NPRL2在結直腸癌中的抗腫瘤作用

何麗媛， 陳 晶， 劉艾蕓

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150086

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種常見的消化道惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的健康，全世界CRC的發(fā)病率正在逐年上升[1-2]。美國癌癥協(xié)會調(diào)查發(fā)現(xiàn)，50歲以下年齡段的CRC發(fā)病率近年來有明顯的上升趨勢[3]。中國近10年來CRC發(fā)病率和死亡率均呈明顯的升高趨勢[4]。在CRC早期或腺瘤期發(fā)現(xiàn)病灶并及時切除是降低CRC患者相關死亡率的有效方法。術后有效的藥物治療有利于預防CRC的復發(fā)，延長患者的生存時間[5]。雖然結腸鏡水平較前有很大的進步，化療藥物的種類和療效較前也有所提高，但目前CRC的預防和治療仍是重大的公共衛(wèi)生問題。這些情況表明，早期診斷CRC進而采取相應治療措施是非常有必要的，其中早期診斷顯得尤為重要。CRC從腺瘤到侵襲性癌的進展是一個多步驟、多因素綜合參與的復雜生物學過程，一系列癌基因和抑癌基因的異常表達與CRC進展密切相關，其中抑癌基因表達受到抑制被認為是觸發(fā)腫瘤發(fā)生的重要機制[6]。因此，通過檢測某些基因從而在腫瘤早期及時干預并阻止腫瘤進展能大大提高CRC的早期診斷和預后。

1 NPRL2基因結構及生物學功能

1.1 NPRL2基因的結構NPRL2(又稱抑癌候選基因4,TUSC4)早在30年前就被認為是抑癌基因，在生物物種間具有高度保守性。NPRL2位于染色體3p21.3區(qū)域，有學者發(fā)現(xiàn)，NPRL2基因及其產(chǎn)物在人類多種癌組織和癌細胞系中出現(xiàn)了功能障礙和大量蛋白表達丟失的現(xiàn)象，其機制可能是基因異常剪接、轉錄及多個外顯子缺失或基因內(nèi)純合子缺失導致NPRL2基因克隆的無義和錯義突變，結果為NPRL2基因表達下調(diào)或沉默[7]。NPRL2的雜合性丟失和純合子缺失經(jīng)常發(fā)生在人類各種類型癌癥的早期發(fā)展階段[7-8]。NPRL2基因通過不同剪接方式編碼成多種剪接異構體在不同組織中表達。NPRL2蛋白是NPRL2基因編碼的由380個氨基酸組成的蛋白質，表達于人體多種組織和器官，包括肺和睪丸[7]。

1.2 NPRL2基因在腫瘤組織中的生物學功能人類多種正常組織可以表達NPRL2基因，但發(fā)現(xiàn)在一些腫瘤組織中NPRL2基因表達較正常組織減少或增加[9-10]。先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物中，NPRL2可以抑制細胞生長并增強對包括順鉑在內(nèi)的許多抗癌藥物的敏感性[11]。在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，NPRL2基因在前列腺癌組織中表達異常升高，干擾NPRL2在前列腺癌組織中的表達后，癌組織的凋亡增加，侵襲和轉移受到抑制[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，NPRL2在人類膠質瘤中的表達降低，上調(diào)NPRL2表達可以通過抑制PDK1-AKT1信號通路及其下游基因的活性，顯著抑制膠質瘤的增殖[13]。在一些腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，NPRL2基因的抑癌效果可能是通過參與DNA錯配修復、調(diào)控細胞周期信號傳導、誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖等途徑作用的[7-8]。此外，NPRL2基因過表達可通過抑制自噬相關通路的mTORC1蛋白，促進腫瘤細胞的自噬，抑制凋亡，促進腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性，進而促進腫瘤的進展，這一機制已在前列腺癌的研究中被證實[14]。共濟失調(diào)毛細血管擴張突變基因(ataxia telangiectasia mutated，ATM)是與DNA損傷檢驗有關的一個重要基因，前列腺癌細胞中ATM蛋白水平高于正常組織，p-ATM(phospho-ATM)是ATM的磷酸化形式，p-ATM的激活可促進腫瘤細胞存活。NPRL2是ATM的正調(diào)控因子，在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，NPRL2通過增加ATM和p-ATM，保護前列腺癌細胞，促進其生長[15-17]。由此看出，抑癌基因NPRL2通過不同的信號通路對不同類型腫瘤組織的發(fā)生、發(fā)展和預后產(chǎn)生不同的效果。

