基因片段掃描檢測T細(xì)胞受體多樣性運用于益艾康膠囊治療艾滋病的效果觀察*

李 杰，桑 鋒，鄧博文，岳靜宇，李 強(qiáng)，郭會軍

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院艾滋病臨床研究中心 河南省病毒性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室，河南 鄭州 450000)

人類免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus，HIV)主要侵犯人體CD4+T細(xì)胞，破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)，在此過程中T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)多樣性同樣遭到破壞。中藥具有多系統(tǒng)、多環(huán)節(jié)、多靶點調(diào)控的特點，在防治復(fù)雜、慢性疾病方面具有獨特優(yōu)勢。益艾康膠囊 (由人參、黃芪、白術(shù)、茯苓、當(dāng)歸、川芎、白芍、黃芩等組成) 是一種通過調(diào)節(jié)免疫治療艾滋病的中藥制劑，可以穩(wěn)定和提高HIV患者CD4+T細(xì)胞數(shù)量[1]，但對TCR多樣性有無影響尚不完全清楚。TCR多樣性能夠反映機(jī)體免疫系統(tǒng)狀態(tài)，近年來對其的檢測逐漸被運用于淋巴瘤的診斷[2]，但其在艾滋病研究中的運用，目前國內(nèi)報道較少。常用的TCR多樣性檢測方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)，其原理是利用免疫球蛋白或TCR基因重排過程中V-D-J區(qū)互相靠攏的特征，設(shè)計通用引物在一定范圍內(nèi)擴(kuò)增出特征性基因片段[3]。基因片段掃描是一種比較精確的片段分析技術(shù)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳掃描識別不同熒光信號，通過數(shù)據(jù)分析軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行自動分析。它不僅能自動顯示出擴(kuò)增產(chǎn)物的清晰峰形，還能得到各產(chǎn)物片段大小和強(qiáng)度的具體數(shù)值，且能夠從峰形、曲線下面積、離散度等方面較為全面地評估TCR多樣性變化情況。本研究將TCR β鏈的互補決定區(qū)3(complementarity-determining region 3,CDR3)基因多樣性檢測運用于益艾康膠囊治療艾滋病的臨床觀察中，探討該方法運用的可行性、局限性等問題。

1 材料與方法

1.1 樣 本

從河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院艾滋病臨床研究中心樣本儲存庫保存的河南省中醫(yī)藥治療艾滋病試點項目樣本中，選取40例益艾康膠囊治療HIV/AIDS 1年的全血樣本作為益艾康膠囊組；另外采集17例健康者(均簽署知情同意書)血液樣本作為健康對照組。

1.2 試劑與儀器

血液基因組DNA提取試劑盒(規(guī)格50 T，批號27121)、PCR預(yù)混液(無染料,2×Taq MasterMix,規(guī)格5 mL,批號150911)，均為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；去離子甲酰胺(Hi-Di，規(guī)格5 mL,批號81234347)、分子量內(nèi)標(biāo)(Liz-500，規(guī)格500 assay，批號1212339)、液體分離膠(Pop-7，規(guī)格5 mL，批號1612138)、電泳緩沖液(10 ×，規(guī)格25 mL，批號1606477)，均為Applied Biosystems公司產(chǎn)品。C1000 touch PCR儀,Bio-Rad公司產(chǎn)品；3130 XL測序儀,Applied Biosystems公司產(chǎn)品。

1.3 方 法

1.3.1 全血基因組DNA提取

①取1 mL全血放入 1.5 mL EP管中，加入 400 μL 裂解液1渦旋15 s后， 8 000 r/ min 離心1 min，棄上清液，重復(fù)1次；加入1 mL 裂解液 2，上下翻轉(zhuǎn)，渦旋后8 000 r/ min 離心1 min， 棄上清液，重復(fù)1 次。②加入蛋白酶K 10 μL，反復(fù)吹打， 再加入 320 μL消化液，58 ℃水浴中消化 15 min。③加入 110 μL純化液， 15 000 r/ min 離心1 min，吸出上清液，放入加有1 mL無水乙醇離心管中，上下翻轉(zhuǎn)可見絮狀DNA析出。 ④將液體轉(zhuǎn)入離心柱中，8 000 r/ min 離心 1 min，棄濾液。⑤加入 200 μL 體積分?jǐn)?shù)為700 mL/L乙醇于濾柱內(nèi)， 8 000 r/ min 離心 1 min， 棄濾液。⑥將離心柱放入潔凈EP管中，加入 100 μL水，靜置10 min后 8 000 r/ min 離心 1 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 設(shè)計合成熒光引物與PCR

