李建設 何文龍 孟珂 付云
(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 1神經重癥監(jiān)護病房,河南 新鄉(xiāng) 453000;2全科醫(yī)學科)
星形膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)膠質細胞的重要組成部分,其表面分布許多神經遞質、神經營養(yǎng)因子受體、神經肽、激素及Na+、K+和Ca2+通道等,與神經元相互作用,在免疫調節(jié)、信號轉導和維持神經系統(tǒng)內外環(huán)境穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用,與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、阿爾茨海默病和癲癇等多種中樞神經系統(tǒng)性疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關〔1~3〕。當中樞神經細胞受損時,星形膠質細胞被激活,伴隨標志物膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和細胞因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6等分泌增多,對神經元起到保護或毒性作用。因此,探討星形膠質細胞的活化機制對認識和改善中樞神經系統(tǒng)性疾病具有重要意義。姜黃素是從姜黃屬植物姜黃、郁金和莪術等多年生的草本植物中提取的酚性色素,具有抗氧化、抗炎、抗病毒、降血脂和抗腫瘤等多種藥理活性〔4,5〕;NF-κB信號通路是與細胞炎癥密切相關的轉導通路,促炎細胞因子、脂多糖 (LPS)、生長因子及抗原受體等均可激活核因子(NF)-κB,參與細胞免疫、炎癥、應激反應、細胞發(fā)育和淋巴器官形成等生理過程〔6〕。已有報道證實〔7〕,姜黃素可通過抑制TNF-α誘導的大鼠星形膠質細胞單核細胞趨化蛋白(MCP)-1表達和釋放減輕神經病理性痛,對神經系統(tǒng)損傷起到保護作用,但其對星形膠質細胞炎癥反應的影響并不清楚。LPS是革蘭陰性桿菌胞壁外膜層的重要組分,可誘導炎癥因子的釋放造成炎癥損傷〔8~10〕。本研究構建LPS誘導大鼠星形膠質細胞損傷后的炎癥反應模型,觀察姜黃素對細胞中NF-κB炎癥因子信號通路的影響,以期為預防和改善中樞神經系統(tǒng)性疾病提供新的線索和依據。
1.1實驗動物與主要試劑 出生1~2 d的清潔級SD大鼠購于福建醫(yī)科大學實驗動物中心。DMEM/F12培養(yǎng)基購于美國Gibco公司,胎牛血清購于杭州四季青公司,D-Hanks液、Triton、4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、姜黃素、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、蛋白裂解液、LPS、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)抗體和GFAP抗體購于美國Sigma公司,p-p65、p65和GAPDH抗體購于英國Signal cell公司,一氧化氮(NO)檢測試劑盒、ECL化學發(fā)光劑和二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物技術研究所,辣根過氧化酶標記的二抗購于北京中杉公司,Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司,熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)購于美國Promega公司,酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于武漢博士德公司。
1.2大腦皮層星形膠質細胞的培養(yǎng)與鑒定 采用濃度為75%乙醇對SD大鼠進行消毒。在超凈臺上取大腦皮層組織。置于含D-Hanks培養(yǎng)液中,剔除腦膜和血管組織。在培養(yǎng)皿中,將組織剪碎(約1 mm3小塊),研磨后,加入0.25%胰蛋白酶消化10~20 min。待細胞分散后,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化,以200目篩網過濾,并以1 000 r/min離心10 min。加入培養(yǎng)基調整濃度約為6×105個/ml。取適量細胞懸液接種至含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)。待培養(yǎng)9~12 d后,加入胰蛋白酶消化,顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。待細胞突觸皺縮后,加培養(yǎng)基終止消化。吹打后離心棄上清。加入培養(yǎng)液行差速黏附處理30 min后,以每毫升5×105個細胞接種至培養(yǎng)瓶中。收集第4代細胞,以每孔5×104個細胞接種至96孔板上,常規(guī)培養(yǎng)2 d后,以4%多聚甲醛常溫固定30 min。經0.2%Triton破膜后,加入1∶1 000倍稀釋的GFAP抗體4℃下孵育24 h。再加入1∶100倍稀釋的二抗37℃下孵育1 h。最后,加入DAPI(濃度1 μg/ml)37℃下復染10 min。采用熒光顯微鏡觀察并拍照。
