雙特異性磷酸酶在腎臟疾病中的研究進展

杜宇 章波 趙景宏

陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，重慶 400037

蛋白質(zhì)磷酸化是真核生物蛋白翻譯后修飾的重要手段之一，可調(diào)節(jié)蛋白活性，其廣泛地參與了機體內(nèi)各種生理活動及病理過程。通過特異性的蛋白激酶以及蛋白磷酸酶對蛋白質(zhì)磷酸化水平的動態(tài)調(diào)節(jié)，使機體內(nèi)環(huán)境趨于穩(wěn)定。在真核生物中，根據(jù)磷酸化作用位點的不同，蛋白磷酸酶可分為酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)以及絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶。既往的研究多集中于蛋白酪氨酸激酶，然而近些年，隨著對PTPs超家族及其成員的深入研究使得可逆磷酸化在細胞內(nèi)的嚴格調(diào)控有了進一步的認知，為一些疾病的發(fā)生發(fā)展及防治策略提供了新的思路。

一、雙特異性磷酸酶的分類及特性

DUSPs是PTPs超家族中的一員，因其具有使酪氨酸殘基和絲氨酸/蘇氨酸殘基脫磷酸的雙重作用而備受關注。近年來，人類的DUSPs被歸屬于PTPs擴展家族中cysteine-basedPTPs中的 Ⅰ 型 Ⅱ 亞型，即雙特異性VH1樣PTPs，其催化域包含有共同的HCxxGxxR位點，共由64個成員組成[1]。該亞型家族包括雙特異性MAPK磷酸酶(MKPs，11個)，非典型DUSPs(atypical DUSPs，20個)，絲切蛋白磷酸酶(Slingshots，3個)，肝再生磷酸酶(PRL，3個)，CDC14s(4個)，磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN-like phosphatases，8個)以及肌管素磷酸酶亞家族(MTMs，15個)[1]。MKPs以及大部分非典型DUSPs均表現(xiàn)出對磷酸化的酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸特定的磷酸酶活性，因此被視為狹義上的DUSPs家族成員。

DUSPs之所以歸屬于PTPs家族，是因其PTPs活性較絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性高40～500倍，且酶活性結構域具有同PTPs相似的結構特征[2]。但DUSPs催化結構域上催化位點的結構深度明顯淺于經(jīng)典PTPs，這使得DUSPs更易識別及接納包括酪氨酸、絲氨酸以及蘇氨酸在內(nèi)的多個氨基酸殘基所連接的磷酸基團[3]。

1.MAPK磷酸酶 MAPK是細胞信號通路的重要組成部分，MAPK的異常調(diào)控與多種疾病有關。MAPK家族由細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，c-JNK)以及p38在內(nèi)的經(jīng)典成員組成[4]。迄今為止，由于MAPK抑制劑在疾病治療中療效的不確定性或存在一定的不良反應，尚無相關藥物進入臨床Ⅲ期試驗[5-6]。而對MAPK抑制劑的研究表明，針對其上游信號分子為靶點的治療可能比下游更為有效[6-8]。MKPs可通過對MAPK激酶結構域中活化環(huán)T-X-Y位點上的蘇氨酸和/或酪氨酸去磷酸化，使MAPK失活從而拮抗細胞信號級聯(lián)反應[9]。MKPs的N端MAPK結合域(MAPK-binding domain，MKB)含有酶相互作用結構域(kinase-interaction motif，KIM)，可與MAPK相作用介導酶-底物的特異性結合，使有活性的MAPK去磷酸化失活，也可使無活性的MAPK失去對外界刺激的反應[10-11]。值得注意的是，典型DUSPs中的DUSP2(PAC1)、DUSP5和DUSP8同樣包含KIM卻并未命名為MKPs；另有非典型DUSP14(MKP6)和DUSP26(MKP8)雖無KIM，但仍可以使MAPK去磷酸化失活[12]。

