基于腺苷和脫氫表雄酮含量測定的山藥品質(zhì)評(píng)價(jià)方法*

李春英，袁 園，王志堯

(1.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004； 2.河南省科學(xué)院，河南 鄭州 450002)

山藥(Dioscoreae Rhizoma)來源于被子植物門單子葉植物綱百合目薯蕷科(Dioscoreaceae)植物薯蕷(DioscoreaoppositaThunb.)的干燥塊莖，是國家衛(wèi)生部公布的藥食兩用的中藥，是中醫(yī)臨床和居民日常食療保健常用的補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精的佳品[1]。2015版《中國藥典》一部中只收載了山藥的性狀、鑒別、檢查和浸出物等項(xiàng)目，缺少含量測定項(xiàng)指標(biāo)，不足以對(duì)山藥質(zhì)量進(jìn)行全面有效的控制。腺苷具有廣泛的生理活性，不僅能夠舒張血管、松弛血管平滑肌而發(fā)揮降壓作用，還在減慢心律、抑制血小板聚集等方面有一定的效果[2]。脫氫表雄酮(dehydro epi androsterone,DHEA)是人體腎上腺素的一種，國內(nèi)外研究已經(jīng)證實(shí)，DHEA不僅能夠改善葡萄糖耐量，提高胰島素水平[3]；還在預(yù)防和治療心血管疾病[4-7]、增強(qiáng)免疫力[8-9]、延緩衰老增齡[10-12]等方面有一定效果。因此，DHEA和腺苷是山藥中的重要活性成分。長期以來，對(duì)山藥品種的評(píng)價(jià)和改良工作進(jìn)展緩慢，目前仍然存在山藥種植品種雜亂的現(xiàn)象，缺乏綜合性優(yōu)良的品種。因此，本研究對(duì)種植鐵棍山藥、野生山藥、馴化野生山藥雌株、馴化野生山藥雄株、紫山藥中的腺苷、DHEA含量進(jìn)行測定，旨在為山藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考依據(jù)，也為山藥品種馴化和選育提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 藥品、試劑與儀器

種植鐵棍山藥、馴化野生山藥雌株、馴化野生山藥雄株等多批山藥，均來自河南省溫縣懷山堂山藥種植基地，野生山藥、紫山藥購自河南省禹州市藥材市場。脫氫表雄酮標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)H1408213；腺苷標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110879-200202；甲醇為色譜純；水為純化水；其他試劑均為分析純。LC-20AD型高效液相色譜儀，島津(日本)實(shí)驗(yàn)器材有限公司產(chǎn)品；ME204型電子天平，梅特勒托利多公司產(chǎn)品；KQ-E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備

精密稱取腺苷對(duì)照品6.61 mg，置于25 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)15 mL/L 的甲醇水溶解稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為264.40 mg /L的腺苷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液。精密稱取DHEA對(duì)照品7.62 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解后，稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為152.40 mg /L的DHEA標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液。

2.2 樣品的處理

2.2.1 腺苷樣品的處理

將各待測山藥樣品粉碎后，過3號(hào)篩，取約1.0 g，精密稱定后，置于50 mL具塞錐形瓶中；精密加入10 mL體積分?jǐn)?shù)15 mL/L 的甲醇水溶液，稱定質(zhì)量；超聲處理30 min，冷卻至室溫；稱量質(zhì)量，損失的質(zhì)量用體積分?jǐn)?shù)15 mL/L 的甲醇水溶液進(jìn)行補(bǔ)充；置于離心機(jī)，以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min；將上清液用0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行過濾；取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 DHEA樣品的處理

將待測山藥樣品粉末過3號(hào)篩，取約3.0 g，精密稱定后，置于50 mL具塞錐形瓶中；精密加入15 mL甲醇溶液，稱定其質(zhì)量；超聲處理1 h，冷卻至室溫；稱量質(zhì)量，損失的重量用甲醇進(jìn)行補(bǔ)充；再用0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行過濾；取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 高效液相色譜儀檢測條件

2.3.1 腺苷色譜條件

Aglient Extend XDB C18高效液體色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液(pH值6.5) -甲醇(94∶6，v/v)，流速1 mL/min，柱溫30 ℃， 檢測波長260 nm，進(jìn)樣量10 μL。高效液相色譜圖見圖1。

1.腺苷的峰圖1 腺苷對(duì)照品(a)及山藥樣品(b)色譜圖

2.3.2 DHEA色譜條件

色譜柱Welch Ultimate XB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(62∶38，v/v)，流速0.6 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長204 nm，進(jìn)樣量10 μL。高效液相色譜圖見圖2。

