脊髓損傷后血清miRNA-21表達(dá)與損傷程度的相關(guān)性分析

王 軍，姜利明,皮楊威,馬陽陽,趙東旭*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.脊柱外科；2.南湖院區(qū)神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130033)

脊髓損傷(SCI)，指由各種原因?qū)е伦倒軆?nèi)神經(jīng)結(jié)構(gòu) (包括脊髓和神經(jīng)根) 及其功能的損害,出現(xiàn)損傷水平及以下脊髓功能 (感覺、運(yùn)動(dòng)、反射等) 障礙[1]。脊髓損傷后會(huì)發(fā)生一系列病理生理變化，比如炎癥和免疫反應(yīng)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡等[2]，這些變化被認(rèn)為與基因表達(dá)模式的改變有關(guān)[3]，而這些改變通常伴隨基因網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。在已知的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控劑中，由于具有抑制mRNA翻譯的能力，微小核糖核酸(microRNAs， miR)備受學(xué)者關(guān)注，而且有研究表明 miRNA調(diào)節(jié)人類基因組中60%的基因[4]。miRNA存在于包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)在內(nèi)的所有系統(tǒng)中，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)疾病和神經(jīng)外傷性疾病，例如阿爾茨海默氏癥，帕金森氏癥和亨廷頓病，圖雷特氏綜合癥和精神分裂癥[5]。有一些研究使用微陣列分析檢測(cè)了脊髓損傷后大鼠和小鼠的miRNA表達(dá)譜，這在動(dòng)物模型中初步證實(shí)了幾種miRNA發(fā)生了顯著變化(如miR-21的過表達(dá))，并確定了其中一些調(diào)節(jié)因子的潛在下游靶點(diǎn)[6-7]。因此，miRNA 可能廣泛影響人類脊髓損傷后病理生理反應(yīng)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，而miR-21作為動(dòng)物模型中過表達(dá)的調(diào)節(jié)因子之一，在脊髓損傷患者中的表達(dá)水平仍然未知。因此，本研究旨在測(cè)定脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)患者血清中的miR-21水平，并基于損傷后時(shí)間、年齡和性別分析miR-21在脊髓損傷患者、非脊髓損傷患者和健康志愿者之間的差異表達(dá)模式，為脊髓損傷靶向藥物的研究和治療時(shí)機(jī)的選擇提供參考。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選擇在2018年9月至2019年9月吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院脊柱外科收治的脊髓損傷患者100例為脊髓損傷組(SCI組)，這些患者都經(jīng)臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查確診無誤；非脊髓損傷組(NSCI組)為無中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的患者，共納入80例，包括下肢損傷44例，上肢損傷36例；健康組為醫(yī)院體檢中心進(jìn)行例行檢查的人群，共納入90例，這些人在入組前從未被診斷SCI。三組研究人群進(jìn)行了年齡、性別比等基本指標(biāo)的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求，在采集血樣之前，都簽署了知情同意書。

1.2 損傷程度的評(píng)價(jià)方法

脊髓損傷病人病情的嚴(yán)重程度與脊髓損傷程度有關(guān)，由具有5年以上臨床工作經(jīng)驗(yàn)的脊柱外科醫(yī)師根據(jù)臨床表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。完全性脊髓損傷表現(xiàn)為最低骶髓節(jié)段 (S4-5) 感覺和運(yùn)動(dòng)功能喪失 (即沒有骶殘留) ，完全性脊髓損傷應(yīng)在脊髓休克結(jié)束后確定,若脊髓損傷48 h后仍表現(xiàn)為脊髓休克,檢查確認(rèn)鞍區(qū)無感覺和運(yùn)動(dòng)功能,則按完全性脊髓損傷診斷；如果神經(jīng)損傷平面以下,包括最低骶髓節(jié)段 (S4-5) 保留任何感覺和(或)運(yùn)動(dòng)功能 (即存在骶殘留)，則判定為不完全性脊髓損傷[1]。

