骨碎補(bǔ)總黃酮對骨代謝的影響及作用機(jī)制

張朝棟，曹芹芹，徐婷婷，林露茜，岳 珂，鄭晶晶，黃淑成

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

骨碎補(bǔ)又稱毛姜、崖姜，為水龍骨目骨碎補(bǔ)科骨碎補(bǔ)屬附生蕨類植物根莖。其性溫而補(bǔ)，具有壯骨益腎、化瘀消痛功效［1］。 骨碎補(bǔ)含有主要活性成分——骨碎補(bǔ)總黃酮，該物質(zhì)具有促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收、促進(jìn)骨骼血管生成、抑制炎癥反應(yīng)等作用［2］。 近年來，骨碎補(bǔ)總黃酮在治療骨缺損及骨折愈合、膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松和牽張成骨方面取得一定進(jìn)展， 但對骨骼疾病潛在作用以及分子調(diào)控機(jī)制還存在很多未知因素，仍需深入研究。筆者就骨碎補(bǔ)總黃酮對骨代謝的影響及其作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 骨碎補(bǔ)總黃酮對骨組織及血管的影響

骨組織形態(tài)計量學(xué)是一種骨組織定量研究方法，主要通過對顯微鏡下骨組織二維平面的測量，根據(jù)體視學(xué)原理，推測或轉(zhuǎn)換獲得三維參數(shù)，包括靜態(tài)參數(shù)和動態(tài)參數(shù)［3］。 骨體積分?jǐn)?shù)是骨組織體積與組織體積的比值， 是檢測骨量變化狀況的重要指標(biāo)。骨小梁厚度指骨小梁的平均厚度，其變化可影響骨量，在一定條件下，骨小梁的厚度越大，代表其骨量越多，抵御外力、受到損害后恢復(fù)的能力越強(qiáng)［4］。 骨小梁間距指骨小梁之間的平均距離。骨碎補(bǔ)總黃酮可增加骨體積分?jǐn)?shù)， 提高骨小梁厚度，減少骨小梁間距，改善骨三維結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)骨密度，改善骨礦化。 另外，還可通過抑制脛骨干骺端組織蛋白酶K （cathepsin K）mRNA 表達(dá)量抑制破骨細(xì)胞的骨吸收， 從而提高脛骨干最大彎曲載荷增加骨骼強(qiáng)度。

骨是一種高度血管化的組織， 依靠血管系統(tǒng)的血液和營養(yǎng)供應(yīng)維持骨骼的正常生長、 維護(hù)和重塑。骨組織中的血管系統(tǒng)除了是輸送氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、新陳代謝的管道系統(tǒng)，還為骨祖細(xì)胞的自我更新提供微環(huán)境以及為骨髓內(nèi)的造血干細(xì)胞提供細(xì)胞來源和滋養(yǎng)環(huán)境［5］。 一些細(xì)胞因子相互協(xié)調(diào)、相互作用是骨骼形成和穩(wěn)定的重要依靠。 血管分泌因子和血管生成因子相互聯(lián)系、相互作用，共同協(xié)調(diào)骨微環(huán)境的細(xì)胞間聯(lián)系， 以及血管生成與成骨的耦合［6］。 血清內(nèi)皮素（ET）對血管起收縮作用，血管內(nèi)皮舒張因子（NO）可使血管舒張，微血管循環(huán)是否穩(wěn)定取決于二者動態(tài)平衡，若平衡打破，微血管循環(huán)受損，從而影響骨代謝。骨碎補(bǔ)總黃酮具有維持ET/NO 平衡的能力，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖［7］。 骨碎補(bǔ)總黃酮可促進(jìn)血管生長因子VEGF 表達(dá)，從而促進(jìn)局部血管生成，進(jìn)而影響骨形成［8-9］。 由此可知，骨碎補(bǔ)總黃酮可通過促進(jìn)骨組織局部血管生成改善骨質(zhì)強(qiáng)度。

