老年自身免疫性肝病患者外周血CD4+ CD25+ 調(diào)節(jié)性T細胞表達及其與疾病活動性的關系

王慧 陳靈芝 許劍蘭 鄭成芳

(海南西部中心醫(yī)院感染科，海南 儋州 571700)

自身免疫性肝病(AILD)是機體過度免疫，免疫系統(tǒng)攻擊自身的肝組織所造成的一種肝臟的炎癥性疾病。其性別、年齡分布與紅斑狼瘡相似，且常伴有肝外癥狀，甚至可見“紅斑狼瘡”癥狀，包括自身免疫性肝炎(AIH)、原發(fā)性膽汁性肝管炎(PBC)和原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)〔1～3〕。肝組織內(nèi)T淋巴細胞浸潤是AILD的特征之一，因此T淋巴亞群可能與該病的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究表明CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)在控制自身免疫反應及維持免疫耐受方面起著關鍵作用〔4～6〕。動物實驗中也發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg異?？梢詫е伦陨砻庖咝约膊　?〕。但有關CD4+CD25+Treg在AILD中表達情況及與疾病活動性關系國內(nèi)研究較少。因此本研究采用流式細胞儀檢測AILD活動期、緩解期及體檢健康者患者外周血CD4+CD25+Treg比例，觀察CD4+CD25+Treg比例與疾病活動性的關系及CD4+CD25+Treg比例與肝功能、細胞因子之間關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年2月至2019年4月海南西部中心醫(yī)院感染科老年AILD患者129例，其中AIH 43例，PBC 42例，PSC 44例。AILD患者均符合AILD描述性診斷標準〔8〕。將入選病例根據(jù)疾病活動期不同分為疾病活動期(活動期組)70例，自身抗體陽性，肝功能異常；男31例，女39例；年齡60～77歲，平均年齡(65.26±6.81)歲。緩解期59例(緩解期組)，激素治療后患者血清轉氨酶和膽紅素水平正常且維持6個月以上者；男27例，女32例；年齡60～80歲，平均年齡(65.61±9.13)歲。另選取體檢健康者65例(健康對照組)，其中男31例，女34例；年齡61～80歲，平均年齡(66.38±9.74)歲。三組患者性別、年齡、類型比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準，患者知情并簽署知情同意書。

1.2血標本采集 抽取所有受試者清晨空腹外周靜脈血5 ml，置入真空采血管當中，以3 000 r/min 離心20 min后吸取上層血清待檢。

1.3流式細胞儀檢測 取各組血標本100 μl置于流式管中，加入全血標本 100 μl，健康對照組組樣本內(nèi)加藻紅蛋白(PE)/異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鼠抗人IgG-1 抗體各 20 μl，緩解期組和活動期組樣本加PE標記的鼠抗人CD4抗體，F(xiàn)ITC標記的鼠抗人 CD25 抗體各20 μl，渦旋振蕩器混勻，于室溫下避光反應15 min，加入溶血素1 ml，室溫避光20 min，加入磷酸鹽緩沖液(PBS) 2 ml，離心，棄上清，加入1%多聚甲醛 500 μl 重懸細胞，上機檢測CD4+CD25+Treg比例。上機前常規(guī)對流式細胞儀進行檢測，控制儀器各項指標在質(zhì)控允許值內(nèi)。上機檢測時首先按照前向散射(FSC)和側向角散射(SSC)光信號予淋巴細胞群設門，每份檢測標本獲取設門內(nèi)10 000個細胞，檢測后所得數(shù)據(jù)以Listmode文件形式保存。

1.4相關指標檢測 運用全自動生化分析儀檢測肝功能指標總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ谷氨轉肽酶(γ-GT)。

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清細胞因子白細胞介素(IL)-2、干擾素(IFN)-γ、IL-4、IL-10、轉化生長因子(TGF)-β1。試劑盒均購自武漢明德生物科技股份有限公司。檢測過程嚴格按照試劑說明書進行。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、方差分析、Pearson相關分析；繪制受試者工作特征(ROC)曲線。

2 結 果

2.1三組外周血CD4+CD25+Treg檢測結果比較 活動期組、緩解期組、健康對照組CD4+CD25+Treg比例分別為(1.61±0.51)%、(3.53±0.63)%、(3.62±0.71)%，與健康對照組相比，活動期組外周血CD4+CD25+Treg比例顯著降低(P<0.05)，而緩解期組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.2三組肝功能指標檢測結果比較 與健康對照組相比，緩解期組肝功能指標差異不顯著(P>0.05)，活動期組肝功能指標均顯著升高(P<0.05)；與緩解期組相比，活動期組肝功能指標均顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.3三組血清細胞因子比較 活動期組血清中IL-4、IL-10水平較健康對照組及緩解期組顯著降低(P<0.05)，而血清中IL-2、IFN-γ、TGF-β1則顯著升高(P<0.05)；緩解期組上述指標與健康對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

