基于公共數(shù)據(jù)庫分析CLDN10與MYH10在腎透明細胞癌中表達及預(yù)后的意義

劉 波 姚雪婷 路 卯 王辰飛

腎癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計2018年全球腎癌新發(fā)病例約40.32萬例，死亡人數(shù)約17.50萬例，并且其發(fā)病率和死亡率仍在上升[1]。腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是腎癌常見的病理類型，因其對放化療不敏感，所以治療效果仍較差。

CLDN10(claudin 10)，位于人類13號染色體，是Claudin家族成員之一。它們是1種與細胞間連接相接觸的骨架蛋白，并且能夠保持細胞間的動態(tài)平衡[2]。研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中表達失調(diào)并且發(fā)揮著重要的作用。

MYH10(myosin,heavy polypeptide 10,non-muscle)，非肌球蛋白重鏈10，位于人類17號染色體，編碼非肌球蛋白IIB (NM IIB)，參與腫瘤細胞遷移、侵襲、細胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)生和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程[3]。本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫提取腎透明細胞癌基因芯片數(shù)據(jù)進行差異基因表達譜分析，并對篩選得到的差異基因進行功能注釋，進一步通過GEPIA數(shù)據(jù)庫提取CLDN10與MYH10在腎透明細胞癌中表達的數(shù)據(jù)并分析其與腎透明細胞癌預(yù)后的關(guān)系，為研究腎癌的發(fā)病機制及預(yù)測預(yù)后提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 GEO數(shù)據(jù)庫

通過在NBCI的GEO(gene expression omnibus)數(shù)據(jù)庫中搜索“clear cell renal cell carcinoma”經(jīng)篩選得到腎透明細胞癌患者基因表達譜數(shù)據(jù)集GSE105261[4]。GSE105261包含了44例基因表達譜數(shù)據(jù)集，其中9例正常對照腎組織、9例原發(fā)性腎透明細胞癌和26例轉(zhuǎn)移性腎透明細胞癌組織。采用R語言軟件(https://www.r-project.org/)進行基因芯片質(zhì)量分析和篩選差異基因。差異基因篩選采用R語言中的limma包對得到的基因表達譜矩陣文件進行差異基因篩選,以滿足log2FC>1或log2FC<-1，P<0.05為候選差異基因。

1.2 DAVID數(shù)據(jù)庫

使用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對篩選得到的差異基因進行GO(gene ontology)、KEGG(KEGG pathway)富集分析和功能注釋，下載結(jié)果數(shù)據(jù)進行進一步整理分析。

1.3 GEPIA數(shù)據(jù)庫

通過GEPIA[5](http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫對CLDN10與MYH10在腎透明細胞癌與正常對照組織中的表達量進行對比和相關(guān)性分析，并分析它們與腎透明細胞癌患者的病理分期及生存預(yù)后的關(guān)系，下載分析結(jié)果數(shù)據(jù)進一步整理。

1.4 HPA數(shù)據(jù)庫

HPA數(shù)據(jù)庫[6](http://www.proteinatlas.org/)，是基于RNA測序分析和免疫組化分析的大型轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)庫。本研究中，從該數(shù)據(jù)庫獲取CLDN10與MYH10蛋白在人正常腎臟組織中表達的圖譜，引用網(wǎng)站中CLDN10抗體(HPA042348)、MYH10抗體(CAB017180)對正常組織進行免疫組化檢測結(jié)果，其中CLDN10與MYH10各1例。

2 結(jié)果

2.1 腎透明細胞癌中差異基因的表達

使用R語言分析了從GEO數(shù)據(jù)庫獲取的GSE105261數(shù)據(jù)集，該芯片平臺為GPL10558(Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip)，結(jié)果共篩選出了438個差異基因，這些差異基因包含了CLDN10(log2FC=-1.42，P=6.47×10-4)與MYH10(log2FC=-1.53，P=5.91×10-7)。

2.2 差異基因的富集分析及功能注釋

使用DAVID數(shù)據(jù)庫對篩選出來的438個差異基因進行GO和KEGG分析，結(jié)果顯示這些差異基因在生物過程(Biological Progress)中主要集中在分泌過程，細胞組分(Cellular Component)中主要集中在細胞外的外泌體，分子功能(Molecular Function)中主要集中在細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成，KEGG通路分析主要集中在抗生素的生物合成。

2.3 CLDN10、MYH10在腎透明細胞癌中表達及相關(guān)性

使用GEPIA數(shù)據(jù)庫檢測了CLDN10、MYH10的mRNA在腎透明細胞癌及正常腎組織中的表達水平，其中腫瘤組523例，正常對照組100例。結(jié)果顯示，CLDN10、MYH10的mRNA在正常對照組中表達較腫瘤組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。對CLDN10、MYH10的表達進行相關(guān)性分析顯示，CLDN10、MYH10在腎透明細胞癌中表達呈明顯正相關(guān)(R=0.61，P<0.05)，見圖2。我們還使用了HPA數(shù)據(jù)庫獲取了CLDN10、MYH10在正常腎組織中蛋白表達水平，CLDN10、MYH10在正常腎組織中陽性表達。