1.3 血清制備

所有研究參與者禁食一夜后，于清晨空腹抽取4 ml外周靜脈血。血樣在室溫下放置60 min。然后在700 g，4℃下超速離心(30 000 r/min)10 min后，立即將血清從血液中分離出來，冷凍并儲(chǔ)存在-80℃的冰箱中留待檢測(cè)。在樣品儲(chǔ)存期間，避免反復(fù)凍融，以確保樣品的質(zhì)量。

1.4 核酸提取和實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

根據(jù)制造商的使用說明書，使用TRIzol (Invitrogen，CA)和miRNeasy微型試劑盒(Qiagen，West Sussex，UK)分離總RNA，這樣可以有效地回收所有RNA，包括miRNA；使用NanoDrop分光光度計(jì)(ND-1000，Nanodrop Technologies)測(cè)量RNA的質(zhì)量和數(shù)量，并通過凝膠電泳確定RNA的完整性；使用引物逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本東京TaKaRa)將每個(gè)樣品的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；使用SYBR Premix Ex Taq(日本東京TaKaRa)和miR-21的miRNA特異性引物(中國廣州Ribobio)進(jìn)行qRT-PCR。將每個(gè)樣品的相對(duì)miRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化為U6表達(dá)。記錄周期閾值(CT)，其定義為熒光信號(hào)高于指示基線可變性的閾值所需的聚合酶鏈反應(yīng)周期數(shù)。基因表達(dá)的相對(duì)變化用2-ΔΔCt表示，即NSCI組和健康組miRNA-21原始拷貝數(shù)的差異。ΔΔCT= SCI組的(CTmiR-21-CTU6)-對(duì)照組的(CTmiR-21-CTU6)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 5.01和SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計(jì)分析采用雙向重復(fù)測(cè)量方差分析和圖基(Tukey)事后檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

在SCI患者中，存活患者的平均年齡為36.12±3.56歲；48名患者年齡在35歲以上，其他患者年齡在35歲以下；大多數(shù)SCI患者(76%)是由交通事故造成的，其余患者因高處墜落而受傷；43%的患者發(fā)生頸髓損傷，其他患者發(fā)生其他部位的脊髓損傷；有57例發(fā)生了完全性脊髓損傷，43例為不完全性脊髓損傷；在整個(gè)研究期間，脊髓損傷患者的死亡率為9%。NSCI組患者的平均年齡為39.22±4.45歲(男性56例、女性24例)，其中包括36例手臂損傷和44例腿部損傷。健康組包括55例男性患者，35例女性患者，平均年齡為38.3±2.35。SCI組患者與對(duì)照組(NSCI組和健康組)患者之間的年齡和性別分布無顯著差異，見表1。

表1 脊髓損傷人群的臨床特征

2.2 相關(guān)性分析

本研究定量分析了三組人群傷后第1天、7天、28天和3個(gè)月血清miR-21的相對(duì)表達(dá)水平(見圖1)。結(jié)果顯示SCI患者血清miR-21水平在傷后第1天明顯升高，在傷后第7天達(dá)到峰值，而在傷后第28天，基本與NSCI組及對(duì)照組持平，在之后miR-21的水平維持在對(duì)照水平。然而，在NSCI和對(duì)照組中，血清miR-21幾乎沒有變化。miR-21的水平與患者性別之間沒有相關(guān)性(見圖2A)。此外，miR-21的表達(dá)水平與患者年齡也無相關(guān)性(見圖2B)。脊髓損傷后第1天和第7天，完全性脊髓損傷組血清miR-21水平明顯高于不完全性脊髓損傷組(見圖3)，表明血清miR-21水平與損傷程度有關(guān)(P<0.001)。

圖1 脊髓損傷、非脊髓損傷以及對(duì)照組(NSCI和健康志愿者)的miR-21相對(duì)表達(dá)水平變化。數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(雙向重復(fù)測(cè)量方差分析和圖基事后檢驗(yàn))表示。SCI組與對(duì)照組的差異顯著性水平用星號(hào)表示：*P<0.05，**P<0.01