2 骨碎補(bǔ)總黃酮對骨細(xì)胞的影響

2.1 骨碎補(bǔ)總黃酮對成骨細(xì)胞的影響

成骨細(xì)胞是骨基質(zhì)的合成、 分泌與礦化過程中重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。 成骨細(xì)胞在其細(xì)胞增殖期數(shù)量增加，成骨細(xì)胞相互堆疊，構(gòu)成一個多層結(jié)構(gòu)，合成并分泌成骨相關(guān)蛋白，最終礦化成骨［10］。骨碎補(bǔ)總黃酮可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、成熟與分化，提高處于S 期的細(xì)胞比例， 以及抑制細(xì)胞發(fā)生早期凋亡， 還可對成骨增殖及基質(zhì)成熟相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白6（BMP-6）、堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）、骨橋素（OPN）［11-12］。因此，骨碎補(bǔ)總黃酮可通過調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖分化以及相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)骨的形成。

2.2 骨碎補(bǔ)總黃酮對破骨細(xì)胞的影響

破骨細(xì)胞是由來自骨髓中高度分化的巨噬細(xì)胞形成的多核細(xì)胞， 通過復(fù)雜的分子生物機(jī)制介導(dǎo)骨吸收，破骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞三者相互作用，分泌多種細(xì)胞因子，調(diào)控某些細(xì)胞活性，從而影響骨吸收與骨形成［13］。有研究表明，骨碎補(bǔ)總黃酮可通過提高半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-3）及細(xì)胞色素C 的表達(dá)，抑制B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞增殖分化及其活性，從而實(shí)現(xiàn)對破骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控［14］。由此可見， 骨碎補(bǔ)總黃酮不僅具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化的作用， 還可通過調(diào)控破骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)起到抑制骨吸收的作用。

2.3 骨碎補(bǔ)總黃酮對軟骨細(xì)胞的影響

軟骨細(xì)胞是軟骨中存在的唯一細(xì)胞， 在軟骨代謝、細(xì)胞外基質(zhì)的合成與更新、維持基質(zhì)完整過程中，軟骨細(xì)胞發(fā)揮重要作用［15］。骨碎補(bǔ)總黃酮可以調(diào)控促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Bax 蛋白、 抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2 蛋白、 抑制凋亡執(zhí)行因子Caspase-3，從而抑制軟骨細(xì)胞凋亡； 骨碎補(bǔ)總黃酮可提高軟骨細(xì)胞活性，促進(jìn)其增殖分化從而影響骨代謝［16-17］。由此可見， 骨碎補(bǔ)總黃酮對軟骨細(xì)胞的調(diào)控與其對破骨細(xì)胞的調(diào)控相似， 都是對細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的調(diào)控。

3 骨碎補(bǔ)總黃酮影響骨代謝的分子作用機(jī)制

3.1 Wnt/β-catenin 信號通路

Wnt/β-catenin 信號通路是骨代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用的信號通路之一，是骨骼生長發(fā)育、調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)的重要信號通路［18］。 胞質(zhì)內(nèi)散亂蛋白（Dsh）、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF 家族、 分泌蛋白Wnt 家族、跨膜受體Frizzled 家族、 酪蛋白激酶1 與Axin 蛋白、糖原合成激酶-3β（GSK-3β）、激活蛋白C、β-連環(huán)蛋白（β-Catenin）是Wnt/β-catenin 信號通路重要成分。 分泌型配體蛋白Wnt 特異性結(jié)合膜表面受體蛋白Fzd， 活化胞內(nèi)蛋白Dsh 蛋白，Dsh 蛋白與受體相互作用與一些胞質(zhì)蛋白的相互作用使β-catenin 逐漸在胞漿內(nèi)累積，與胞核內(nèi)TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族聯(lián)系，從而激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，并發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)［19-20］。