圖1 CD4+ CD25+ Treg檢測結果

表1 三組肝功能指標比較

表2 三組血清細胞因子比較

2.4相關性分析 CD4+CD25+Treg比例與肝功能指標TBIL、ALT、AST、ALP呈負相關(r=-0.612、-0.597、-0.519、-0.635；P<0.05)，與DBIL、γ-GT無明顯相關性(r=0.113、0.254；P>0.05)；與細胞因子水平IL-2、INF-γ、TGF-β1呈負相關(r=-0.561、-0.579、-0.581；P<0.05)，與IL-4、IL-10呈正相關(r=0.712、0.653；P<0.05)。

2.5ROC曲線分析 以AILD疾病活動性為二分類結局，繪制CD4+CD25+Treg的ROC曲線，CD4+CD25+Treg曲線下面積為0.809，截斷值為2.12%，敏感度為73.1%，特異性為82.8%。見圖2。

圖2 CD4+ CD25+ Treg ROC曲線

3 討 論

正常情況下，人體對自身組織蛋白具有明顯耐受性，一旦失去這種耐受性，體內(nèi)淋巴系統(tǒng)不識別而攻擊組織蛋白，從而產(chǎn)生抗體，后者攻擊自身的靶組織細胞，使這類組織細胞受損而引起病理改變,出現(xiàn)功能障礙〔9～11〕。AIH主要表現(xiàn)為肝臟炎癥，PBC與PSC主要是膽道受損〔12〕。AILD的危害在于它的發(fā)生發(fā)展多較隱蔽，等到有明顯癥狀時往往就到了中晚期〔13〕。及時有效治療可以延緩這種疾病的進程，因此，發(fā)現(xiàn)得越早越好。病因尚未明了，一般認為免疫系統(tǒng)針對自身抗原的靶向錯亂是機體自身免疫性疾病的主要原因，肝組織內(nèi)T淋巴細胞浸潤是AILD的特征之一〔14〕，因此T淋巴亞群可能與該病的發(fā)生發(fā)展密切相關。許多研究表明CD4+CD25+Treg在控制自身免疫反應及維持免疫耐受方面起著關鍵作用〔15〕。

Andaloussi等〔16〕將CD4+CD25+Treg缺陷的小鼠的T細胞轉移到裸鼠中會導致多種自身免疫性疾病，而預先輸入CD4+CD25+Treg可預防這類疾病的發(fā)生；將正常小鼠脾臟的CD4+T細胞去除CD25+細胞后轉移給同基因型T細胞缺陷小鼠將導致各種器官特異性自身免疫性疾病和系統(tǒng)性消耗疾病，而注射CD4+CD25+細胞群可以抑制這些自身免疫疾病的發(fā)生，從而最早證明了該群細胞具備免疫調(diào)節(jié)能力。徐安琪等〔17〕在研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血本研究中CD4+CD25+Treg中，CD4+CD25+Treg在活動期AILD活動期顯著降低。系統(tǒng)性紅斑狼瘡亦屬于自身免疫性疾病，對本研究存在一定借鑒意義。本研究結果表明CD4+CD25+Treg與疾病活動性密切相關，而體檢健康者與疾病緩解期相比，差異無統(tǒng)計學意義，可能因為緩解期患者自身免疫功能趨于正常水平。Treg被認為是一種獨立的CD4+T細胞亞群，主要功能是抑制其他T細胞的活化，以調(diào)節(jié)自身反應性T細胞為主，維持自身免疫耐受性，阻止針對自身抗原的炎癥反應，限制自身免疫病的發(fā)展〔18〕。Treg 細胞可分泌細胞因子IL-10和 TGF-β1，其中IL-10具有明顯的抑制效應T細胞的功能，可直接抑制IL-2的產(chǎn)生，從而抑制自身免疫性疾病的炎癥反應，TGF-β1可促進CD4+CD25-Treg向CD4+CD25+Treg轉化〔19〕。CD4+CD25+Treg細胞亦可分泌Th2型細胞因子IL-4，抑制自身免疫性反應〔20〕。Th1細胞主要分泌IFN-γ和IL-2，IL-4、IL-10 的分泌代表了Th2 細胞亞群的活化水平，Th1/Th2 比例失調(diào)，出現(xiàn)“Th1優(yōu)勢”反應是造成系統(tǒng)性自身免疫性疾病發(fā)病的原因之一〔18〕。本研究觀察到活動期患者血清IL-4、IL-10 低于緩解期患者與體檢健康者，其中IL-10降低較為顯著，而IL-2、IFN-γ、TGF-β1水平則相反，因此出現(xiàn)“Th1 優(yōu)勢”。Pearson相關性分析顯示，CD4+CD25+Treg比例與肝功能指標TBIL、ALT、AST、ALP、γ-GT呈負相關，與細胞因子水平IL-2、IFN-γ呈負相關，與IL-4、IL-10、TGF-β1呈正相關，其原因可能為CD4+CD25+Treg比例下降，IL-10和IL-4分泌量減少，不能維持免疫耐受，導致免疫系統(tǒng)攻擊自身的肝組織細胞，使肝組織細胞受損，出現(xiàn)肝功能障礙。

綜上所述，CD4+CD25+Treg與AILD疾病活動性密切相關，與肝功能指標、細胞因子密切相關，可能是導致疾病發(fā)生和病情發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)之一。免疫系統(tǒng)除CD4+CD25+Treg外，還有CD8+Treg以及效應T細胞，多亞群在AILD疾病活動性中作用有待進一步研究。