1.3 NPRL2基因的其他生物學功能有學者發(fā)現(xiàn)，敲除了NPRL2基因的動物肌肉纖維明顯更大，纖維型組成改變，快速收縮糖酵解纖維增多，慢收縮氧化纖維減少[18]。敲除了肌肉中NPRL2基因后的小鼠跑步行為發(fā)生了改變，葡萄糖耐量比之前增強。此外，還發(fā)現(xiàn)NPRL2基因的缺失會誘導有氧糖酵解并抑制葡萄糖進入檸檬酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA)[18]。NPRL2基因的突變與局灶性癲癇發(fā)作有一定聯(lián)系[19]。此外，還發(fā)現(xiàn)NPRL2突變體果蠅的胃腸道衰老過程加快。NPRL2突變體果蠅的中腸可表現(xiàn)出腸道長度短、腸道干細胞增殖率高、代謝功能紊亂等與年齡相關的表型[20]。

2 NPRL2在CRC中的抗腫瘤作用

2.1 NPRL2在CRC組織及外周血中的表達在CRC的研究中發(fā)現(xiàn)，CRC組織中NPRL2 mRNA和蛋白水平較正常結腸組織均明顯降低[21]。相關實驗證實，在腺瘤期NPRL2蛋白表達已經(jīng)開始降低，低分化腫瘤中NPRL2的表達顯著低于高分化或中分化腫瘤，在CRC中該基因表達顯著低于腺瘤[21]。結直腸腫瘤中NPRL2 mRNA表達隨著腫瘤進展和組織學分級而降低[21]。血液中NPRL2 mRNA表達水平與腫瘤組織中NPRL2 mRNA表達水平呈正相關。腺瘤患者血液中的NPRL2 mRNA水平明顯低于正常組[21]。綜上，NPRL2與CRC發(fā)生、發(fā)展有關，并且該基因的表達水平與CRC組織分化程度相關。在CRC患者中外周血中NPRL2 mRNA水平低于正常人這一發(fā)現(xiàn)提示我們，NPRL2相關的血清學檢查有望成為發(fā)現(xiàn)早期CRC的一種手段，但具體的靈敏性和特異性還需進一步的研究。

2.2 NPRL2對CRC的影響

2.2.1 NPRL2通過調(diào)節(jié)細胞周期進而抑制CRC的發(fā)生、發(fā)展：NPRL2作為抑癌基因能有效調(diào)節(jié)CRC細胞的細胞周期，使其受阻于G1期，并抑制CRC細胞增殖，阻止CRC細胞侵襲及遷移[22]。這一發(fā)現(xiàn)為NPRL2抑制CRC發(fā)生、發(fā)展提供了強有力的證據(jù)。

2.2.2 NPRL2促進CRC細胞的凋亡和自噬：細胞凋亡也被稱為細胞程序性死亡，是細胞停止生長和分裂，最終進入一個導致細胞受控死亡的過程，其內(nèi)容物不會泄漏到周圍環(huán)境中。然而，細胞凋亡機制的失控是癌癥的一個標志。細胞凋亡過少會導致在癌組織中觀察到的細胞不受控制地生長和分裂[23]。DNA損傷誘導細胞凋亡可以清除癌前病變中潛在的有害細胞，從而阻礙腫瘤的生長。細胞凋亡的改變不僅與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關，還與腫瘤對治療的耐藥性有關[24]。

自噬是一個將細胞成分如大分子蛋白質甚至整個細胞器通過雙膜自噬體結構包裹運輸?shù)饺苊阁w降解的過程。降解產(chǎn)物中的一些成分既可以被循環(huán)利用來創(chuàng)建新的細胞結構和細胞器，也可以被進一步加工和用作能源以支持代謝和促進細胞存活[23]。自噬過程是一個保持細胞穩(wěn)定狀態(tài)的重要機制，其失調(diào)參與了多種疾病發(fā)生，如代謝紊亂、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫改變和癌癥，可以利用自噬來清除衰老細胞和破壞腫瘤病變[25]。調(diào)節(jié)自噬被認為是一種潛在的治療癌癥的策略。

NPRL2轉染的CRC腫瘤細胞中，抗凋亡因子Bcl-2降低，促凋亡因子Bax、caspase-3、caspase-7升高[22]，進一步提示了NPRL2可能通過促進CRC細胞的凋亡抑制腫瘤進展。既往在CRC的研究中發(fā)現(xiàn)，NPRL2基因過表達能夠促進CRC HT29細胞的自噬，但這種自噬可以抑制由NPRL2基因引起的凋亡[26]。研究還發(fā)現(xiàn)，NPRL2誘導的CRC HT29的自噬可以被自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制，導致腫瘤細胞活性降低，增殖被抑制，凋亡被促進[26]。NPRL2既能促進CRC組織的凋亡，又能促進自噬，這提示我們可以通過基因治療的手段將NPRL2促進CRC組織凋亡和自噬的作用效果放大，進而抑制CRC的發(fā)生、發(fā)展。