引物組合見表1。反向引物均用FAM標(biāo)記，由生工生物技術(shù)公司合成?；旌弦飼r每條引物終濃度為10 nmol/L。 PCR反應(yīng)體系 50 μL，包括：2×PCR Mix (無染料)25 μL，上游引物 2 μL，下游引物 2 μL，模版30 ng，補水至 50 μL。反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性 10 min，94 ℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s， 72 ℃延伸 30 s， 40個循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。

1.3.3 TCR β鏈基因重排檢測

2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶于8 μL Hi-Di,加入96孔裙邊板中，每孔加入0.5 μL Liz-500，95 ℃孵育 2 min，-20 ℃冷卻后上機(jī)檢測，采用 Pop-7液體膠，50 cm 毛細(xì)管在3130 XL 測序儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，選擇片段分析模塊收集數(shù)據(jù)。

1.3.4 掃描數(shù)據(jù)分析

采用 GeneMapperID-X軟件進(jìn)行片段掃描數(shù)據(jù)分析，以目標(biāo)片段區(qū)域的曲線下面積和、擴(kuò)增峰離散度及峰形圖譜等指標(biāo)表示TCR種類和數(shù)量，分析 TCR β 鏈可變區(qū)CDR3 V、D、J區(qū)基因重組變化。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析與處理

采用GeneMapperID-X軟件用于收集數(shù)據(jù)，計算HIV/AIDS患者目標(biāo)區(qū)域曲線下面積總和作為 TCR β 鏈基因重排多樣性指標(biāo)分析益艾康膠囊治療前、后變化情況。因為TCR多樣性個體間差異較大，所以健康對照組與HIV/AIDS患者組之間的比較不能單純采用曲線下面積和。本研究采用健康者及HIV/AIDS患者目標(biāo)區(qū)域片段四分位間距(P75-P25)表示片段分布的離散率(由于原始數(shù)據(jù)數(shù)量級較大，分析時則同比例縮小)，以離散率代表多樣性，分別用以比較HIV/AIDS患者治療前、后與健康者的離散率差異，進(jìn)而反映多樣性差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 基因組DNA質(zhì)量分析

以Liz-500作為分子量標(biāo)志物，通過毛細(xì)管電泳在分子量50～500 bp之間掃描出15條分離清晰的固定分子量標(biāo)記片段，用以判定目標(biāo)片段大小。樣本DNA均可檢測出300 bp以上擴(kuò)增峰，說明DNA較為完整，可以滿足檢測需要。空白對照無擴(kuò)增峰，表明實驗過程中無外源性核酸污染。見圖1。

圖1 Liz-500分子量內(nèi)標(biāo)物掃描圖譜及內(nèi)標(biāo)曲線

2.2 健康對照組TCRβ鏈基因重排多樣性掃描峰形圖譜

X軸代表各目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物大小(bp)，Y軸代表目標(biāo)片段相對熒光信號強(qiáng)度；TCR β鏈各管分別在其目標(biāo)區(qū)域出現(xiàn)一系列擴(kuò)增峰，呈現(xiàn)類似鐘形的正態(tài)分布。見圖2。

2.3 HIV/AIDS患者組治療前后TCR β鏈曲線下面積對比

益艾康膠囊治療前后TCR β鏈 A管和B管曲線下面積對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；TCR β 鏈 C管治療前后的曲線下面積對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，治療后αβ T細(xì)胞TCR β鏈D-J區(qū)基因重排片段種類和數(shù)量有所增加，多樣性得到改善。見表2、圖3。

表2 HIV/AIDS患者組治療前后TCR β鏈曲線下面積對比

圖3 益艾康膠囊治療前后TCR β鏈多樣性增加圖譜

2.4 兩組治療前后TCR β鏈離散度對比

見表3。HIV/AIDS患者治療前后TCR β鏈各管分別與健康對照組對比，離散度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，顯示健康者PCR產(chǎn)物目的片段離散度較小，相比之下更接近正態(tài)分布。A管和B管同管治療前后對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；C管治療前后對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 兩組治療前后TCR β離散度對比