根據(jù)功能結構域、序列同源性以及亞細胞定位的不同，MKPs又可分為以下三類：(1)定位于細胞核的DUSPs，包括DUSP1(MKP1)、DUSP2(PAC1)、DUSP4(MKP2)和DUSP5(HVH3)，可作用于ERK1/2、p38和JNK蛋白，使其去磷酸化而抑制MAPK所介導的細胞生物活動；(2)定位于細胞質(zhì)內(nèi)的DUSPs，包括DUSP6(MKP-3)、DUSP7和DUSP9(MKP4)，它們可以特異性的結合并去磷酸化MAPK家族中的ERK1/2蛋白；(3)可同時定位于細胞質(zhì)和細胞核的DUSPs，包括DUSP8(M3/6)、DUSP10(MKP5)、DUSP14(MKP6)和DUSP16(MKP7)，對JNK和p38具有更高的特異性[9，13-14]。MKPs對MAPK家族不同成員的特異性選擇可能與其所在的細胞類型或MKPs同MAPK相互結合部位的結構差異有關[9]。

2.非典型DUSPs 在20個非典型DUSPs的成員中包含有15個小型非典型DUSPs以及5個其他非典型DUSPs[1]。非典型DUSPs缺少類似MKPs N端所特有的MKB結構域，因此其去磷酸化作用的底物仍不確定。其中DUSP14(MKP6)和DUSP26(MKP8)尚可與MAPK家族成員相互作用并調(diào)節(jié)MAPK活性。然而，非典型DUSPs更多見于對其他磷酸化蛋白底物的調(diào)節(jié)，它們甚至可作用于RNA或脂類等非蛋白類底物，進而發(fā)揮去磷酸化作用。因此，非典型DUSPs具有更為廣泛的底物特異性，并且在生理功能上具有更多的可能性。

二、雙特異性磷酸酶與腎臟疾病

DUSPs在腎臟病領域中的研究相對較少，目前已有的研究多集中于糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)，亦有少量研究在其他常見腎臟疾病。

1.糖尿病腎病 DN是糖尿病的微血管并發(fā)癥。高糖、糖基化產(chǎn)物、腎內(nèi)血流動力學、細胞因子等多種因素均可導致DN中MAPK家族的活化。而MAPK信號通路的激活，尤其是p38和JNK信號途徑與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關，且相關研究已多有報道。例如對糖尿病動物模型以及2型糖尿病患者的腎臟組織學分析顯示腎小球中p38處于長期激活狀態(tài)[15-17]，在血壓正常的糖尿病大鼠體內(nèi)，抑制p38的活性可減少蛋白尿和纖維粘連蛋白的產(chǎn)生[18]。Gene 33/Mig-6選擇性激活JNK在糖尿病發(fā)病早期及持續(xù)進展中發(fā)揮重要作用[19]。在DN中，尚未完全了解導致MAPK激活的確切機制。然而，鑒于DUSPs是哺乳動物細胞中抑制MAPK的主要調(diào)節(jié)機制之一[20]，因此，近來一些研究致力于證實DUSPs家族參與了MAPK所介導的DN的發(fā)病機制。

大量證據(jù)表明，足細胞損傷在腎小球濾過屏障損傷以及DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[21-22]。亦有臨床研究報道，足細胞數(shù)量和密度的減少是DN持續(xù)進展強有力的預測指標之一[23]。近來有研究報道DUSP4和DUSP26參與了足細胞損傷致DN的發(fā)病機制。DUSP4(MKP2)是雙特異性MAPK磷酸酶，NLS1和NLS2是其定位于細胞核中的核定位序列[24]。DUSP4可因生長因子、細胞應激、紫外線和LPS等誘導產(chǎn)生，并使JNK、p38和ERK去磷酸化失活[25-29]。其中Benoit Denhez等[30]的研究證實了高糖培養(yǎng)的足細胞以及糖尿病小鼠和患者腎組織中DUSP4表達下降。在糖尿病小鼠中，DUSP4表達喪失導致p38和JNK的持續(xù)活化、氧化劑產(chǎn)生和細胞死亡，從而導致腎小球損傷、足細胞足突消失、功能障礙。對糖尿病患者腎皮質(zhì)中DUSP4的表達分析同樣證實，DUSP4 mRNA表達降低與患者eGFR下降相關[<60 mL·min-1·(1.73 m2)-1]。因此，阻止DN中DUSP4表達下降可能是延緩DN進展的新靶點[30]。DUSP26(MKP8)是分子量約24 kDa的非典型DUSPs，同樣具有使MAPK失活的作用。據(jù)報道，DUSP26可以抑制p38磷酸化，從而阻斷p38介導的腫瘤細胞的凋亡[31]。而抑制DUSP26的表達可以促進MAPKs(p38/JNK)的活化，從而加速脂肪肝的進展[32]。Huang等[33]的研究發(fā)現(xiàn)DN患者腎臟中DUSP26表達增加。采用DUSP26基因敲除小鼠(DUSP26-/-)進一步觀察到腎損傷、腎小球硬化，Nephrin表達降低以及腎小球基底膜增厚。此外，在DUSP26-/-小鼠中，通過促進轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表達，鏈脲佐菌素誘導的DN腎小球纖維化明顯加重；而減少活性氧的產(chǎn)生可消除DUSP26-/-小鼠中TGF-β1表達的增加和MAPKs的活化，從而保護足細胞免受高糖誘導的損傷[33]。以上研究表明，DUSPs通過選擇性抑制MAPK家族成員可能是參與介導足細胞損傷在DN發(fā)病機制中的重要途徑之一。

