LncRNA HOTAIR、VEGF在腎上腺惡性腫瘤組織中的表達(dá)及其預(yù)后相關(guān)性

杜學(xué)謙 孫青風(fēng) 田龍江

1滄州市人民醫(yī)院超聲科，061000；2滄州市人民醫(yī)院泌尿外科，061000

腎上腺腫瘤是泌尿外科常見的外科腫瘤，具有良性和惡性之分，惡性腎上腺腫瘤具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、包膜浸潤等特點(diǎn)，患者預(yù)后生存率較低，惡性腎上腺腫瘤5年生存率大約為44%。目前研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后等多層次都可對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，在許多腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后具有密切關(guān)系[1]。人類同源盒基因(homeobox，HOX)的反義RNA(HOX antisense intergenic RNA，HOTAIR)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的LncRNA，與HOXC基因簇共表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄后層次調(diào)控多種基因的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR在腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織中表達(dá)水平上調(diào)，與腫瘤的良惡性、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可以參與血管生成，與腫瘤轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)。關(guān)于HOTAIR和VEGF同時(shí)在腎上腺腫瘤組織中表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系研究較少，因此本研究檢測(cè)腎上腺惡性腫瘤組織HOTAIR、VEGF的表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為評(píng)估腎上腺腫瘤患者預(yù)后提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、臨床資料

選取2014年1月至2017年1月于滄州市人民醫(yī)院手術(shù)治療切除的腎上腺標(biāo)本167例，其中腎上腺惡性腫瘤101例(腎上腺惡性腫瘤組織)，良性腎上腺66例(良性腎上腺組織)。腎上腺惡性腫瘤組織患者，男58例(57.43%)，女43例(42.57%)；年齡范圍40～80歲，年齡(59.96±10.06)歲。良性腎上腺組織患者，男36例(54.55%)，女30例(45.45%)；年齡范圍40～80歲，年齡(60.11±10.16)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者術(shù)前未進(jìn)行化療、放療及激素治療；(2)患者臨床資料完整、能夠配合完成隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)并發(fā)其他惡性腫瘤患者；(2)合并自身免疫性疾病者；(3)肝、腎功能嚴(yán)重異常的患者。兩組研究對(duì)象在性別、年齡上比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(P>0.05)。本研究通過滄州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：L102013019)，患者均知情同意。

二、方法

1.評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 所有組織均經(jīng)2位有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生進(jìn)行病理診斷并根據(jù)Weiss評(píng)分[3]，Weiss評(píng)分≥3分診斷為腎上腺惡性腫瘤，Weiss評(píng)分<3分診斷為腎上腺良性腫瘤。

2.治療方法 腎上腺腫瘤患者行腹腔鏡手術(shù)治療。腎上腺惡性腫瘤患者手術(shù)切除腫瘤后一個(gè)月，行輔助治療或化療?；熕幬镞x用密妥坦，使用方法依據(jù)臨床常規(guī)使用療程。

3.主要試劑及儀器 TRIzol(貨號(hào)：15596-026)，武漢科昊佳生物科技有限公司；RNA SYBR Green PCR Kit(貨號(hào)：KL101-969)，上?？道噬锟萍加邢薰?；第一鏈cDNA耐熱反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：KL268)，上?？道噬锟萍加邢薰?；CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，德國Bio-Rad公司。

4.樣品采集 所有行手術(shù)治療切除的腎上腺良、惡性患者入院手術(shù)時(shí)均留有病理組織(3 cm×3 cm)，組織于液氮中速凍，之后凍存于-80 ℃冰箱中待測(cè)。

5.熒光定量PCR檢測(cè)組織中HOTAIR、VEGF mRNA的表達(dá) 使用TRIzol試劑提取腎上腺惡性腫瘤組織和良性腎上腺組織中總RNA，采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度，挑選RNAOD260/OD280約為1.8～2.0的樣品用于互補(bǔ)DNA反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(quantitative reverse transcriptase-mediated PCR，qRT-PCR)，依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟逆轉(zhuǎn)錄得到互補(bǔ)DNA，以管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參，采用CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)HOTAIR、VEGF mRNA及內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃，3 min；95℃，30 s；59℃，30 s；72℃，40 s；40個(gè)循環(huán)；72℃，3 min。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物設(shè)計(jì)見表1。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)所得數(shù)據(jù)Ct值進(jìn)行分析，采用2-ΔΔCt算法計(jì)算HOTAIR、VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

