01)，且各劑量組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 各組小鼠超聲心動(dòng)圖結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與模型組比較：## P<0.01圖2 各組小鼠EF、FS變化比較

注：與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與模型組比較：## P<0.01圖3 各組小鼠血清Cr、BUN水平變化比較

注：與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與模型組比較：## P<0.01圖4 各組小鼠血清Cr、BUN水平變化比較

3.2 各組小鼠血清Cr、BUN水平變化情況

腎功能檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠 SCr、BUN水平顯著升高；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組治療后，小鼠血清SCr、BUN水平顯著降低(P<0.01)，且各劑量組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.3 各組小鼠血清TNF-α和IL-6水平變化比較

ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較， 模型組小鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組治療后，小鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著降低(P<0.01)，且各劑量組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.4 各組小鼠腎臟纖維化情況

Masson染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腎臟有較多藍(lán)色膠原纖維沉積；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組藍(lán)色膠原纖維沉積明顯減少。

3.5 各組小鼠腎臟組織NLRP3蛋白表達(dá)變化比較

免疫熒光結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腎臟NLRP3熒光表達(dá)水平明顯升高；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腎臟NLRP3熒光表達(dá)水平明顯降低。

3.6 各組小鼠腎臟NF-κB p65、NLRP3、caspase1、IL1β蛋白表達(dá)變化比較

免疫組化結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腎臟NLRP3、Caspase1、IL1β、NF-κB p65水平明顯升高;與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腎臟NLRP3、Caspase1、IL1β、NF-κB p65水平明顯降低。

3.7 各組小鼠腎臟組織炎癥相關(guān)mRNA表達(dá)變化比較

RT-PCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腎臟NF-κB、IL 1β、IL 18、IL 6、TNF-α mRNA水平明顯升高;與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腎臟NF-κB、IL 1β、IL 18、IL 6、TNF-α mRNA水平明顯降低。

4 討論

近年來(lái)，隨著心血管介入技術(shù)等不斷發(fā)展，急性心肌梗死等急性心血管不良事件得到有效救治，是導(dǎo)致慢性心力衰竭發(fā)病率逐漸升高的原因之一。慢性心力衰竭的發(fā)生主要是由于各種因素導(dǎo)致心臟射血功能不足，心臟輸出量不能滿(mǎn)足身體正常活動(dòng)需要，在運(yùn)動(dòng)或勞累時(shí)明顯加重，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，并具有高死亡率的特點(diǎn)[7]。心力衰竭時(shí)伴有腎素-血管緊張素-醛固酮 (RAAS) 系統(tǒng)過(guò)度激活，將導(dǎo)致腎臟血流灌注不足合并腎臟損傷，心腎同時(shí)出現(xiàn)功能不全亦稱(chēng)為“心腎綜合征”[8]。根據(jù)其臨床癥狀其屬于中醫(yī)學(xué)“心悸”“水腫”“喘證”“怔忡”等范疇，認(rèn)為本病為本虛標(biāo)實(shí)之證，病位在心，累及肺、脾、腎、腦等全身臟腑組織器官，臨床多采用益氣溫陽(yáng)活血利水的方法進(jìn)行治療，在改善慢性心力衰竭癥狀的同時(shí)，亦能有效改善由于血液供應(yīng)不足導(dǎo)致的水腫、氣喘等多臟腑癥狀[9]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心腎兩臟之間的關(guān)系主要表現(xiàn)為水與火的關(guān)系，心在五行屬火，位居于上而屬陽(yáng)，腎在五行屬水，位居于下而屬陰[10]，心與腎無(wú)論是在臟腑經(jīng)絡(luò)聯(lián)系上還是功能相互作用，均有著密切關(guān)系。在經(jīng)絡(luò)聯(lián)系上心腎二經(jīng)均為少陰經(jīng)所屬，在功能上腎主一身之元陰元陽(yáng)，心為生之本，二者相互滋生，共同維持身體的陰陽(yáng)平衡[11]。益氣溫陽(yáng)活血利水中藥心陽(yáng)片為我院院內(nèi)制劑，被廣泛應(yīng)用于臨床，心陽(yáng)片由紅參、黃芪、益母草、毛冬青、熟附子等組成，具有益氣溫陽(yáng)、活血通絡(luò)、利水平喘功效，主要應(yīng)用于氣陽(yáng)虧虛挾痰瘀型心力衰竭，研究證明能有效改善心衰癥狀，改善血流動(dòng)力學(xué)，延緩心衰進(jìn)程[12-14]。因此，本研究以“水火相濟(jì)”理論為基礎(chǔ)，觀察慢性心力衰竭對(duì)腎臟功能及炎性反應(yīng)的影響以及益氣溫陽(yáng)活血利水法的干預(yù)，并探討其可能機(jī)制。

