動(dòng)物支原體相關(guān)蛋白的免疫原性研究進(jìn)展

陳勝利，郝華芳，季文恒，儲(chǔ)岳峰

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046)

支原體(Mycoplasma)屬于原核生物界柔膜體綱支原體科，普遍存在于自然界，有200多個(gè)種，其中動(dòng)物支原體多達(dá)幾十種[1]。獸醫(yī)上最重要的支原體有絲狀支原體絲狀亞種(牛傳染性胸膜肺炎-牛肺疫病原)、豬肺炎支原體(豬地方性肺炎病原)、山羊支原體山羊肺炎亞種(山羊傳染性胸膜肺炎病原)、雞毒支原體等[2]，此外，牛支原體、滑液支原體等對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害日益嚴(yán)重，越來越受到重視。動(dòng)物支原體感染主要表現(xiàn)為慢性、持續(xù)性，難以根治，已成為威脅養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要病原。

目前，動(dòng)物支原體病的防控主要依賴疫苗和抗菌藥物，抗菌藥使用存在菌株耐藥性增加[3-7]、藥物殘留、病原很難被徹底清除等問題，臨床上應(yīng)用效果很不理想。疫苗是防控動(dòng)物支原體病的重要手段，目前，主要為滅活疫苗和弱毒疫苗[8-10]。亞單位疫苗具有安全高效、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，是支原體病疫苗研發(fā)的一個(gè)重要發(fā)展方向。目前，已對(duì)多種支原體病亞單位疫苗進(jìn)行研究，病原包括絲狀支原體絲狀亞種(Mycoplasmamycoidessubsp.Mycoides，Mmm)、豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)、牛支原體(Mycoplasmabovis，M.bovis)、雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum，MG)和山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae，Mccp)等，但迄今未有商業(yè)化的動(dòng)物支原體病亞單位疫苗。筆者對(duì)這幾種重要?jiǎng)游镏гw病相關(guān)蛋白的免疫原性進(jìn)行綜述，以期為動(dòng)物支原體的免疫和疫苗研究提供參考。

1 絲狀支原體絲狀亞種

Mmm是牛傳染性胸膜肺炎病原，是最重要的動(dòng)物支原體之一。Mmm免疫蛋白研究較為深入，部分免疫蛋白已試制亞單位疫苗，并進(jìn)行了牛體免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)。應(yīng)用蛋白組學(xué)方法鑒定了Mmm一些免疫蛋白和毒力相關(guān)蛋白[11-12]，如H2O2產(chǎn)生和莢膜合成相關(guān)蛋白。L-α-甘油磷酸鹽氧化酶(GlpO)是支原體H2O2產(chǎn)生的重要酶，是Mmm重要的毒力因子和免疫蛋白，GlpO重組蛋白混合弗氏完全佐劑免疫牛，可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，卻不能保護(hù)Mmm感染[13]?？缒ぶ鞍譒ppQ被認(rèn)為是Mmm的主要抗原和毒力因子，Mulongo等[14]用純化重組蛋白LppQ-N混合弗氏佐劑免疫牛，疫苗組表現(xiàn)出血清轉(zhuǎn)化強(qiáng)陽性，但與對(duì)照組相比，臨床癥狀和大體病變?cè)u(píng)分無顯著差異，且在攻毒后腎小球腎炎增強(qiáng)，提示LppQ-N不適合作為亞單位疫苗抗原。對(duì) Mmm 4種脂蛋白LppA、LppB、LppC 和LppQ的研究發(fā)現(xiàn)，雖然它們均能誘導(dǎo)體液免疫，但是體內(nèi)試驗(yàn)顯示僅LppA能被淋巴細(xì)胞識(shí)別，誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ，表明LppA是CD4+T細(xì)胞抗原，可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，可作為潛在疫苗抗原[15]。莢膜多糖(CPS)是Mmm一種重要的毒力因子，CPS偶聯(lián)卵清蛋白免疫牛能誘導(dǎo)牛產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，能夠減輕病變，具有一定的免疫保護(hù)作用[16]。Perez-Casal等[17]通過反向疫苗學(xué)和基因組分析方法系統(tǒng)鑒定了66個(gè)潛在亞單位疫苗候選抗原，將這些蛋白表達(dá)后按其被牛傳染性胸膜肺炎陽性牛血清識(shí)別的能力強(qiáng)弱進(jìn)行打分排序和分組，每組4～5個(gè)重組蛋白，配以CpG2007 ODN 和30% EmulsigenTM佐劑，制成疫苗免疫小牛，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在第35天各組針對(duì)每種蛋白的IgG1效價(jià)比免疫前顯著升高，且高于對(duì)照組，每種蛋白的IgG1滴度彼此之間無顯著差異；大多數(shù)蛋白可誘導(dǎo)IgG2和IgG1反應(yīng)，無免疫干擾；通過PBMC增殖試驗(yàn)來檢測(cè)細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)所有蛋白的抗原刺激指數(shù)與對(duì)照組之間無顯著差異，提示制備亞單位疫苗不能很好誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。攻毒保護(hù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) A組(MSC-0136+MSC-0957+MSC-0499+ MSC-0431+ MSC-0776，假定脂蛋白組)和C組(假定蛋白YP 004400559.1+假定蛋白YP 004399807.1 + Vsp+TE-Tu+脂蛋白MSC-0775)亞單位疫苗能夠提供保護(hù)，其中疫苗C組肺分離不到病原，N組(YP004400127.1+YP004399790.1+YP004400580.1+YP004400610.1)疫苗組可減輕病變，且肺病原分離陰性；其他重組蛋白疫苗組反而加重了病變；A組、C組和N組疫苗保護(hù)率分別為79.2%、83.0%和73.3%，結(jié)果表明，重組蛋白多組分亞單位疫苗可成功用于預(yù)防牛傳染性胸膜肺炎。研究提示，抗體介導(dǎo)的體液免疫在牛傳染性胸膜肺炎亞單位疫苗免疫保護(hù)中發(fā)揮主要作用[18]。