三、隨訪

所有腎上腺惡性腫瘤患者術(shù)后均接受隨訪，通過電話或復(fù)診的方式對(duì)所有患者均進(jìn)行3年隨訪，患者開始治療時(shí)即開始隨訪，統(tǒng)計(jì)隨訪期間死亡例數(shù)及對(duì)應(yīng)死亡時(shí)間(本研究中患者死亡皆與本病有關(guān))，本次隨訪截止日期2020年1月。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用例(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)。本研究數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，計(jì)量資料以Mean±SD表示，組間數(shù)據(jù)符合方差齊性，兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。Pearson法分析HOTAIR與VEGF的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier對(duì)腎上腺惡性腫瘤患者3年的生存情況進(jìn)行分析。用COX法分析影響腎上腺惡性腫瘤患者預(yù)后的因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、腎上腺惡性腫瘤組織和良性腎上腺組織HOTAIR、VEGF mRNA表達(dá)水平比較

與良性腎上腺組織相比，腎上腺惡性腫瘤組織HOTAIR、VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)水平較高(P<0.05)。(表2)

表2 腎上腺惡性腫瘤組織和良性腎上腺組織HOTAIR、VEGF mRNA表達(dá)水平比較

二、HOTAIR與VEGF相關(guān)性分析

Pearson分析顯示，HOTAIR與VEGF呈正相關(guān)(r=0.739，P<0.05)。(圖1)

圖1 HOTAIR與VEGF的散點(diǎn)圖

三、HOTAIR、VEGF mRNA表達(dá)水平與腎上腺惡性腫瘤患者臨床病理特征的關(guān)系

將HOTAIR平均值(4.96)作為分界線，腎上腺腫瘤患者高于4.96分為高表達(dá)組共56例，低于4.96為低表達(dá)組共45例，將VEGF mRNA平均值(3.54)作為分界線，腎上腺腫瘤患者高于3.54分為高表達(dá)組共59例，低于3.54為低表達(dá)組共42例。結(jié)果顯示HOTAIR、VEGF mRNA與癌細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤單發(fā)或多發(fā)無關(guān)(P>0.05)。(表3、4)

表3 HOTAIR表達(dá)水平與腎上腺腫瘤患者臨床病理特征的關(guān)系

表4 VEGF mRNA表達(dá)水平與腎上腺腫瘤患者臨床病理特征的關(guān)系

四、HOTAIR、VEGF mRNA表達(dá)水平與腎上腺惡性腫瘤患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier法顯示HOTAIR低表達(dá)腎上腺惡性腫瘤患者的生存時(shí)間為(32.09±0.92)個(gè)月，顯著長于HOTAIR高表達(dá)腎上腺惡性腫瘤患者(21.64±1.49)個(gè)月，Log Rank檢驗(yàn)，χ2=20.916，P<0.01(圖2)。VEGF mRNA低表達(dá)腎上腺惡性腫瘤患者的生存時(shí)間為(31.81±0.97)個(gè)月，顯著長于VEGF mRNA高表達(dá)腎上腺惡性腫瘤患者(22.37±1.47)個(gè)月，Log Rank檢驗(yàn)，χ2=14.849，P<0.01。(圖3)

圖2 HOTAIR表達(dá)水平與腎上腺惡性腫瘤患者預(yù)后的函數(shù)

圖3 VEGF mRNA表達(dá)水平與腎上腺惡性腫瘤患者預(yù)后的函數(shù)

五、影響腎上腺惡性腫瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

單因素分析表明，癌細(xì)胞有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、HOTAIR高表達(dá)、VEGF高表達(dá)均是影響腎上腺惡性腫瘤患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。多因素分析表明，癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、HOTAIR高表達(dá)、VEGF高表達(dá)是影響腎上腺惡性腫瘤患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.05)。(表5、6)