DUSP1(MKP1)是DUSPs家族首個被鑒定且研究最為廣泛的成員，可在多種組織細胞中表達并參與細胞死亡、癌癥、炎癥以及代謝性疾病等多種生物學事件。體內(nèi)、外研究表明，DUSP1以細胞類型依賴的方式可使JNK、p38和ERK脫磷酸化，與JNK和p38的結合較ERK具有更強的親和力[34]。在DN中腎臟固有細胞存在線粒體自噬功能異常以及能量代謝、生物合成、動力學紊亂，表明線粒體功能損傷亦與DN發(fā)病及進展有關[35-37]。近來有多個研究報道了MKP1與線粒體功能失調(diào)在糖尿病腎損害中的詳細作用。Zhang等[38]的研究表明在高糖應激下，MKP1缺乏可促進線粒體損傷和腎小球系膜細胞凋亡。在此過程中，線粒體片段化是傳遞和放大損傷信號以啟動腎小球系膜細胞死亡必不可少的元素。而過表達MKP1可通過抑制JNK-鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶Ⅱ-線粒體分裂蛋白1信號途徑(JNK-CaMKⅡ-Fis1 pathway)和穩(wěn)定線粒體功能逆轉上述現(xiàn)象[38]。同樣Sheng等[39]的研究重點介紹了DUSP1通過調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)來控制DN進展的新途徑，即高糖誘導的DUSP1下調(diào)可激活JNK途徑，開啟線粒體裂變因子介導的線粒體裂變，該線粒體動力學的不平衡進一步加重了腎損害。這些研究表明，DUSP1在線粒體功能損傷致DN發(fā)生發(fā)展的分子機制中具有重要意義，以DUSP1-JNK信號途徑為核心的調(diào)控作用參與了這一過程，這為DN的治療開辟了新的思路。