2 牛支原體

國內(nèi)外研究者做了大量的工作，鑒定出多個(gè)牛支原體免疫蛋白，如GAPDH、PdhA、Tuf、P48、P81等。最近郭愛珍教授團(tuán)隊(duì)通過基因組預(yù)測(cè)分析結(jié)合分泌蛋白組學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)牛支原體HB0801株有60個(gè) 分泌蛋白，分泌蛋白MbovP0581是一種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有強(qiáng)的免疫原性，能與牛支原體感染血清反應(yīng)，有作為疫苗抗原的潛力[19]。一些牛支原體蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)和免疫保護(hù)作用已被評(píng)估。GAPDH在牛支原體菌株中非常保守，參與糖酵解過程，被認(rèn)為是牛支原體的一種毒力因子和免疫保護(hù)抗原。Prysliak等[20]將牛支原體GAPDH與宿主防御肽組成嵌合蛋白Gap-I、嵌合蛋白Gap-I和牛支原體提取物作為疫苗抗原，與CpG2007佐劑混合制成亞單位疫苗，結(jié)果顯示亞單位疫苗可引起強(qiáng)烈的體液免疫，而細(xì)胞免疫較弱，不具有免疫保護(hù)作用。Mulongo等[21]將兩株牛支原體總蛋白和/或膜蛋白結(jié)合CpG ODN2007佐劑制備成疫苗，發(fā)現(xiàn)總蛋白和膜蛋白混合組能顯著引起IgG1血清學(xué)反應(yīng)，總蛋白組誘導(dǎo)明顯的IgG2反應(yīng)，但是均不能引起淋巴細(xì)胞記憶性應(yīng)答；攻毒后免疫組與對(duì)照組在臨床癥狀和病原分布無顯著差異，表明研制疫苗不具有免疫保護(hù)作用。Prysliak等[22]應(yīng)用SDS-PAGE、2D結(jié)合免疫印跡方法，鑒定出PdhA、Tuf、PepA、P48、P81、DeoB、OppA、LppB、O256、PepQ，它們可作為潛在疫苗候選蛋白，將這些重組蛋白、膜蛋白、總蛋白配合佐劑TriAdj后免疫犢牛，重組蛋白可產(chǎn)生IgG1或IgG2反應(yīng)，但沒有誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，不具有免疫保護(hù)作用。Th17細(xì)胞免疫應(yīng)答在多種支原體的抗感染中發(fā)揮重要作用，如肺支原體(M.pulmonis)[23]、肺炎支原體(M.pneumoniae)[24]等。研究者使用MontanideTMISA 61VG和Th17應(yīng)答誘導(dǎo)劑凝膠多糖為佐劑，牛支原體膜組分、總蛋白和9個(gè)重組蛋白(PdhA、Tuf、PepA、LppB、O256、OppA、DeoB、P81、PepQ)組成混合抗原，制成疫苗免疫犢牛，發(fā)現(xiàn)除膜組分外，其余抗原刺激PBMC均能引起Th17細(xì)胞反應(yīng)；該疫苗能夠誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，血清中IgG1、IgG2和IgA水平較對(duì)照組顯著上升；但疫苗組僅能輕微減輕牛支原體引起的肺部病變和體重下降，不具有免疫保護(hù)作用，表明該疫苗誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞免疫應(yīng)答不能對(duì)牛支原體感染提供有效保護(hù)[25]。牛支原體具有膜表面抗原高頻率變異、規(guī)避吞噬細(xì)胞吞噬作用、入侵宿主細(xì)胞、形成生物被膜以及免疫調(diào)節(jié)作用等方面逃避宿主天然和適應(yīng)性免疫[9,26-28]，使得亞單位疫苗的研制面臨諸多挑戰(zhàn)。本實(shí)驗(yàn)室近期研究發(fā)現(xiàn)牛支原體生物被膜與浮游細(xì)胞共有的免疫原性蛋白，如endoglucanase、thiol peroxidase、MilA，有可能作為潛在疫苗靶標(biāo)預(yù)防牛支原體急性感染和生物被膜感染[29]。最近發(fā)現(xiàn)，針對(duì)膜蛋白P81和UgpB的多抗能夠抑制牛支原體的生長(zhǎng)，提示膜蛋白P81和UgpB可作為潛在疫苗候選抗原[30]。到目前為止，一些免疫原性蛋白被鑒定并進(jìn)行了牛體驗(yàn)證，可引起強(qiáng)烈的以抗體為介導(dǎo)的體液免疫，但都不具有免疫保護(hù)作用。細(xì)胞免疫在牛支原體免疫中發(fā)揮著重要作用，Th17細(xì)胞免疫不具有免疫保護(hù)作用。因此，鑒定有效新抗原或抗原組合，平衡Th1/Th2細(xì)胞免疫，對(duì)于牛支原體病亞單位疫苗研發(fā)非常重要。