1.DHEA的峰圖2 DHEA對(duì)照品(c) 及山藥樣品(d)色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液0.5，1，3，5，8，10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，按2.3.1項(xiàng)下條件進(jìn)樣，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。以腺苷對(duì)應(yīng)的色譜峰峰面積值Y為縱坐標(biāo)，以所配標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液中的腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得到標(biāo)準(zhǔn)方程為：Y=34 197.2X+25 515.1，r=0.999 9。結(jié)果表明，腺苷在13.22～264.40 mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

精密吸取DHEA標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液1 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得15.24 mg/L的DHEA使用溶液。分別精密吸取DHEA使用溶液0.2，0.5，1，3，5，8，10 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，按2.3.2項(xiàng)下條件進(jìn)樣，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。以峰面積值Y為縱坐標(biāo)，DHEA質(zhì)量分?jǐn)?shù)X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得到標(biāo)準(zhǔn)方程為：Y=13 038.6X-1 836.3，r=0.999 9。結(jié)果表明，DHEA在0.31～15.24 mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品粉末，按照2.2項(xiàng)方法制成6份供試品溶液，按照2.3項(xiàng)下色譜條件分別測定腺苷和DHEA色譜峰的峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果：腺苷和DHEA含量的RSD分別為1.86%(n=6)和1.93%(n=6)。結(jié)果表明，本方法的重復(fù)性良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10 μL，按照2.3項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測定腺苷和DHEA色譜峰的峰面積值。結(jié)果：腺苷和DHEA色譜峰峰面積RSD分別為0.92%(n=6)和1.03%(n=6)。結(jié)果表明，本方法的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10 μL，在室溫條件下，分別放置0，2，4，8，12，24，48 h，進(jìn)樣測定腺苷、DHEA峰面積值。結(jié)果：腺苷和DHEA峰面積的 RSD分別為2.07%(n=6)和1.65% (n=6) 。結(jié)果表明：供試品溶液在48 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.8 加樣回收率

分別稱取已知含量的供試粉末6份，精密稱定后，再分別加入相當(dāng)含量的腺苷和DHEA對(duì)照品溶液，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.3項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)行含量測定，分別計(jì)算回收率。結(jié)果：腺苷和DHEA平均加樣回收率分別率為98.11% (RSD=1.38%)和97.70%(RSD=1.22%)。見表1、表2。

表1 山藥樣品中腺苷的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果n=6

表2 山藥樣品中DHEA的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果n=6

2.9 結(jié)果分析

精密稱取不同來源的山藥粉末，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄峰面積積分值，外標(biāo)法計(jì)算腺苷和DHEA的含量，結(jié)果見表3。

表3 不同來源山藥藥材中腺苷及DHEA的含量n=6

3 討 論

3.1 DHEA提取條件優(yōu)化

在DHEA測定前處理時(shí)，曾根據(jù)李軍等[13]的優(yōu)化方法，先以甲醇-丙酮(6∶4，v/v)為提取溶媒進(jìn)行超聲提取，然后利用水浴回收提取溶媒，再以二氯甲烷為萃取溶媒進(jìn)行多次萃取等主要工序?qū)ι剿幹蠨HEA進(jìn)行提取并分析，發(fā)現(xiàn)雖然該方法提取效果較好，DHEA可以被較好地富集和檢測，但是提取過程復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和加樣回收率較難控制。此外，采用甲醇、乙醇、甲醇-丙酮(1∶1，v/v)等溶劑對(duì)山藥樣品進(jìn)行超聲1 h提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種溶劑的提取效果沒有明顯差異，因此，綜合考慮提取時(shí)間、溶劑用量及環(huán)保因素，最終以甲醇作為提取溶劑,按本文操作方法制備供試品溶液。

本實(shí)驗(yàn)采用的方法大大簡化了山藥中DHEA的提取過程，減少了有毒試劑的使用，縮短了提取時(shí)間，且提取率與李軍等的方法相比無明顯差異。

3.2 結(jié)果分析

從測定結(jié)果看，不同來源山藥中腺苷和DHEA含量差別較大，可能由于品種及生長環(huán)境的差異造成。研究表明，馴化野生山藥雄株中腺苷和DHEA含量最高，顯著高于野生山藥中的含量，說明馴化過程對(duì)野生山藥的改良起到了積極作用。另外，馴化野生山藥雄株中DHEA含量是公認(rèn)的營養(yǎng)成分較高的鐵棍山藥的3倍多，進(jìn)一步說明該山藥品質(zhì)的優(yōu)異性。

另外，紫山藥中并未檢測到腺苷和DHEA兩種成分的存在，這可能與紫山藥的品種有關(guān)。

本研究對(duì)山藥中腺苷和DHEA成分的提取和測定條件進(jìn)行優(yōu)化，可為山藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)，為山藥品種的選育和馴化提供一定的理論基礎(chǔ)。