表5 腎上腺腫瘤患者臨床資料的變量賦值

討 論

LncRNA是一類長度超過200 nt的單鏈RNA，由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物。近年來發(fā)現(xiàn)LncRNA是在腫瘤中具有特異性表達(dá)，可參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等，從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。HOTAIR位于人體第12號(hào)染色體HOXC簇中HOXC11和HOXC12之間的基因間區(qū)域[6]。文獻(xiàn)報(bào)告HOTAIR可通過多種方式參與細(xì)胞基質(zhì)的調(diào)節(jié)，例如沉默基因表達(dá)、結(jié)合染色質(zhì)修飾酶等[7]。有文獻(xiàn)報(bào)告HOTAIR在上皮癌細(xì)胞中過表達(dá)可使哺乳動(dòng)物多梳蛋白抑制復(fù)合體2(PRC2)相關(guān)基因在細(xì)胞內(nèi)重新定位，促使細(xì)胞發(fā)揮胚胎纖維細(xì)胞的類似的功能，抑制H3組蛋白第27位賴氨酸(H3K27)發(fā)生甲基化，進(jìn)而提高腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力[8]。王慧霄等[9]文獻(xiàn)報(bào)告HOTAIR可聚集PRC2促使H3K27發(fā)生甲基化，另外HOTAIR 5′端可與PRC2結(jié)合，然后介導(dǎo)PRC2沉默相關(guān)抑癌基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致乳腺癌的復(fù)發(fā)及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。葉嶺等[10]研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR在宮頸癌組織中表達(dá)水平明顯高于正常宮頸上皮細(xì)胞，HOTAIR高表達(dá)可能對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長、遷移具有促進(jìn)作用。劉泓鍵等[11]研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR 在膀胱癌細(xì)胞表達(dá)水平呈上調(diào)，沉默HOTAIR表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，猜測(cè)HOTAIR可能通過調(diào)控Notch信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)腎上腺惡性腫瘤組織HOTAIR相對(duì)表達(dá)水平顯著高于良性腎上腺組織，臨床病理特征分析HOTAIR與腫瘤直徑、腫瘤良性或惡性、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示HOTAIR可能影響腎上腺惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道提示HOTAIR可能通過調(diào)控相關(guān)抑癌基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響腫瘤的增殖、遷移等[10-11]。

表6 影響腎上腺惡性腫瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

VEGF是血管生成的重要調(diào)控因子，能直接誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管腔形成。近年來有很多文獻(xiàn)報(bào)告VEGF與腫瘤的發(fā)生、癌細(xì)胞浸潤及轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，其作用機(jī)制是通過促進(jìn)腫瘤血管生成，增加血管壁的滲透性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[12-13]。蔣艷霞等[14]研究發(fā)現(xiàn)VEGF在腎細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平明顯高于正常腎組織，與腎細(xì)胞癌組織腫瘤大小、TNM分期、浸潤性生長和轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)。徐海波等[15]研究發(fā)現(xiàn)VEGF在膀胱癌組織表達(dá)水平明顯高于正常癌旁組織，與膀胱癌病理分期、病理分級(jí)、癌細(xì)胞生長、遷移密切相關(guān)。王亞奇等[16]研究發(fā)現(xiàn)VEGF在人腎上腺腫瘤組織中表達(dá)水平高于正常腎上腺組織，可能與腎上腺腫瘤微血管形成及腫瘤細(xì)胞生長有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)腎上腺惡性腫瘤組織VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著高于良性腎上腺組織，臨床病理特征分析VEGF與有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示VEGF可能參與腎上腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，猜測(cè)VEGF可能通過調(diào)控血管生成從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移等。Zhao等[17]在研究HOTAIR表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤侵襲性的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，HOTAIR表達(dá)水平與VEGF呈正相關(guān)。高建芝等[18]證實(shí)HOTAIR通過靶向VEGF/VEGFR信號(hào)通路，在肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR與VEGF具有正相關(guān)性，提示HOTAIR可能與VEGF共同發(fā)揮作用，調(diào)控腎上腺腫瘤發(fā)生及腫瘤患者不良預(yù)后。單因素分析顯示HOTAIR低表達(dá)腎上腺腫瘤患者生存時(shí)間顯著長于HOTAIR高表達(dá)腎上腺惡性腫瘤患者，VEGF mRNA低表達(dá)腎上腺惡性腫瘤患者生存時(shí)間顯著長于VEGF mRNA高表達(dá)患者，多因素分析表明，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、HOTAIR高表達(dá)、VEGF高表達(dá)是影響腎上腺惡性腫瘤患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示HOTAIR高表達(dá)、VEGF高表達(dá)患者可能預(yù)示腎上腺惡性腫瘤患者易發(fā)生不良預(yù)后。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR、VEGF與腎上腺惡性腫瘤的病情進(jìn)展及預(yù)后具有相關(guān)性，HOTAIR、VEGF的表達(dá)水平與腎上腺惡性腫瘤患者有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系，是否能成為腎上腺腫瘤治療的靶位點(diǎn)，還需進(jìn)一步深入研究HOTAIR、VEGF對(duì)腎上腺腫瘤的調(diào)控機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突