3 豬肺炎支原體

目前，已鑒定了一些豬肺炎支原體免疫蛋白，如P36、P42、P46、P95、P97、P102、P116、Nrdf等，可作為疫苗候選抗原。劉茂軍等[31]原核表達(dá)了豬肺炎支原體P65基因，發(fā)現(xiàn)P65重組蛋白具有良好的免疫原性。Galli等[32]發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體p42和p95能夠在BALB/c小鼠誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，對(duì)豬肺炎支原體7個(gè)重組蛋白在小鼠的免疫反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，能誘導(dǎo)IgG1 和 IgG2a 抗體反應(yīng)。馬豐英等[33]重組表達(dá)了豬肺炎支原體的主要免疫蛋白p36、p46、p65和p97R1-Nrdf，重組蛋白組合制備亞單位疫苗，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)疫苗組(p36、p46、p65和p97R1-Nrdf)能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生很強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，血清中抗體水平高于常規(guī)疫苗，同時(shí)，也激活了細(xì)胞免疫，IFN-γ水平顯著高于常規(guī)疫苗組。對(duì)豬肺炎支原體的P1C、P116 N、P30評(píng)價(jià)，串聯(lián)嵌合這3個(gè)蛋白的MP559 能夠引起較高水平的體液免疫反應(yīng)[34]。巴西學(xué)者構(gòu)建了豬肺炎支原體rP97R1P46P95P42嵌合抗原亞單位疫苗，發(fā)現(xiàn)在小鼠試驗(yàn)中具有良好的免疫原性，可作為一種潛在的疫苗[35]。豬肺炎支原體表面黏附素P97蛋白的C端重復(fù)區(qū)域R1和R1R2，與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基融合形成嵌合蛋白rLTBR1和rLTBR1R2，與IMS 1113佐劑混合乳化后免疫小鼠，每個(gè)重組蛋白均能誘導(dǎo)抗R1特異性的體液抗體(IgG)、黏膜抗體(IgG和IgA)和IFN-γ的產(chǎn)生，嵌合蛋白rLTBR1R2在重組蛋白中引起最快的體液抗體應(yīng)答，有作為亞單位疫苗的前景[36]。很多豬肺炎支原體亞單位疫苗研究在小鼠中進(jìn)行免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)，并未進(jìn)行豬體試驗(yàn)。小鼠并不能代表豬體免疫反應(yīng)，一些在小鼠上具有潛力的亞單位疫苗需要進(jìn)行豬體試驗(yàn)驗(yàn)證。對(duì)P97/P102類似物亞單位疫苗豬體免疫發(fā)現(xiàn)，盡管可以誘導(dǎo)很強(qiáng)的體液免疫，保護(hù)纖毛免受損傷，肺組織病變卻加重，不具有免疫保護(hù)作用[37]。熱休克蛋白 P42重組蛋白在豬體能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，有作為亞單位疫苗候選蛋白的潛力[38]。目前，一些免疫蛋白或片段具有免疫原性，可作為亞單位疫苗的候選抗原，但免疫保護(hù)效果都不理想。鑒定新的有效疫苗候選蛋白或多抗原蛋白組合(或嵌合)是豬支原體肺炎亞單位疫苗研究的一個(gè)重要發(fā)展方向[39]。