Wnt/β-catenin 信號通路可通過調(diào)控成骨細(xì)胞增殖分化、礦化及凋亡影響骨代謝，從而促進(jìn)骨形成［21-22］。Wnt 蛋白可通過與Fzd、LRP5/6 結(jié)合，降低GSK-3β 蛋白活性，使β-catenin 處于穩(wěn)態(tài)，而βcatenin 可調(diào)控下游TCF/LEF 促進(jìn)骨細(xì)胞成熟分化。 Runx2 蛋白可調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）向成骨細(xì)胞的分化過程， 并對成骨細(xì)胞增殖成熟進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控軟骨內(nèi)和膜內(nèi)成骨進(jìn)程。該信號通路還可通過促進(jìn)β-catenin 的表達(dá)，激活下游基因Runx2 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)BMSC 分化為成骨細(xì)胞，從而促進(jìn)骨形成、修復(fù)骨缺損［23-24］。 有報道發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)總黃酮可通過調(diào)控BMP-2 的表達(dá)激活Wnt/β-catenin 信號通路使早期BMSC 增殖、分化、成熟，促進(jìn)骨形成［25］。 骨碎補(bǔ)總黃酮可增加Wnt/β-catenin 信號通路中TCF/LEF 轉(zhuǎn)錄因子、βcatenin、Runx2 及Osteriex 的表達(dá)， 抑制GSK-3β的表達(dá)使血清堿性磷酸酶（ALP）含量上升，進(jìn)而促進(jìn)骨形成［26］。 骨碎補(bǔ)總黃酮可通過增加骨膜蛋白的表達(dá)， 抑制硬化蛋白的表達(dá)， 激活Wnt/βcatenin 信號通路進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的成熟與分化［27］。 因此，骨碎補(bǔ)總黃酮可通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟分化， 進(jìn)而促進(jìn)骨形成。

3.2 OPG/RANKL/RANK 信號通路

OPG/RANKL/RANK 信號通路在破骨細(xì)胞成熟、骨建模以及骨重建中具有重要作用。破骨細(xì)胞核因子-κB（RANK）、核因子-κB 受體活化因子配體（RANKL）和骨保護(hù)素（OPG）是該信號通路主要成分。 RANKL 由成骨細(xì)胞分泌，可活化RANK，并由破骨細(xì)胞及其前體表達(dá)；RANKL 可調(diào)控破骨前細(xì)胞成熟分化， 并在之后破骨細(xì)胞的激活與維持中發(fā)揮作用；OPG 由成骨細(xì)胞和成骨基質(zhì)干細(xì)胞分泌， 可與RANKL 特異性結(jié)合， 從而達(dá)到與RANK 競 爭RANKL 的 目 的， 降 低RANKL 與RANK 的結(jié)合率， 從而降低因過度骨吸收造成的骨骼損傷［28-29］。OPG 與RANKL 的表達(dá)量是骨代謝中骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度的重要決定因素， 且RANKL/OPG 比例失衡可能導(dǎo)致過度的骨吸收。 成骨細(xì)胞可通過控制OPG 與RANKL 的表達(dá)量間接調(diào)控破骨細(xì)胞，以達(dá)到成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞耦聯(lián)的目的，破骨細(xì)胞可通過RANK 與RANKL 的特異性結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟分化［30］。 研究發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)總黃酮可以協(xié)同1α，25-二羥基維生素D3促進(jìn)成骨細(xì)胞、 破骨細(xì)胞以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中OPG的表達(dá)， 提高血清中OPG 的含量， 改變OPG/RANKL 的比例，抑制破骨細(xì)胞的增殖、成熟、分化與活力，同時抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能，從而對骨形成進(jìn)行調(diào)控［31-32］。 因此，骨碎補(bǔ)總黃酮可通過OPG/RANKL/RANK 信號通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化機(jī)制，抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成。

