外泌體的形成、功能及應(yīng)用研究進(jìn)展

梁春艷，邢海洲

（1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，河南 鄭州 450000）

外泌體是細(xì)胞分泌的具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的納米級(jí)囊泡狀物質(zhì)，直徑30～200 nm，內(nèi)含豐富的蛋白質(zhì)、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）、脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)，廣泛分布于血液、尿液、腦脊液、唾液、乳汁、膽汁等各種體液中，通過作用于靶細(xì)胞在細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和信息傳遞中發(fā)揮重要作用［1］。人體幾乎所有細(xì)胞可產(chǎn)生外泌體，外泌體通過不同方式作用于多種細(xì)胞，不僅維持正常的生理過程，而且在疾病發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。因此，外泌體成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)、熱點(diǎn)以及難點(diǎn)，關(guān)于外泌體的研究目前主要集中在外泌體的分離方法、內(nèi)含生物活性物質(zhì)的功能及其在疾病進(jìn)展和治療中的作用等方面。本文將主要從外泌體的組成成分、形成及調(diào)控機(jī)制、純化鑒定方法、與靶細(xì)胞的作用機(jī)制、主要功能及應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述，以提高對(duì)外泌體的認(rèn)識(shí)。

1 外泌體的組成成分

外泌體作為細(xì)胞來源的囊泡狀物質(zhì)，同親代細(xì)胞一樣含有豐富的核苷酸、脂類物質(zhì)以及蛋白質(zhì)。外泌體內(nèi)含物處于動(dòng)態(tài)變化中，不僅與細(xì)胞來源有關(guān)，還與細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)。外泌體中的核苷酸包括微RNA（microRNA，miRNA）、干擾小 RNA（small interfering RNA，siRNA）、信使RNA（message RNA，mRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，LncRNAs）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA）、核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）、小核仁RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）以及DNA［2］。脂質(zhì)小分子物質(zhì)包括膽固醇、鞘磷脂、二磷酸甘油酸、磷脂酰絲氨酸、糖脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、神經(jīng)酰胺等［3］。外泌體中的蛋白質(zhì)有2種：一種具有普遍性，另一種具有細(xì)胞特異性。普遍存在的蛋白質(zhì)包括［2］：與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)，如黏附分子（整合素、選擇素）、膜聯(lián)蛋白、四跨膜蛋白家族（CD9、CD63、CD81、CD82）、蛋白激酶和異源三聚體G蛋白；與細(xì)胞骨架有關(guān)的蛋白質(zhì)，如肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、埃茲蛋白、微管蛋白、微絲結(jié)合蛋等；與膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合有關(guān)的蛋白質(zhì)，如凋亡相關(guān)基因-2受體蛋白X（apoptosis-linked gene-2-interacting protein X，Alix）、網(wǎng)格蛋白、腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）、囊泡分選蛋白（vacuolar protein sorting，Vps）、肝細(xì)胞生長因子調(diào)控的酪氨酸激酶底物（hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate，Hrs）、Ras結(jié)合蛋白（Ras binding protein，Rab）；分子伴侶熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）和代謝有關(guān)酶，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷脂酶D2、過氧化物酶和丙酮酸鹽激酶。具有細(xì)胞特異性的蛋白與外泌體的細(xì)胞來源有關(guān)［4］，如樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）來源的外泌體含有主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類分子、MHCⅡ類分子與共刺激分子CD80、CD86等，T細(xì)胞來源的外泌體攜帶特異性的CD3+分子、T細(xì)胞表面受體（T cell receptor，TCR），CD8+T細(xì)胞來源的外泌體中富含穿孔素和顆粒酶等，B細(xì)胞來源的外泌體攜帶特異性B細(xì)胞表面受體（B cell receptor，BCR），血小板來源的外泌體含有凝血因子、血友病因子和整合蛋白CD41a，神經(jīng)元來源的外泌體含有谷氨酸受體，腸上皮細(xì)胞來源的外泌體含有各種代謝酶，腫瘤來源的外泌體中通常含有腫瘤抗原、Fas及轉(zhuǎn)化生長因子β-（transforming growth factor-β，TGF-β）等［5］。