4 雞毒支原體

雞毒支原體的一些疫苗候選免疫蛋白已被鑒定，如GroEL、EF-Tu、greA、PDHC、DnaK、P67 (pMGA)、P52[40]等；通過免疫蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)，EF-Tu、greA、PDHC、DnaK、GroEL等具有良好的免疫原性。對(duì)GroEL蛋白進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其具有ATPase活性，參與MG PrpC蛋白的重折疊。補(bǔ)體依賴殺菌試驗(yàn)表明，MG rGroEL的兔抗血清具有良好的殺菌效果，與滅活疫苗誘導(dǎo)的抗血清相似，提示MG GroEL是一種保護(hù)性抗原，可作為MG亞單位疫苗候選抗原[41]。MGC1和MGC2是MG重要的黏附因子，MGC1和MGC2重組蛋白混合油佐劑制成亞單位疫苗，不同濃度重組蛋白免疫家禽，ELISA結(jié)果顯示，兩種蛋白制劑均引起較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，且不同劑量反應(yīng)水平接近，證明MGC1和MGC2重組蛋白具有良好的免疫原性，能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，但卻不具有免疫保護(hù)作用[42]。

5 山羊支原體山羊肺炎亞種

隨著Mccp基因組解析[43-45]和免疫蛋白組學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，一些潛在的疫苗抗原被發(fā)現(xiàn)，如PDHC、HSP70、轉(zhuǎn)酮醇酶、延長(zhǎng)因子G、LDH、NAD家族蛋白、NADPH、Ef-Tu等[46-47]，有作為亞單位疫苗候選抗原的潛力。GlpO是Mccp的一個(gè)毒力因子，具有作為疫苗抗原和治療靶標(biāo)的潛力[48]。然而最新研究發(fā)現(xiàn)GlpO存在于包括Mccp和Mmm SC等在內(nèi)的所有絲狀支原體簇成員的細(xì)胞質(zhì)，GlpO并不是絲狀支原體簇理想的保護(hù)性應(yīng)答的候選抗原[49]。PDHA、PDHB、PDHC是Mccp主要的免疫原性蛋白，預(yù)測(cè)并篩選其相關(guān)的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，構(gòu)建多重抗原肽(MAP)，原核表達(dá)后免疫小鼠，結(jié)果顯示3種抗原均能和小鼠免疫血清發(fā)生很好的反應(yīng)，免疫血清具有體外代謝抑制作用；淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)顯示，當(dāng)用單個(gè)T細(xì)胞表位及Mccp超聲破碎抗原分別刺激免疫小鼠的淋巴細(xì)胞時(shí)均產(chǎn)生明顯的增殖現(xiàn)象，免疫小鼠的IFN-γ、TNF-α、IL-1和IL-10產(chǎn)量明顯升高，而IL-12產(chǎn)量明顯下降。研究表明，構(gòu)建的MAP能夠引起小鼠的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)[50]。

6 動(dòng)物支原體病亞單位疫苗研發(fā)的主要難題

動(dòng)物支原體病亞單位疫苗研發(fā)尚處于探索初期，國內(nèi)外尚未見商業(yè)化亞單位疫苗問世。以下是阻礙亞單位疫苗研發(fā)的3個(gè)主要難題：