3.3 BMP-Smads 信號通路

研究發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)總黃酮不僅參與Wnt/βcatenin 信號通路的調(diào)節(jié)促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟分化，還可以通過調(diào)節(jié)BMP-Smads 信號通路發(fā)揮促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化的功能。 BMP-Smads 信號通路可通過促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化和礦化細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)影響骨代謝。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP），是TGF-β 家族中一種高度保守且具有高度相似結(jié)構(gòu)的功能蛋白。BMP 可通過促進(jìn)BMSC 分化為成骨細(xì)胞并產(chǎn)生骨與軟骨形成相關(guān)因子， 從而對骨骼的生長發(fā)育與再生修復(fù)發(fā)揮重要作用。 BMP 可通過激活Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮成骨作用，TGF-β 由Smads 蛋白家族傳導(dǎo)，TGF-β/激活素信號由Smad2 和Smad3 傳導(dǎo)，Smad1、Smad5、Smad8 和Smad9 調(diào) 節(jié)BMP 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，Smads 蛋白家族可將TGF-β 信號由細(xì)胞膜傳至細(xì)胞核，BMP 激活Smads 信號，隨后激活細(xì)胞核內(nèi)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子核心結(jié)合蛋白因子2（Runx2）及成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（Osterix）等靶基因的表達(dá)，隨后促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟分化［33-34］。骨碎補(bǔ)總黃酮通過調(diào)控血清中BMP-2 和骨髓微環(huán)境中Smad1、Smad5、Smad8 mRNA 的表達(dá)水平，提高BMP-2 的分泌水平， 激活BMP-Smads 信號通路相關(guān)成骨基因Runx2 和Osterix 表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對骨形成的調(diào)控。其主要作用體現(xiàn)在兩方面，一方面可促進(jìn)BMSC 向成骨細(xì)胞分化； 另一方面也可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟，對骨骼生長發(fā)育、再生修復(fù)、提高骨密度發(fā)揮重要作用［35-37］。 另外，柚皮苷作為骨碎補(bǔ)總黃酮的主要成分， 也可通過Akt的磷酸化和AP-1 的組件c-fos 和c-jun 的激活促進(jìn)BMP-2 的表達(dá)，從而發(fā)揮成骨作用［38］。 由此可見， 骨碎補(bǔ)總黃酮及其主要成分柚皮苷均有調(diào)節(jié)BMP-Smads 信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化相關(guān)基因表達(dá)的作用。

3.4 MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號通路

MAPK 信號通路是促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化與礦化的主要通路，它是一種保守的三級激酶模式，該信號通路由MAPK 激酶激酶（MKKK）、MAPK激酶（MKK）和MAPK 構(gòu)成，三種激酶可依次激活，進(jìn)而對成骨細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。 MAPK 信號通路又可分為細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶 （ERK） 信號通路、p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38）信號通路、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）信號通路。ERK 信號通路可調(diào)控ALP 的表達(dá)，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的增殖分化與礦化及其細(xì)胞功能。與此同時，該信號通路通過促進(jìn)BMSC 分化為成骨細(xì)胞，在維持骨骼結(jié)構(gòu)的穩(wěn)態(tài)方面也發(fā)揮著重要作用。 p38 信號通路與JNK 信號通路對成骨細(xì)胞的增殖分化與礦化的調(diào)控主要通過BMP 蛋白與氧化應(yīng)激活化完成，而且p38 信號通路可促進(jìn)ALP 的表達(dá)，JNK 信號通路在成骨細(xì)胞分化后期發(fā)揮作用［39-40］。 有研究表明， 骨碎補(bǔ)總黃酮可作用于成骨細(xì)胞的ERK受體，成為激活ERK 信號通路的第一信號，促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP 的表達(dá)，進(jìn)而對成骨細(xì)胞增殖分化與礦化進(jìn)行調(diào)控［41］。 骨碎補(bǔ)總黃酮可調(diào)控成肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程， 提高核結(jié)合因子a1和ALP mRNA 的表達(dá)，而核結(jié)合因子a1 和ALP 是p38 信號通路的主要參與因子，所以，骨碎補(bǔ)總黃酮可通過p38 信號通路對骨代謝進(jìn)行調(diào)控［42］。JNK 磷酸化水平升高， 可抑制成骨細(xì)胞增殖分化，骨碎補(bǔ)總黃酮可抑制JNK 的磷酸化，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化，減少其凋亡［43］。 因此，骨碎補(bǔ)總黃酮可通過MAPK 信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，發(fā)揮成骨作用。

3.5 CTSK 信號通路

CTSK 信號通路是一種通過促進(jìn)骨膠原纖維的降解促進(jìn)骨吸收的信號通路。 溶酶體半胱氨酸組織蛋白酶K（CTSK）是破骨細(xì)胞主要的蛋白酶，CTSK 參與破骨細(xì)胞分化的全過程，主要作用在于對骨有機(jī)基質(zhì)的降解以及調(diào)控破骨細(xì)胞的凋亡。CTSK 對Ⅰ型膠原等骨有機(jī)基質(zhì)的降解是通過其在成熟的破骨細(xì)胞中以酶原形式合成并裂解活化發(fā)揮的作用。 因此，通過抑制CTSK 信號通路，可減少骨有機(jī)質(zhì)的降解，抑制骨吸收，而且對骨形成無明顯影響。 骨碎補(bǔ)總黃酮通過該信號通路影響骨代謝的機(jī)制與類雌激素相同， 通過減少血清中CSTK 的含量，抑制脛骨干骺端CTSK mRNA 的表達(dá)， 從而抑制破骨細(xì)胞的生成及其對骨有機(jī)基質(zhì)的降解作用［44-45］。 結(jié)果表明，骨碎補(bǔ)總黃酮可通過CTSK 信號通路對破骨細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，抑制破骨細(xì)胞對骨有機(jī)基質(zhì)的降解。