2.高血壓腎病 腎臟既是高血壓損害的重要靶器官之一，又是導致高血壓的重要組織器官。DUSP1除在DN中發(fā)揮作用外，Chen等[40]對高血壓腎病基因表達譜數(shù)據(jù)分析后同樣發(fā)現(xiàn)DUSP1表達下降，這在血管緊張素Ⅱ處理HK-2的細胞模型中也得到證實。DUSP5(hVH3)是一種核MKP，在哺乳動物細胞內(nèi)可由熱休克蛋白和生長因子所誘導，能同MAPK家族中的ERK特異性結合使其發(fā)生核轉位和失活[41]。DUSP5可被泛素化蛋白酶體降解，其降解會增強ERK信號傳導的幅度和持續(xù)時間[42]。相反，ERK可通過抑制DUSP5泛素化來維持DUSP5穩(wěn)定，該調(diào)節(jié)獨立于ERK激酶活性，但取決于ERK-DUSP5的相互作用[43]。目前尚未廣泛研究DUSP5對腎臟疾病可能帶來的影響。Zhang等[44]的研究證實DUSP5-/-大鼠引起PKCα和ERK1/2激活，進而增強腎入球小動脈和小葉間動脈的肌反應性。在醋酸去氧皮質(zhì)酮-鹽(DOCA-salt)高血壓大鼠模型中，敲除DUSP5可改善腎血流量對高血壓的自動調(diào)節(jié)能力，減少蛋白尿。DUSP5-/-大鼠還可降低腎臟中MCP-1的表達，減少巨噬細胞浸潤，并下調(diào)TGF-β1、MMP2和MMP9的表達，抑制上皮間充質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和腎纖維化。因此，抑制DUSP5可通過增強腎血管反應性和加強腎血流自動調(diào)節(jié)能力來預防高血壓腎損傷的發(fā)生[44]。值得一提的是，MKPs是多數(shù)腎臟疾病進程中負向調(diào)控的重要分子。而在Zhang等[44]的研究中，DUSP5基因敲除大鼠在高血壓腎病中顯示了一定的保護作用。這可能歸咎于不同的MKPs亞型選擇作用于MAPK家族不同成員，其在某一特定的疾病模型中所具有的作用表現(xiàn)。在血管平滑肌細胞中，ERK1/2和PKC磷酸化可通過激活瞬時受體電位、上調(diào)細胞內(nèi)鈣水平、活化鈣調(diào)蛋白結合蛋白等方式來加強血管反應性，改善腎血流量對高血壓的自動調(diào)節(jié)能力，從而減少炎性細胞因子和促纖維化介質(zhì)的產(chǎn)生[44]。因而Zhang等[44]的研究中DUSP5顯現(xiàn)了不同于多數(shù)MKPs亞型的效應表現(xiàn)，這與ERK蛋白在高血壓腎病中的功能不可分割。而更多的DUSPs家族成員在高血壓腎病發(fā)生發(fā)展中的作用機制還有待于進一步研究。

3.急性腎損傷 急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是多種病因引起的腎功急劇下降的危急重癥。其中腎缺血再灌注損傷是引起AKI的重要原因之一，然而迄今為止缺血再灌注損傷所涉及的病理生理機制尚未完全闡明。Chang等[45]利用DNA芯片技術分析了缺血再灌注損傷大鼠模型中腎臟的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注損傷組與MAPK途徑相關的DUSP1存在顯著上調(diào)，且通過定量聚合酶鏈反應進一步確認DUSP1 mRNA表達水平與其一致[45]。因此，對于新的DUSPs關鍵分子及其作用機制的進一步探索對AKI的預防及治療具有積極的意義。

4.慢性腎臟病 慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)發(fā)病率逐年遞增，腎小球硬化以及腎間質(zhì)纖維化是CKD進展至終末期腎病的共同病理表現(xiàn)，早期干預可明顯延緩CKD進程，降低并發(fā)癥發(fā)生率以及病死率。因此，對其預測因子及發(fā)病機制的深入研究具有重要的臨床價值。Li等[46]的研究發(fā)現(xiàn)在單側輸尿管結扎大鼠模型的腎小管上皮細胞以及TGF-β1誘導的NMT-52E細胞的EMT過程中MKP2(DUSP4)的表達上調(diào)。MKP2可抑制JNK信號傳導并部分逆轉TGF-β1所誘導的EMT；相反，抑制MKP2可促進上皮鈣黏素、α-平滑肌肌動蛋白表達以及纖維粘連蛋白的分泌，這一過程可被JNK抑制劑所拮抗[46]。以上這一研究是基于DUSP4所參與的腎小管上皮細胞間充質(zhì)轉分化致腎纖維化發(fā)生發(fā)展這一經(jīng)典機制展開。然而，細胞凋亡、炎癥反應、TGF-β1/Smad信號途徑等多種重要的腎臟纖維化病理過程中，又有哪些DUSPs家族成員參與其中亟待更多的研究探討。

三、小結

DUSPs作為一種酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸雙特異性磷酸酶而備受矚目。既往DUSPs研究多集中在炎癥及腫瘤領域，深入了解DUSPs家族中各成員在腎臟疾病中的作用及調(diào)控機制，將有助于為腎臟病的防治提供新思路。因此，DUSPs家族在腎臟領域將是一個值得重視及深入探索的新靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突