2 外泌體的形成及調(diào)控機(jī)制

目前認(rèn)為外泌體的產(chǎn)生涉及2種途徑：轉(zhuǎn)運(yùn)所需的內(nèi)體分選復(fù)合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）依賴途徑和ESCRT非依賴途徑，具體包括起始、內(nèi)吞、多泡體形成、分泌4個(gè)過 程［6］。ESCRT 由 ESCRT-0（Hrs）、ESCRT-Ⅰ（TSG101、Vps28、Vps37）、ESCRT-Ⅱ（Vps22、Vps36、Vps25）、ESCRT-Ⅲ（Alix、Vps2）4個(gè)復(fù)合物組成［7］。ESCRT-0、ESCRT-I和ESCRT-Ⅱ復(fù)合物可識(shí)別體內(nèi)泛素化蛋白，ESCRT-Ⅲ復(fù)合物可調(diào)控膜的出芽和囊泡的分離。ESCRT依賴性途徑具體機(jī)制：細(xì)胞膜內(nèi)陷形成早期內(nèi)體，經(jīng)酸化形成晚期內(nèi)體，晚期內(nèi)體進(jìn)一步形成多囊泡體（multivesicular endosomes，MVBs），MVBs的特征是存在腔內(nèi)小泡，MVBs的去向與其膽固醇的含量有關(guān)，膽固醇含量較高的MVBs與細(xì)胞質(zhì)膜融合，釋放到細(xì)胞外基質(zhì)而形成外泌體，膽固醇含量少的MVBs經(jīng)溶酶體途徑降解［6］。產(chǎn)生外泌體的ESCRT非依賴途徑主要涉及神經(jīng)酰胺［8］。神經(jīng)酰胺可以誘導(dǎo)腔內(nèi)小泡的形成，促進(jìn)富含蛋白質(zhì)、RNA和脂筏等生物分子進(jìn)入腔內(nèi)小泡，促進(jìn)腔內(nèi)小泡與細(xì)胞膜融合釋放外泌體［9］。

目前認(rèn)為外泌體的形成主要通過ESCRT依賴途徑，其調(diào)控機(jī)制包括：（1）微管蛋白、肌動(dòng)蛋白、可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE）、鳥苷三磷酸酶（guanosine triphosphatase，GTPase）等對(duì)MVBs轉(zhuǎn)運(yùn)以及融合的調(diào)控［6］。Rab蛋白屬于小分子GTPase，在囊泡運(yùn)輸過程中具有重要作用，如Rab11可以促進(jìn)外泌體的產(chǎn)生，Rab27a和Rab27b的功能缺失可導(dǎo)致外泌體分泌減少［10］。（2）物理、化學(xué)、生物因素的調(diào)控作用。如提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度可以促進(jìn)外泌體的分泌［11］。有研究發(fā)現(xiàn)，γ射線可激活TP53基因，與TP53野生型相比，TP53基因突變的腫瘤細(xì)胞可以分泌更多的外泌體［12］。此外，低氧情況下通過誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的產(chǎn)生促進(jìn)外泌體的分泌［13］。LOGOZZI等［14］研究發(fā)現(xiàn)，酸性（pH=6.5）環(huán)境下可顯著增加外泌體的釋放量。（3）蛋白質(zhì)對(duì)外泌體產(chǎn)生的調(diào)控［15］。如肝素酶不僅可促進(jìn)外泌體的分泌，也可改變外泌體的蛋白成分；鞘磷脂酶不僅參與囊泡的胞內(nèi)運(yùn)輸，還可提高神經(jīng)酰胺水平，促進(jìn)外泌體釋放。（4）ESCRT可以引導(dǎo)特定的分子進(jìn)入MVBs，從而保障外泌體的分泌。有研究發(fā)現(xiàn)，ESCRT的缺失不僅可造成外泌體蛋白成分的改變，還可減少外泌體的分泌［6］。