3 討 論

近年來，T細(xì)胞受體V區(qū)基因重排多樣性檢測被越來越多地運用于腫瘤特別是淋巴瘤等疾病的研究中[4-5]。TCR是T細(xì)胞特異性識別抗原的受體。在同一個體內(nèi)，TCR組成多樣性極為豐富的TCR庫，賦予個體對環(huán)境中各種各樣的病原體(抗原)進(jìn)行識別和應(yīng)答的巨大潛力。T細(xì)胞受體庫是由V基因片段末端、D基因片段、J基因片段前端及連接時插入的核苷酸序列等一系列基因片段重排共同組成[6-7]，因此，通過測定特定基因重排片段出現(xiàn)的頻率可以反映特定T細(xì)胞克隆擴(kuò)增的程度，從而反映T細(xì)胞免疫系統(tǒng)狀態(tài)；此外，分析不同時間點TCR多樣性變化情況可以動態(tài)了解整體T細(xì)胞免疫變化情況。根據(jù)所含肽鏈不同可將TCR分為TCR αβ 和TCR γδ兩種類型。正常人體內(nèi)95%為TCR αβ，少數(shù)為TCR γδ。本研究主要針對αβ T細(xì)胞中長鏈TCR β鏈基因重排多樣性進(jìn)行檢測，建立檢測方法，分析HIV/AIDS患者在益艾康膠囊治療前后的TCR變化情況，為臨床療效觀察提供依據(jù)。

健康者在沒有外來抗原特異性刺激的情況下，機(jī)體αβ T細(xì)胞受體基因片斷處于隨機(jī)重排狀態(tài)，細(xì)胞受體表現(xiàn)為多克隆性，其基因片段掃描后呈現(xiàn)典型的鐘形高斯分布特征，從而保障機(jī)體具有識別外界多樣性抗原的能力[8]。如果機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重病毒性感染或罹患T細(xì)胞淋巴瘤等，機(jī)體免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)動員激活狀態(tài)，TCR基因會出現(xiàn)寡克隆或單克隆重組表達(dá)，其TCR多樣性出現(xiàn)損害，進(jìn)而導(dǎo)致其他病原體機(jī)會性感染的增加。

自河南省中醫(yī)藥治療艾滋病試點項目開展以來，益艾康膠囊被廣泛用于HIV/AIDS患者的治療。十余年的臨床實踐證實，其能夠改善HIV/AIDS患者的臨床癥狀和體征，提高患者生存質(zhì)量，降低病死率[9-11]。雖然益艾康膠囊有較好的療效，但其作用機(jī)制不甚明了，影響了該藥的推廣，因此探索其作用機(jī)制有重要作用。本研究中，從曲線下面積來看，TCR β鏈A管和B管治療前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義，即TCR β鏈V-J重組區(qū)治療前后差別不大；TCR β鏈C管治療前后有統(tǒng)計學(xué)差異，表明TCR β鏈D-J區(qū)治療后基因重排情況與治療前不同，多樣性得到改善。就片段離散度分析結(jié)果來看，HIV/AIDS患者相比健康者離散度大，正態(tài)性不優(yōu)于健康者。治療后TCR β鏈C管離散度與治療前有所增大(P<0.05)。結(jié)合治療前后曲線下面積總和比較分析可知，雖然治療后TCR β鏈D-J區(qū)基因重排多樣性得到改善，但其離散度比治療前大，可能是主峰位置偏移所致。

TCR β鏈基因重排多樣性可以作為一種新的檢測手段用于益艾康膠囊治療HIV/AIDS患者的臨床療效觀察。但是，TCR影響因素較多，年齡、所處地區(qū)、心理狀態(tài)等均可能對機(jī)體免疫功能產(chǎn)生影響，而排除此類因素較為困難，因此，將其在HIV感染患者與健康者之間進(jìn)行比較有一定的局限性，但跟蹤隨訪同一位患者進(jìn)行比較較為可行。同時，基于HIV感染后機(jī)體的免疫重建機(jī)制， TCR多樣性變化觀察可能是一個長期的過程。另外，分析該指標(biāo)與T細(xì)胞亞群檢測和病毒載量的相關(guān)性還需進(jìn)一步探討。