1.3MTT檢測細胞活性 收集長勢良好的大鼠星形膠質細胞,調整細胞濃度為2×105個/ml,以每孔100 μl接種至96孔板上。設置不做藥物處理的對照組和不含細胞的空白組。以濃度為100 ng/ml LPS單獨處理或聯(lián)合5、10、20、40、80 μmol/L姜黃素共同作用24 h后,加入5 mg/ml MTT溶液10 μl反應4 h。以DMSO溶解(體積150 μl)藍紫色晶體后,上酶標儀檢測各孔細胞在490 nm處的光密度(A)值。細胞活力(%)=(加藥孔A值-空白孔A值)/(對照孔A值-空白孔A值)×100%。
1.4硝酸還原酶法檢測NO含量 將大鼠星形膠質細胞以每孔3×104個接種至12孔細胞板上,常規(guī)培養(yǎng)24 h后,濃度為100 ng/ml LPS單獨處理或聯(lián)合5、10、20 μmol/L姜黃素共同作用24 h。收集上清液。參照NO檢測試劑盒說明書步驟進行檢測。其中以100 ng/ml LPS單獨處理下NO含量作為1,采用分光光度計在波長為550 nm比色,觀察各組細胞NO相對含量。
1.5Western印跡檢測iNOS、p-p65和p65蛋白表達 參照總蛋白提取試劑盒說明書步驟提取待測細胞的總蛋白,并以BCA法對總蛋白定量。將總蛋白上樣至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行電泳分離后,轉膜。取聚偏氟乙烯(PVDF)膜浸入含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h。加入1∶500倍稀釋的iNOS、p-p65、p65和GAPDH抗體于4℃下孵育24 h。經封閉液洗滌后,加入1∶5 000倍細胞的二抗于37℃下孵育1 h。暗室內加入ECL化學發(fā)光劑顯影后,凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。
1.6ELISA法檢測TNF-α、IL-1β和IL-6含量 收集 LPS單獨(100 ng/ml)處理或聯(lián)合姜黃素(5、10、20 μmol/L)共同作用24 h后的星形膠質細胞,嚴格參照ELISA檢測試劑盒說明書步驟檢測各組細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。
1.7熒光素酶報告基因實驗檢測NF-κB活性 將構建的NF-κB報告基因質粒參照轉染試Lipofectamine 2000使用說明書步驟轉染至星型膠質細胞中,分別以不做藥物處理的細胞作為LPS(-)+ Cur(-)對照組,以100 ng/ml LPS作用6 h的細胞作為LPS(+)+Cur(-)組,以5、10、20 μmol/L姜黃素預處理1 h后,再給予100 ng/ml LPS作用6 h的細胞作為LPS(+)+Cur(+)組。加入細胞裂解液提取總蛋白后,取適量總蛋白加入檢測試劑后,上機檢測,將LPS(+)+Cur(-)組細胞熒光素酶活性作為1,計算各組細胞的熒光素酶活性。
1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗及t檢驗。
2.1大腦皮層星形膠質細胞的鑒定結果 首次接種的星形膠質細胞在2~3 d完全貼壁,折光性較好,部分細胞開始鋪展,甚至長出細長的胞突,可見胞體成多角形,個別細胞核呈圓形或卵圓形,有些胞體向四周發(fā)出幾個放射狀突起。10 d左右可長滿,主要以星形膠質細胞為主,還含有少量的少突膠質細胞和極少量的成纖維細胞。傳代后細胞保持原狀態(tài),但生長更活躍,培養(yǎng)4 d左右細胞可鋪滿瓶底。顯微鏡下細胞胞質較豐富,突起增多,胞核常偏于一側,多為橢圓形。培養(yǎng)的星形膠質細胞在未長滿至前,細胞形態(tài)似成纖維細胞樣,形態(tài)不一,扁平狀,細胞長滿后匯合形成均一的鋪路石樣外觀。星形膠質細胞傳代到第4代時應用GFAP抗體免疫熒光鑒定培養(yǎng)的細胞,陽性細胞染成綠色,細胞核呈藍色,陽性率達到95%以上,證實絕大多數(shù)細胞為星形膠質細胞。見圖1。
圖1 星形膠質細胞的鑒定結果(×400)
2.2姜黃素和LPS對大鼠星形膠質細胞活性的影響 與對照(無任何藥物作用)組(97.78%±2.78%)相比,100 ng/ml LPS單獨作用(96.70%±3.24%)與姜黃素5、10、20 μmol/L共同作用后星形膠質細胞的活力(96.34%±2.53%、95.78%±3.08%、95.57%±3.16%)無顯著變化(P>0.05),而姜黃素40、80 μmol/L 與LPS共同作用后細胞活力(65.25%±1.99%、22.02%±1.11%)較對照組顯著降低(P<0.05)。實驗結果表明,姜黃素濃度低于40 μmol/L時,對于星形膠質細胞活力無顯著影響。故后續(xù)實驗研究采用5、10、20 μmol/L濃度的姜黃素對細胞進行干預。