2.2.3 NPRL2與化療藥物共同作用促進CRC細胞對化療藥的敏感性：5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)多年來一直是CRC的首選化療藥物，有研究表明，NPRL2過表達通過下調(diào)PI3K/Akt/mTOR網(wǎng)絡功能，增強5-FU敏感性，導致CRC細胞增殖受到抑制，G1細胞周期阻滯。NPRL2轉導和5-FU分別處理CRC細胞后細胞凋亡明顯增加。且NPRL2過表達和5-FU聯(lián)合治療對細胞凋亡的促進作用比單獨干預更顯著[27]。有研究表明，NPRL2可通過抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路活化等途徑來增加奧沙利鉑(Oxaliplatin，L-OHP)的治療敏感性，逆轉腫瘤細胞對L-OHP的耐藥性[28]。另外研究發(fā)現(xiàn)，NPRL2過表達可通過激活DNA損傷檢查點途徑抑制結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡和G2/M細胞周期阻滯，從而提高伊利替康的敏感性[29]。NPRL2與化療藥物共同作用于CRC促進化療藥物對腫瘤組織的敏感性，促進腫瘤組織凋亡，提示我們可以將基因治療和化療藥物聯(lián)合以改善CRC的治療效果。

2.2.4 體內(nèi)實驗證實NPRL2在CRC中的抗腫瘤作用：體外實驗對于評估CRC治療的可行性和有效性有一定的局限性，有學者通過建立CRC裸鼠異種移植模型證實了NPRL2在體內(nèi)對CRC組織的抗腫瘤作用。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，NPRL2轉染的腫瘤組織中抗凋亡因子Bcl-2降低，促凋亡因子Bax、caspase-3、caspase-7升高，磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-Akt)下調(diào)?；钚越Y構Akt已經(jīng)在人類的多種癌癥中被證實，Akt的不受控制的激活會導致癌癥的發(fā)展。這些結果與體外實驗NPRL2促進CRC腫瘤細胞凋亡的結果一致。在CRC體內(nèi)異種移植模型中，NPRL2降低了腫瘤體積和重量，增強了細胞凋亡[30]。體內(nèi)實驗進一步證實了NPRL2在CRC中有抑制腫瘤組織進展的作用。

體內(nèi)實驗同時驗證了NPRL2具有增強CRC細胞對L-OHP和5-FU敏感性的作用。多重耐藥(multi-drug resistance，MDR)是腫瘤化療失敗的主要原因。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是最具特征的MDR轉運蛋白，是公認的腫瘤治療中戰(zhàn)勝MDR的靶點[31]。MRPs，特別是多藥耐藥蛋白(multidrug resistance protein 1，MRP1)，促進對化療藥物的耐藥性[32]。NPRL2轉染和L-OHP、5-FU處理腫瘤后，P-gp和MRP1的表達降低，促凋亡因子Bax、caspase-3、caspase-7升高，抗凋亡因子Bcl-2降低[30]。這一結果表明，體內(nèi)實驗中NPRL2也能降低CRC對化療藥物的耐藥性，NPRL2聯(lián)合化療藥物可以促進CRC細胞的凋亡。

體內(nèi)實驗為NPRL2抑制CRC組織發(fā)生、發(fā)展提供了更有力的證據(jù)。同時，體內(nèi)實驗中將NPRL2裝載進慢病毒中，然后通過靜脈注射的方式將慢病毒導入CRC裸鼠異種移植模型，使其過表達NPRL2，這種方法給我們基因治療CRC的方式予以提示。

3 總結

綜上所述，抑癌基因NPRL2能通過調(diào)節(jié)CRC細胞周期抑制CRC細胞的發(fā)生、發(fā)展，并且能促進CRC細胞的凋亡和自噬，增強CRC細胞對多種化療藥物的敏感性。體內(nèi)實驗進一步表明，NPRL2通過調(diào)控凋亡因子和Akt的激活發(fā)揮抗腫瘤作用，并且可以增強CRC細胞對L-OHP和5-FU的敏感性。這些結果提示我們NPRL2基因有望成為CRC新的治療方向，并且將NPRL2與藥物聯(lián)合可以作為CRC新的治療策略。腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制多種多樣，NPRL2基因對于CRC的抑制作用或許遠不止是通過抑制細胞周期、促進腫瘤細胞凋亡和自噬這幾種方式，探索NPRL2基因抑制CRC進展作用的其他方式或通路很有必要。但同時，由于NPRL2在人體多種正常組織中均有表達，還發(fā)現(xiàn)在前列腺癌等組織中NPRL2能促進腫瘤組織生長，因此，要將NPRL2應用到CRC的基因治療中，仍有很多問題需要解決。