圖1 CLDN10、MYH10的mRNA在正常組織及腎透明細胞癌中的表達水平

圖2 CLDN10、MYH10在腎透明細胞癌中表達的相關(guān)性分析結(jié)果

2.4 CLDN10、MYH10與病理分期的關(guān)系

通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析了CLDN10、MYH10與腎透明細胞癌患者病理分期的關(guān)系，結(jié)果顯示，CLDN10、MYH10的表達水平與患者的病理分期呈負相關(guān)(P<0.05)，見圖3。

圖3 CLDN10、MYH10與病理分期的關(guān)系

2.5 CLDN10、MYH10與患者預(yù)后的關(guān)系

通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析CLDN10、MYH10表達與腎透明細胞癌患者生存預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，CLDN10、MYH10與患者的總生存率及無病生存率明顯相關(guān)，CLDN10在腎透明細胞癌患者中，高表達組的患者較低表達組患者的總生存率(lograngkP=10-7，HR=0.43，P(HR)=2.3×10-7)及無病生存率(lograngkP=5.7×10-6，HR=0.43，P(HR)=1.1×10-5)高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MYH10在腎透明細胞癌患者中，高表達組的患者較低表達組患者的總生存率(lograngkP=1.4×10-4，HR=0.55，P(HR)=1.8×10-4)及無病生存率(lograngkP=0.029，HR=0.67，P(HR)=0.031)高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

注：A為CLDN10高表達與低表達患者的總生存曲線分析；B為CLDN10高表達與低表達患者的無病生存曲線分析；C為MYH10高表達與低表達患者的總生存曲線分析；D為MYH10高表達與低表達患者的無病生存曲線分析。圖4 CLDN10、MYH10與腎透明細胞癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

目前，腎癌的診斷仍主要依靠影像學(xué)檢查結(jié)果，而治療方式仍然是以手術(shù)為主，針對轉(zhuǎn)移性腎癌患者則主要是射頻消融、化療、免疫治療等[7]，但治療效果仍不理想，因此探索腎癌診斷及預(yù)測預(yù)后的生物標志物和治療靶點，對于提高患者的生存率及降低死亡率尤為重要。CLDN10在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不同的作用，如在骨肉瘤中CLDN10可以通過激活JAK1/Stat1信號通路來增強骨肉瘤細胞的轉(zhuǎn)移，從而促進腫瘤的進展[8]。Zhou等[2]研究報道CLDN10在甲狀腺乳頭狀癌中高表達并且發(fā)揮著重要的促癌作用，其高表達與患者的年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學(xué)類型相關(guān)，通過體外細胞實驗研究也證實了沉默CLDN10可明顯抑制腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲。在本研究中利用多個數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，CLDN10在腎透明細胞癌中表達較正常對照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且與患者的腫瘤分期、總生存率及無病生存率明顯相關(guān)(P<0.05)，對其功能的注釋表明其可能與細胞凋亡相關(guān)。據(jù)此，CLDN10可能在腎透明細胞癌中揮發(fā)著重要的抑癌作用，其可能成為1個預(yù)測腎癌患者預(yù)后的重要生物標記物以及治療的靶點。本研究結(jié)果與先前多項研究報道結(jié)果一致，有研究發(fā)現(xiàn)CLDN10在肺腺癌中低表達并且與患者的總體生存相關(guān)[9]。Nordfors等[10]研究表明CLDN10在室管膜瘤中低表達，通過免疫組化結(jié)果分析顯示，CLDN10陽性表達者腫瘤分級較低。

MYH10，編碼非肌球蛋白IIB (NM IIB)，主要存在于神經(jīng)細胞、巨核細胞等非肌肉細胞中[11-12]。非肌球蛋白IIB在細胞黏附和遷移中具有重要作用[13]。研究表明MYH10在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也具有重要作用，在腦膠質(zhì)瘤中CLDN10作為1個致癌基因來調(diào)節(jié)腫瘤的進展，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)沉默CLDN10可明顯下調(diào)MTA-1、MPP-2、MMP-9、vimentin的表達，并上調(diào)TIMP-2、E-cadherin、collagen 1的表達從而抑制膠質(zhì)瘤細胞的遷移及侵襲，因此認為CLDN10參與腫瘤細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，對其機制的研究表明CLDN10是通過Wnt/β-catenin信號通路來促進膠質(zhì)瘤的進展的[3]。在本研究中，通過數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)MHY10也在腎透明細胞癌中表達較正常對照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且與患者的腫瘤分期、總生存率及無病生存率明顯相關(guān)(P<0.05)，通過DAVID數(shù)據(jù)庫對其功能的注釋表明其可能與細胞凋亡相關(guān)。據(jù)此，MYH10可能在腎透明細胞癌中揮發(fā)著重要的抑癌作用，其可能成為1個預(yù)測腎癌患者預(yù)后的重要生物標記物以及治療的靶點。另外通過數(shù)據(jù)庫分析還發(fā)現(xiàn) CLDN10表達與MYH10表達呈顯著正相關(guān)(R=0.61，P<0.05)，因此聯(lián)合檢測 CLDN10與MYH10的表達不但有助于了解腎透明細胞癌的發(fā)生發(fā)展，而且為預(yù)測腎透明細胞癌患者的預(yù)后結(jié)局提供了新方向。然而本研究仍有不足之處，主要局限于數(shù)據(jù)庫發(fā)掘的結(jié)果，仍需要通過體內(nèi)外實驗來驗證本研究結(jié)果才能明確CLDN10、MYH10在腎透明細胞癌中的具體作用機制。