雖然外泌體含有與親代細(xì)胞類似的生物學(xué)成分，但外泌體中miRNA的含量較親代細(xì)胞高，說明miRNA進(jìn)入外泌體是一個(gè)精細(xì)的調(diào)控過程［16］。目前認(rèn)為其相關(guān)調(diào)控機(jī)制包括以下幾種：（1）中性鞘磷脂酶2（neural sphingomyelinase 2，nSMase2）依賴途徑。nSMase2是第1個(gè)被報(bào)道的與miRNA進(jìn)入外泌體有關(guān)的分子［17］。nSMase2通過影響神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生進(jìn)而調(diào)節(jié)外泌體的分泌，nSMase2的過表達(dá)可增加外泌體中miRNA含量，應(yīng)用nSMase2抑制劑后外泌體中miRNA含量明顯減低。（2）miRNA模體（miRNA motifs）和不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，hnRNPs）依賴途徑。hnRNPA2B1可通過識(shí)別miRNA的3′端GGAC序列促進(jìn)miRNA進(jìn)入外泌體［18］。（3）miRNA序列3′末端依賴途徑。KOPPERS-LALTC等［19］研究發(fā)現(xiàn)，3′末端尿苷化的內(nèi)源性miRNA主要存在于尿液來源的外泌體，3′末端腺苷化的內(nèi)源性miRNA主要存在于B細(xì)胞，miRNA的3′末端可能通過分選機(jī)制促進(jìn)不同的miRNA進(jìn)入外泌體。（4）miRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（miRNA induced silencing complex，miRISC）相關(guān)途徑［20-21］。miRISC是成熟的miRNA與蛋白相互作用形成的復(fù)合物，包含miRNA、miRNA作用的RNA以及蛋白。GIBBINGS等［20］研究發(fā)現(xiàn)，外泌體形成過程中的MVBs含有大量miRISC中的GW182和阿爾古蛋白（argonaute 2，AGO2），GW182和AGO2可調(diào)節(jié)miRNA進(jìn)入外泌體的過程。但目前關(guān)于miRNA進(jìn)入外泌體具體的機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。

3 外泌體與靶細(xì)胞的作用機(jī)制

外泌體釋放后廣泛分布于血液、唾液、尿液、乳汁及腦脊液中，甚至分布于腫瘤患者的腹水、胸水中。外泌體不僅可以與臨近細(xì)胞相結(jié)合，還可以進(jìn)入遠(yuǎn)處細(xì)胞［22］。外泌體成為目前研究熱點(diǎn)的原因之一就在于外泌體可以進(jìn)入靶細(xì)胞，將蛋白質(zhì)、RNA等生物活性物質(zhì)傳遞至靶細(xì)胞，影響靶細(xì)胞的基因表達(dá)以及蛋白合成等過程，最終對(duì)靶細(xì)胞生物學(xué)活性產(chǎn)生影響，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的狀態(tài)及功能。研究外泌體對(duì)靶細(xì)胞的作用，首先應(yīng)明確外泌體如何與靶細(xì)胞相互作用，目前認(rèn)為外泌體與靶細(xì)胞的相互作用機(jī)制有以下幾種［23-24］：（1）外泌體表面蛋白直接與靶細(xì)胞受體結(jié)合，刺激靶細(xì)胞中信號(hào)通路；（2）外泌體與靶細(xì)胞膜融合，將功能性蛋白、miRNA等生物分子傳遞至靶細(xì)胞，外泌體mRNA可以在靶細(xì)胞中翻譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì)，miRNA、siRNA通過影響靶基因的表達(dá)而調(diào)控靶細(xì)胞；（3）靶細(xì)胞通過胞吞作用吞噬外泌體，而外泌體可在靶細(xì)胞內(nèi)重新被釋放或經(jīng)溶酶體途徑降解。

4 外泌體的分離純化及鑒定技術(shù)

外泌體的分離純化方法較多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，目前尚沒有哪種方法既可以保證外泌體的含量，又可以保證其純度及生物活性。目前，外泌體的分離純化方法包括離心法、超濾法、沉淀法、免疫法等［15，25］。離心法是最常用的方法，包括差速超速離心法和密度梯度離心法。差速超速離心法是最經(jīng)典也是使用最多的外泌體提取方法，具有成本低、獲得率高等優(yōu)勢(shì)，但是耗時(shí)、容易被污染，而且超高速離心可能破壞外泌體結(jié)構(gòu)。密度梯度離心法與差速超速離心法相比，其獲得的外泌體純度較高，但同樣具有耗時(shí)、會(huì)破壞外泌體結(jié)構(gòu)等缺點(diǎn)。超濾法也是公認(rèn)的外泌體提取方法，具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，但在超濾過程中可能損失大量外泌體。商用外泌體分離純化試劑盒因操作簡(jiǎn)單、節(jié)省時(shí)間而受到越來越多的關(guān)注，大多商用試劑盒使用聚合物共沉淀方法富集外泌體，但商用試劑盒分離出的外泌體純度較低。免疫親和法利用包被單克隆抗體的磁珠結(jié)合外泌體，可用于外泌體某一亞群的提取，特異性較高，但成本高、產(chǎn)出少，且不適用于大量樣本。此外還有色譜法、尺寸排除色譜法、場(chǎng)流分餾、微流體過濾法、無接觸分選等方法也可以用于外泌體的分離純化。