圖2 不同性別(A)和不同年齡(B)的人群脊髓損傷后血清中miR-21的相對(duì)表達(dá)水平變化

圖3 完全性脊髓損傷和不完全性脊髓損傷后血清中miR-21的相對(duì)表達(dá)水平變化

3 討論

脊髓損傷根據(jù)致病因素分創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性兩大類,創(chuàng)傷性脊髓損傷是最嚴(yán)重的損傷類型之一，交通事故和高空墜落是目前創(chuàng)傷性SCI 的兩大主要原因。全亞洲的SCI平均年患病率為12.1-61.6 人次/100萬[8]。近年來，脊髓損傷呈現(xiàn)出三高一低的發(fā)展趨勢(shì)，即高發(fā)病、高耗費(fèi)、高致殘及低齡化，已成為學(xué)術(shù)界亟需攻克的重大醫(yī)療難題。創(chuàng)傷性脊髓損傷病理生理反應(yīng)可分為三個(gè)階段，急性期為脊髓休克狀態(tài)；急性期之后的第二階段發(fā)生在傷后數(shù)分鐘或數(shù)周，包括血管改變，生化紊亂，細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和死亡；慢性期發(fā)生在傷后的數(shù)天到數(shù)年時(shí)間，這一階段的特征是細(xì)胞凋亡，瓦勒變性和瘢痕形成[3,9]。SCI發(fā)生后的病理生理變化與基因表達(dá)模式的改變有關(guān)，一方面，在損傷后的最初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，與炎癥和細(xì)胞死亡相關(guān)的基因會(huì)強(qiáng)烈上調(diào)，而與細(xì)胞興奮性和神經(jīng)傳遞有關(guān)的基因下調(diào)；在最初的幾周中，與炎癥和凋亡相關(guān)的基因仍持續(xù)上調(diào)，而調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架排列，髓鞘和突觸的基因表達(dá)下降，反映出組織完整性受損。另一方面，編碼血管生長、神經(jīng)生成和生長因子分泌的基因表達(dá)增加，試圖促進(jìn)神經(jīng)的存活和再生[3]。因此，改變miRNA的表達(dá)可能會(huì)極大地影響SCI的病理生理變化過程。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SCI后不同時(shí)間點(diǎn)的miR-21血清水平有不同的變化，這進(jìn)一步表明miRNA可能極大地影響SCI的病理生理和功能結(jié)局。

最近，有幾項(xiàng)研究證明了多個(gè)損傷模型中miR-21的異常表達(dá)。例如，微陣列分析表明，在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)(6-72小時(shí))測(cè)量，許多miRNA的水平都發(fā)生了改變，而大腦皮層中的miR-21始終處于高表達(dá)水平[10]。Redell等人發(fā)現(xiàn)嚙齒動(dòng)物創(chuàng)傷性腦外傷(TBI)后海馬中許多miRNA的表達(dá)發(fā)生了變化，其中miR-21的表達(dá)顯著增加，表達(dá)水平在受傷后3天達(dá)到峰值，并在受傷后數(shù)天恢復(fù)到正常水平[11]。另外，有學(xué)者在大鼠體內(nèi)敲除miR-21后，加重了神經(jīng)功能缺陷及組織的損傷，增加了大鼠脊髓損傷后細(xì)胞的凋亡程度[12]。顯然，大部分研究主要是集中于動(dòng)物模型中miR-21的表達(dá)上，這與患者有所不同。我們的研究是以患病人群為觀察組，脊髓未損傷人群和健康人群為對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的miR-21水平有不同的變化，這可能有助于臨床醫(yī)生在脊髓損傷后選擇合適的時(shí)間應(yīng)用適當(dāng)?shù)乃幬镞M(jìn)行靶向治療。