3.6 Notch 信號通路

Notch 信號通路是一條高度保守的重要信號通路，Notch 調(diào)節(jié)分子、Notch 受體、Notch 配體及CSLDNA 結(jié)合蛋白是該信號通路的主要成分。 其在機(jī)體的分化與成熟中發(fā)揮重要作用。 該通路Notch 配體與Notch 受體特異性結(jié)合后，Notch 信號通路激活，進(jìn)而激活其下游靶基因Hes-1 的轉(zhuǎn)錄。 Notch 對骨形成與骨吸收過程不是單一的促進(jìn)或抑制作用， 而是多種調(diào)節(jié)因子參與的雙向調(diào)節(jié)。 在骨骼發(fā)育過程中，Notch 信號通路可以通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化與成熟參與軟骨的形成［46］。有研究表明，骨碎補(bǔ)總黃酮可以通過下調(diào)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中受體Notch-1及下游靶基因Hes-1 mRNA 的表達(dá)， 進(jìn)而抑制Notch 信號通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，改善成骨質(zhì) 量［47］。

3.7 谷氨酸信號通路

在骨組織中， 谷氨酸信號通路的組成與中樞神經(jīng)系統(tǒng)類似，由谷氨酸（Glu）、相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體、轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡、受體、鈣信號、環(huán)磷酸腺苷（AMP）信號的級聯(lián)和Glu 代謝相關(guān)酶組成。 谷氨酸信號通路不僅參與成骨細(xì)胞的成熟分化， 還能對成骨祖細(xì)胞的分化進(jìn)行調(diào)控。Glu 離子型受體的激活主要與鈣信號有關(guān)，并由此觸發(fā)各種鈣—依賴酶的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致各種細(xì)胞的生理變化， 離子型谷氨酸受體可通過激活Cbfa-1 促進(jìn)成骨祖細(xì)胞分化， 促進(jìn)骨形成， 也可通過激活核因子-κB 對破骨細(xì)胞的成熟分化與凋亡進(jìn)行調(diào)控， 促進(jìn)骨吸收。 有研究表明， 骨碎補(bǔ)總黃酮可顯著提升代謝性谷氨酸受體mGluR5 的表達(dá)，也可降低血清中谷氨酸脫羧酶水平，減少股骨GABA 和GABABR1 的表達(dá)，從而加速骨形成［48-50］。 因此，骨碎補(bǔ)總黃酮可以通過提升谷氨酸信號通路中谷氨酸受體的表達(dá)對骨組織進(jìn)行調(diào)控，從而促進(jìn)骨骼強(qiáng)健。

4 結(jié)語

綜上所述， 骨碎補(bǔ)總黃酮作為中藥骨碎補(bǔ)中提取的主要活性成分， 通過大量的試驗證實(shí)骨碎補(bǔ)總黃酮不僅可以提高骨密度， 增強(qiáng)骨骼機(jī)械強(qiáng)度，降低疼痛，還可通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)骨骼局部血管形成，也可通過促進(jìn)成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞增殖，破骨細(xì)胞凋亡，從而對骨骼的形成發(fā)揮作用。骨碎補(bǔ)總黃酮可通過Wnt/β-catenin 信號 通 路、OPG/RANKL/RANK 信 號 通 路、BMPSmads 信號通路、MAPK 信號通路、CTSK 信號通路、Notch 信號通路和谷氨酸信號通路促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收。 但是，骨碎補(bǔ)總黃酮作為治療骨骼疾病的熱門藥物， 在對骨骼疾病潛在作用以及分子調(diào)控機(jī)制方面，仍需要研究。