外泌體分離純化后主要從3個(gè)方面進(jìn)行鑒定［25-26］：（1）外泌體形態(tài)。多采用掃描電鏡或是透射電鏡進(jìn)行外泌體形態(tài)鑒定。外泌體直徑30～200 nm，呈“茶杯樣”。（2）外泌體大小及濃度。多采用納米粒子跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）檢測(cè)外泌體大小及濃度。（3）外泌體標(biāo)志蛋白。多采用Western blot法檢測(cè)標(biāo)志性蛋白，如外泌體表面蛋白（四次跨膜蛋白家族CD9、CD63及CD81），外泌體內(nèi)含蛋白（HSP90及HSP70等），外泌體合成相關(guān)蛋白Alix及Tsg101等。

5 外泌體的功能

外泌體的功能不僅與其細(xì)胞來源密切相關(guān)，還與其所含蛋白質(zhì)、RNA種類有關(guān)，不同來源的外泌體在不同的生理、病理階段具有不同的功能。

5.1 清除作用最初認(rèn)為外泌體是細(xì)胞排除廢棄物的一種方式。JOHNSTONE等［27］首先在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)外泌體的存在，認(rèn)為網(wǎng)織紅細(xì)胞通過這種機(jī)制清除細(xì)胞內(nèi)不需要的蛋白質(zhì)及其他生物學(xué)分子。

5.2 維持正常生理過程外泌體可以調(diào)控靶細(xì)胞生理活動(dòng)，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。另外，外泌體也可以維持機(jī)體免疫耐受，如活化的T細(xì)胞可招募DCs來源的外泌體，防止T細(xì)胞的過度活化［28］；DCs來源的外泌體可以誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化，參與機(jī)體免疫應(yīng)答［29-31］。在機(jī)體發(fā)育過程中，外泌體中的Wnt調(diào)節(jié)細(xì)胞分化。同時(shí)外泌體通過磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositide 3-kinases/protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）信號(hào)通路、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號(hào)通路、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/基質(zhì)金屬蛋白酶9（extracellular signal-regulated kinase/matrix metallopeptidase 9，ERK/MMP-9）信號(hào)通路等多種途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡［32-34］。

5.3 介導(dǎo)病理過程外泌體不僅可以維持正常生理過程，也參與病理過程，這也是外泌體成為研究熱點(diǎn)的主要原因之一。外泌體幾乎參與所有疾病過程，如感染性疾病、腫瘤、移植耐受、自身免疫性疾病、代謝性疾病等，其中外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用受到廣泛關(guān)注。腫瘤細(xì)胞可以分泌大量的外泌體，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)含有腫瘤抗原、miRNA、mRNA等多種生物活性物質(zhì)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［35-36］。一方面，外泌體內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA等通過決定腫瘤轉(zhuǎn)移方向、傳遞腫瘤轉(zhuǎn)移信號(hào)、促進(jìn)腫瘤遷移、誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、促進(jìn)新生血管形成、建立轉(zhuǎn)移前微環(huán)境和傳染轉(zhuǎn)移等機(jī)制促進(jìn)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移［37-38］。MAJI等［39］研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)膜聯(lián)蛋白（annexinⅡ）的外泌體可促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中血管生成以及乳腺癌轉(zhuǎn)移；HOSHINO等［40］研究發(fā)現(xiàn)，外泌體內(nèi)的整合素α6β4和α6β1于促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移，αvβ5可促進(jìn)肝轉(zhuǎn)移；ZOMER等［41］研究發(fā)現(xiàn)，侵襲性較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可以增加惡性程度較低腫瘤細(xì)胞的侵襲性；FONG等［42］研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體miR-122可以抑制非腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供微環(huán)境。另一方面，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可以通過上調(diào)半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）-3和caspase-9的表達(dá)，激活線粒體依賴的凋亡通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡［43］。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體不僅在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移過程中具有雙重性，在腫瘤免疫反應(yīng)中同樣具有兩面性：一方面，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體攜帶有腫瘤抗原，這些腫瘤抗原可被DCs攝取，引發(fā)CD8+T細(xì)胞依賴的抗腫瘤免疫效應(yīng)［44］；另一方面，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體在腫瘤逃逸中發(fā)揮重要作用。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可以抑制T細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，促進(jìn)T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）分化，抑制自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用以及DCs的分化和成熟，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及促進(jìn)髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）的產(chǎn)生［4］。STENQVIST等［45］研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體中自殺相關(guān)因子配體（factor-associated suicide ligand，F(xiàn)asL）可以與活化的免疫細(xì)胞表面的自殺相關(guān)因子（factor-associated suicide，F(xiàn)as）結(jié)合，抑制免疫細(xì)胞功能，促進(jìn)免疫細(xì)胞凋亡。LUNDHOLM等［46］研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌細(xì)胞來源的外泌體中自然殺傷細(xì)胞活化性受體（natural killer group 2 member D，NKG2D）的配體可以選擇性下調(diào)NK 細(xì)胞以及CD8+T細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá)，抑制NK細(xì)胞以及CD8+T細(xì)胞的殺傷作用，抑制腫瘤免疫功能。