2.3姜黃素對LPS誘導NO 生成和iNOS表達的抑制作用 給予100 ng/ml LPS單獨作用24 h后,星形膠質細胞中NO含量和iNOS蛋白表達(0.99±0.07、0.93±0.07)較對照組(0.32±0.03、0.09±0.01)明顯升高(P<0.05);給予5、10、20 μmol/L濃度的姜黃素處理后,細胞中NO含量和iNOS蛋白表達(0.74±0.04、0.72±0.05,0.55±0.03、0.53±0.04,0.41±0.02、0.26±0.02)較100 ng/ml LPS單獨處理組明顯降低(P<0.05),且呈濃度依賴性。見圖2。
圖2 Western印跡檢測iNOS蛋白表達
2.4姜黃素對LPS誘導的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的抑制作用 與對照組相比,給予100 ng/ml LPS單獨作用后,星形膠質細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均明顯升高(P<0.05);與100 ng/ml LPS單獨處理組相比,給予5、10、20 μmol/L濃度的姜黃素處理后,TNF-α、IF-1β、IF-6含量均呈濃度依賴性明顯降低(P<0.05)。見表1。
表1 姜黃素對LPS誘導的TNF-α、IL-1β和IL-6的影響
2.5姜黃素對LPS誘導的NF-κB信號通路活化的抑制作用 給予100 ng/ml LPS單獨作用后,星形膠質細胞中p-p65/p65比值和NF-κB活性(0.95±0.09、0.98±0.07)較對照組(0.08±0.01、0.05±0.01)明顯升高(P<0.05);而給予5、10、20 μmol/L濃度的姜黃素處理后,細胞中p-p65/p65比值(0.72±0.07、0.37±0.03、0.16±0.01)和NF-κB活性(0.75±0.05、0.53±0.04、0.23±0.02)明顯依次降低,與100 ng/ml LPS組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。
圖3 Western印跡檢測p-p65和p65蛋白表達
在炎癥環(huán)境下,星形膠質細胞在中樞神經系統(tǒng)中發(fā)揮免疫細胞的作用,可通過產生和釋放TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎反應調節(jié)因子促進炎癥反應,加重神經細胞損傷;另外,激活的星形膠質細胞可大量表達iNOS,產生大量的NO,對神經元起到毒性作用〔11~13〕。因此,探討星形膠質細胞的活化及炎癥機制,減輕其炎癥反應對認識和治療中樞神經系統(tǒng)性疾病具有重要意義。姜黃素是一種天然的酚性色素,具有抗炎、抗氧化、抗病毒和抗腫瘤等藥理作用,且毒性小和不良反應小,可通過調控多種基因或信號通路的表達發(fā)揮抗炎作用。Nakatake等〔14〕發(fā)現(xiàn),姜黃素可通過抑制肝細胞NF-κB活化影響炎癥介質iNOS、IL-6、TNF-α的表達,被認為具有治療器官損傷的潛力。Zhang等〔15〕指出,姜黃素可通過抑制外傷性脊髓損傷誘導的炎癥介質TNF-α、IL-1β、IL-6的產生,抑制TAK1和NF-κB通路活化,減輕脊髓損傷。本研究結果提示,姜黃素可通過抑制炎癥反應參與神經系統(tǒng)損傷的保護機制。
NF-κB是細胞內重要的轉錄因子,參與細胞的免疫、炎癥、應激反應、細胞發(fā)育和淋巴器官形成等生理過程;p65是其5個亞單位(Rel、RelB、p52、p50和p65)之一;正常情況下,p65可與抑制蛋白IκB結合形成復合物,以無活性形式存在于胞質中;但當受到細胞外信號如LPS刺激時,IκB蛋白降解,p65被磷酸化(p-p65),NF-κB激活,p-p65/p65比值可間接反映NF-κB通路激活程度〔16〕。研究〔17~19〕已證實,被LPS誘導活化的NF-κB可通過促進炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6表達,同時還可啟動iNOS轉錄,促進iNOS表達,產生NO??梢?,活化的NF-κB可通過調控炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的產生促進炎癥進展。Tsubaki等〔20〕和Cao等〔21〕證實,抑制或阻斷NF-κB活化可下調細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α和NO表達,減弱炎癥,改善組織損傷。曹念等〔22〕研究指出,姜黃素可通過抑制NF-κB信號通路介導的炎癥反應,發(fā)揮改善慢性阻塞性肺疾病肺病理損傷的作用。為了進一步探討姜黃素保護神經系統(tǒng)損傷的分子機制,本文通過熒光素酶報告基因實驗檢測,結果提示姜黃素可通過抑制NF-κB介導的炎癥反應發(fā)揮保護神經系統(tǒng)損傷的作用。