注：圖中箭頭所指的藍(lán)色位置為膠原蛋白沉積圖5 各組小鼠腎臟Masson染色結(jié)果比較(20×)

注：圖中箭頭所指的位置為NLRP3蛋白表達(dá)陽(yáng)性圖6 各組小鼠腎臟NLRP3蛋白表達(dá)水平比較(20×)

注：圖中箭頭所指的位置為蛋白表達(dá)陽(yáng)性圖7 各組小鼠腎臟NF-κB p65、NLRP3、caspase1、IL1β蛋白表達(dá)水平比較(20×)

注：與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與模型組比較：## P<0.01圖8 各組小鼠腎臟炎癥相關(guān)指標(biāo)mRNA表達(dá)水平比較

研究表明，腎臟組織的炎性反應(yīng)是腎臟疾病的主要病理反應(yīng)和誘因，因此防治腎臟炎性反應(yīng)在防治腎臟損傷及纖維化中具有重要意義[15]。NLRP3與ASC及caspase1形成的炎癥復(fù)合體是炎性反應(yīng)中研究最多的炎癥小體，即NLRP3炎癥小體，它能夠誘導(dǎo)IL1β、IL 1β、IL 18、IL 6等炎癥因子釋放而引起炎癥反應(yīng)。研究證實(shí)，NLRP3炎癥小體信號(hào)激活主要通過(guò)NF-κB信號(hào)啟動(dòng)IL1β和NLRP3前體蛋白表達(dá)，并在活化的caspase1作用下促進(jìn)下游炎癥因子成熟分泌，進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥損傷[16]。有研究表明，NLRP3炎性小體活化能夠加快腎臟損傷進(jìn)程[17]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性心力衰竭時(shí)NF-κB表達(dá)明顯升高，且參與心室重構(gòu)、炎癥反應(yīng)等重要病理過(guò)程[18-19]。因此，本課題組提出慢性心力衰竭是否通過(guò)引起NF-κB表達(dá)升高激活腎臟NLRP3炎性反應(yīng)信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟損傷的假說(shuō)，且益氣溫陽(yáng)活血利水法改善心功能的同時(shí)是否能夠通過(guò)調(diào)控NF-κB/NLRP3信號(hào)通路改善腎臟炎性損傷。

腎臟Masson染色發(fā)現(xiàn)，CHF小鼠腎臟膠原蛋白沉積明顯增多，表明CHF小鼠腎臟已經(jīng)發(fā)生纖維化改變。經(jīng)心陽(yáng)片治療后，CHF小鼠心功能明顯改善的同時(shí)腎臟纖維化水平亦明顯減低，表明心陽(yáng)片在改善心功能的同時(shí)能夠抑制腎臟纖維化。腎臟組織免疫熒光及免疫組化染色觀察相關(guān)蛋白水平顯示，CHF小鼠腎臟NLRP3、Caspase1、IL1β、NF-κB p65水平明顯升高，經(jīng)心陽(yáng)片治療后各組小鼠腎臟NLRP3、Caspase1、IL1β、NF-κB p65水平明顯降低。RT-PCR結(jié)果顯示，CHF小鼠腎臟NF-κB、IL 1β、IL 18、IL 6、TNF-α mRNA水平明顯升高。與模型組比較，經(jīng)心陽(yáng)片后各組小鼠腎臟NF-κB、IL 1β、IL 18、IL 6、TNF-α mRNA水平明顯降低。結(jié)果表明，益氣溫陽(yáng)活血利水中藥心陽(yáng)片在改善CHF小鼠心功能的同時(shí)，能夠改善腎臟炎性反應(yīng)并抑制纖維化，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控NF-κB/NLRP3信號(hào)通路、抑制炎性反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。課題組亦進(jìn)一步采用多種動(dòng)物模型和細(xì)胞水平進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)行多角度多靶點(diǎn)探討，深入闡明慢性心力衰竭對(duì)腎功能的影響，構(gòu)建“水火相濟(jì)”理論內(nèi)涵網(wǎng)絡(luò)。