6 外泌體的應(yīng)用

6.1 新型標(biāo)志物作用外泌體在腫瘤相關(guān)疾病的研究中，首先關(guān)注的是外泌體可以作為腫瘤診斷的新型標(biāo)志物［47］。腫瘤細(xì)胞可以分泌大量外泌體，其中蛋白質(zhì)、miRNA甚至DNA可以作為非侵入性診斷的腫瘤標(biāo)志物［48］。TAYLOR等［49］首次提出了腫瘤患者血清來源的外泌體中miRNA（miR-21、miR-141、miR-200等）可以作為卵巢癌診斷的腫瘤標(biāo)志物。YANG等［50］研究認(rèn)為，外泌體中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，Ep-CAM）、黏蛋白1（mucin 1，MUC1）、磷脂酰肌醇聚糖1（glypican，GPC1）、Wnt2等可以用于胰腺導(dǎo)管腺癌的診斷以及預(yù)后判斷。WANG 等［51］認(rèn)為，miR-125a-3p可以作為早期結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)志物。外泌體中的一些miRNA和蛋白質(zhì)作為卵巢癌、肺癌、肝癌、白血病等多種腫瘤的新型標(biāo)志物，不僅可以判斷腫瘤的大小、惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移、分期分級(jí)等，也可用于腫瘤療效及預(yù)后評(píng)估［48，52-55］

6.2 治療作用因?yàn)橥饷隗w在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中具有重要作用，所以其可以被用于腫瘤的治療［56］。通過抑制外泌體的產(chǎn)生或者體外濾過外泌體可以抑制腫瘤的進(jìn)展。BOBRIE等［57］研究表明，特異性敲低Rab27b后腫瘤細(xì)胞分泌外泌體明顯減少，且小鼠乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移得到抑制。外泌體中某些蛋白質(zhì)、RNA通過抑制機(jī)體抗腫瘤免疫來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，因此，特異性抑制這些生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生可以提高抗腫瘤免疫，抑制腫瘤進(jìn)展。RONG等［58］研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞外泌體中TGF-β通過抑制T細(xì)胞增殖，促進(jìn)免疫逃逸，而特異性抑制外泌體TGF-β表達(dá)后可增強(qiáng)T細(xì)胞活性，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。另外，外泌體中的特定miRNA可以促進(jìn)腫瘤耐藥，而抑制miRNA表達(dá)可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物的敏感性，促進(jìn)化學(xué)治療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。外泌體中miR-222的高表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞耐藥有關(guān)，特異性抑制miR-222后可以增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫西芬的敏感性［59］。外泌體還可以激活線粒體依賴的凋亡通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展［60］。因此，外泌體在腫瘤治療中發(fā)揮著重要的作用，具有良好的應(yīng)用前景。

6.3 載體作用外泌體作為細(xì)胞來源物質(zhì)，是天然的載體。其磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)、miRNA等生物學(xué)活性物質(zhì)具有良好的保護(hù)作用，因此，外泌體中的蛋白質(zhì)、RNA具有較高的穩(wěn)定性［61］。外泌體與親代細(xì)胞具有相似的生物學(xué)活性，在體內(nèi)廣泛分布并長期存在，具有半衰期長、天然無毒等優(yōu)勢(shì)［62］。外泌體的直徑較小，屬于納米級(jí)結(jié)構(gòu)，可以逃避吞噬細(xì)胞吞噬作用，同時(shí)自由穿梭于細(xì)胞與細(xì)胞以及細(xì)胞與基質(zhì)間，具有穿透能力強(qiáng)、低免疫原性等特性［63］。外泌體內(nèi)含mRNA、miRNA、非編碼RNA和蛋白質(zhì)，在基因治療中，能夠同時(shí)載入生物大分子、短肽和小分子藥物等［16］，具有較強(qiáng)的裝載能力。因此，外泌體可以通過裝載藥物、miRNA等應(yīng)用于腫瘤治療。另外，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體還可用于腫瘤疫苗的研發(fā)［64-65］。