1)抗原設(shè)計(jì)：支原體病亞單位疫苗研發(fā)，首先需要確定支原體的保護(hù)性抗原基因。支原體保護(hù)性免疫成分主要包括參與病原黏附與致病的成分。細(xì)胞免疫和黏膜免疫在支原體保護(hù)性免疫應(yīng)答中往往起重要作用。因此，在亞單位疫苗抗原選擇時(shí)應(yīng)充分考慮到細(xì)胞免疫與黏附免疫相關(guān)抗原和表位。一些保護(hù)性抗原中可能存在參與免疫逃避、免疫病理損傷、誘導(dǎo)免疫副反應(yīng)或自身免疫應(yīng)答的表位，因此在設(shè)計(jì)時(shí)需要對(duì)相應(yīng)表位進(jìn)行修飾或刪除；在抗原中添加靶向修飾序列，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔靶向轉(zhuǎn)運(yùn)的KDAEL基序，可增強(qiáng)抗原的免疫效果[51]。由于支原體無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，膜蛋白是其主要免疫原之一，膜抗原包括糖蛋白、脂蛋白、熱休克蛋白等，是支原體主要的免疫抗原[52]。

2)抗原的高效遞送系統(tǒng)：在基因工程亞單位疫苗的研制中，需要根據(jù)表達(dá)抗原的特點(diǎn)選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)；目前，基因工程亞單位疫苗的表達(dá)系統(tǒng)有原核生物、酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等；在選擇表達(dá)系統(tǒng)時(shí)需注意所表達(dá)抗原是否有糖基化等翻譯后修飾。由于原核表達(dá)系統(tǒng)缺乏相關(guān)的翻譯后修飾，會(huì)影響蛋白抗原的生物學(xué)活性和免疫原性。此外，需要根據(jù)重組蛋白的免疫原形式確定表達(dá)系統(tǒng)，如目的蛋白是單體形式還是多聚體形式。另外，在設(shè)計(jì)和構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，可以將佐劑與免疫原融合表達(dá)，提高細(xì)胞免疫和體液免疫[51]。

3)細(xì)胞免疫、黏膜免疫佐劑：重組蛋白抗原往往需要配以合適的佐劑以增強(qiáng)免疫原性。細(xì)胞免疫和黏附免疫在支原體保護(hù)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，細(xì)胞免疫和黏附免疫佐劑(如IMS 1113、LTB亞基)可增強(qiáng)豬肺炎支原體的免疫效果[36]。

7 展 望

運(yùn)用反向疫苗學(xué)的方法，在篩選鑒定絲狀支原體絲狀亞種、豬肺炎支原體等重要支原體保護(hù)性抗原方面取得進(jìn)展，MSC-0136、MSC-0957、MSC-0499、MSC-0431、MSC-0776等為絲狀支原體絲狀亞種保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)牛體產(chǎn)生保護(hù)性免疫，可用于預(yù)防牛傳染性胸膜肺炎[18]。P97、P42、NrdF等為豬肺炎支原體的保護(hù)性抗原[53]?，F(xiàn)有研究提示，單一支原體免疫蛋白往往難以誘導(dǎo)理想的免疫反應(yīng)和產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)，多組分抗原(組合或嵌合表達(dá))可克服這一缺陷，誘導(dǎo)較全面的免疫反應(yīng)，可能會(huì)產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)效果。理想的支原體亞單位疫苗應(yīng)該有效激活機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫，甚至黏膜免疫，抵御或清除病原的感染。以豬肺炎支原體為例，發(fā)現(xiàn)和鑒定更加有效的免疫保護(hù)抗原或抗原組合，根據(jù)抗原特點(diǎn)篩選高效的抗原遞送系統(tǒng)，如減毒鼠傷寒沙門菌[54]或腺病毒等[55]遞送系統(tǒng)，相應(yīng)抗原配合更有效的佐劑，如IMS 1113[36]、LTB 亞基[56]、氯化鋰[57]、介孔二氧化硅納米顆粒[58]等，增強(qiáng)疫苗免疫保護(hù)效果[59]。因此，深入研究支原體蛋白的免疫反應(yīng)，篩選保護(hù)性抗原、抗原表位，抗原設(shè)計(jì)，選擇高效的抗原遞送系統(tǒng)，配合合適的佐劑可提高支原體亞單位疫苗免疫保護(hù)效果，為新型疫苗研制提供科學(xué)依據(jù)。