7 外泌體在應(yīng)用中存在的問題

雖然外泌體具有良好的研究價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值，但是在外泌體的研究中仍然存在一些問題。目前研究應(yīng)用的腫瘤患者的血清外泌體包含正常細(xì)胞來源以及腫瘤細(xì)胞來源的外泌體，需要尋找一種方法把腫瘤細(xì)胞來源的外泌體與正常細(xì)胞來源的外泌體進(jìn)行分離。有學(xué)者應(yīng)用免疫親和捕獲的方法獲取CD34+來源于白血病細(xì)胞的外泌體［66］，但是正常細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞的影響下也可造成外泌體成分的改變，而這些改變的成分很可能是腫瘤標(biāo)志物，因此應(yīng)用免疫親和方法獲取的外泌體是可作為腫瘤標(biāo)志物來源這一問題仍未得到解決。另一個(gè)問題是冷凍、儲(chǔ)存的血液樣本是否可以代替新鮮采集的血液樣本，雖然核酸的研究不受冷凍的影響，但外泌體的完整性以及蛋白質(zhì)很可能受解凍的影響［65］。此外，雖然外泌體在體內(nèi)含量較高，樣本較易獲取，但其分離純化過程較復(fù)雜，不能保證所獲取的外泌體的純度以及含量。雖然體內(nèi)多種細(xì)胞可以分泌外泌體，但并不是所有外泌體都可以作為載體，因此需要尋求一種經(jīng)刺激后可以分泌大量可作為載體的外泌體的細(xì)胞系。腫瘤細(xì)胞可以分泌大量外泌體，但腫瘤細(xì)胞攜帶腫瘤相關(guān)抗原，其分泌的外泌體是否可以用于腫瘤的治療需要進(jìn)一步研究。目前，將藥物以及小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)入外泌體內(nèi)的方法主要包括共孵育、化學(xué)轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)染等方法，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，且不能保證轉(zhuǎn)染效率，需要尋求一種高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染方法。另外，是通過靜脈注射、瘤內(nèi)注射還是口服使外泌體進(jìn)入體內(nèi)目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，外泌體應(yīng)用次數(shù)以及用量也無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。這些問題的解決均需要在臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

8 結(jié)語

外泌體富含蛋白質(zhì)、核酸等生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞間交流中發(fā)揮著重要的作用，在腫瘤診斷、治療中具有重要的意義，是目前研究的熱點(diǎn)。但目前尚無一種技術(shù)在外泌體的分離純化中既可以保證數(shù)量也可以保證純度和生物學(xué)活性，因此，需要找尋一種新技術(shù)用于外泌體的分離純化。目前外泌體的鑒別主要從形態(tài)、大小、標(biāo)志物等方面進(jìn)行，需要探索一種具有高敏感性和高特異性的檢測(cè)技術(shù)對(duì)外泌體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)外泌體的鑒定也無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，仍需要探索外泌體鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”。外泌體形成的過程中，如何對(duì)進(jìn)入的物質(zhì)進(jìn)行篩選，以及影響外泌體分泌的因素有哪些，具體的機(jī)制是什么仍需要進(jìn)一步研究。外泌體如何作用于靶細(xì)胞，通過何種方式對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，具體的機(jī)制如何也需探索。外泌體可以介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，但其對(duì)腫瘤發(fā)生的促進(jìn)作用具體表現(xiàn)在哪些方面，如何介導(dǎo)抗腫瘤免疫的發(fā)生以及腫瘤的免疫逃逸等問題仍需進(jìn)一步研究；外泌體在腫瘤治療方面的研究仍處于實(shí)驗(yàn)階段，進(jìn)入臨床階段要克服的問題又有哪些，還需要認(rèn)真思考和研究?？傊?，外泌體是目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)熱點(diǎn)，但目前對(duì)其研究深度不夠，需要生物醫(yī)學(xué)工作者們投入更多的人力、物力進(jìn)行相關(guān)的研究。