十字花科植物蠟質(zhì)形成特性及分子機(jī)制研究進(jìn)展

陸偉杰，鄭偉尉，吳硯農(nóng)，臧運祥

（浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 311300）

十字花科Brassicaceae植物主產(chǎn)北溫帶，約375屬3 200種。在中國主要集中于西南、西北、東北高山以及丘陵地區(qū)[1]，其中蘿卜屬Raphanus與蕓薹屬Brassica植物是中國最重要的蔬菜與油料作物，該科部分種類還可作為藥用、觀賞用、染料用或食用[2]。植物表皮蠟質(zhì)是覆蓋在陸生植物地上部器官表面的脂質(zhì)成分，也存在于木栓的基質(zhì)、愈傷組織、花粉粒以及種皮中[3]，其疏水結(jié)構(gòu)在植物表面起極其重要的防衛(wèi)功能，在植物與周圍環(huán)境的相互作用中發(fā)揮著重要作用[4]。本研究從十字花科植物蠟質(zhì)類型、結(jié)構(gòu)、成分、含量、功能、遺傳特性、合成與轉(zhuǎn)運途徑、分子機(jī)制等方面進(jìn)行綜述，為十字花科植物的蠟質(zhì)代謝研究提供參考。

1 十字花科植物蠟質(zhì)的類型及其功能

1.1 十字花科植物蠟質(zhì)的形態(tài)和成分

1.1.1 蠟質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu) 十字花科植物的蠟質(zhì)呈片狀、柱狀和網(wǎng)狀等26種形態(tài)類型，不同種類植物的蠟質(zhì)形態(tài)不同[5]。徐秀萍等[6]采用掃描電鏡(SEM)觀察擬南芥Arabidopsis thaliana表皮蠟質(zhì)，發(fā)現(xiàn)主要呈桿狀，少量呈片狀、管狀、碟狀和傘狀。李紅蓮[7]發(fā)現(xiàn)：紅菜薹Brassica campestris表皮蠟質(zhì)為片狀和網(wǎng)狀構(gòu)成的不規(guī)則三維結(jié)構(gòu)。李帥等[8]發(fā)現(xiàn)：甘藍(lán)型油菜‘中雙11’Brassica napus‘Zhongshuang 11’葉表皮蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)主要為桿狀和顆粒狀(小片狀)。牟香麗等[9]發(fā)現(xiàn)：不同生長時期甘藍(lán)Brassica oleraceavar.capitata表皮蠟質(zhì)呈現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)，苗期大多為顆粒狀、片狀和針狀，結(jié)球期則較多為圓柱狀和片狀，成熟期以片狀和針狀為主。張曦[10]發(fā)現(xiàn)白菜Brassica pekinensis成熟葉片蠟質(zhì)大多呈現(xiàn)出棒狀且前端有圓形突起。

1.1.2 蠟質(zhì)的化學(xué)成分 十字花科植物蠟質(zhì)主要為超長鏈脂肪酸及其衍生物，包括烷烴、脂肪酸、醇、醛、酮的同系物，偶爾會出現(xiàn)環(huán)狀化合物，如甾醇或三萜類化合物等[11]。蠟質(zhì)通常使用三氯甲烷、正己烷等有機(jī)溶劑提取，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)鑒定成分[12]。植物表皮蠟質(zhì)各成分占比不同。如白菜[10]成熟葉片蠟質(zhì)的主要成分中酮類占1.02%，醇類占8.33%，烷烴占55.09%，酯類占26.34%。不同種類植物的表皮蠟質(zhì)成分含量也存在差異[13]。如甘藍(lán)型油菜‘中雙11’葉[8]表皮蠟質(zhì)成分中烷烴為 8.24 μg·cm?2，次級醇為 1.72 μg·cm?2，酮為 1.62 μg·cm?2，初級醇為 0.57 μg·cm?2，脂肪酸為0.10 μg·cm?2，醛為 0.79 μg·cm?2，未知成分為 9.33 μg·cm?2，總量為 22.37 μg·cm?2；擬南芥[14]莖稈的表皮蠟質(zhì)中初級醇為 0.58 μg·cm?2，脂肪酸為 0.10 μg·cm?2，醛為 1.90 μg·cm?2，烷烴為 13.13 μg·cm?2，次級醇為 3.83 μg·cm?2，酮為 5.95 μg·cm?2，總含量為 28.99 μg·cm?2。而普通白菜自交不親和系 13S106[15]葉片的蠟質(zhì)成分中烷烴為 13.60 μg·cm?2，醛為 0.90 μg·cm?2，醇為 3.20 μg·cm?2，酮為 8.30 μg·cm?2，脂肪酸為1.20 μg·cm?2，蠟酯為2.40 μg·cm?2。在上述不同十字花科物種中，蠟質(zhì)主要成分均為烷烴，次要成分則有所不同。

1.2 十字花科植物蠟質(zhì)的功能

十字花科植物表皮蠟質(zhì)在維持水分平衡、反射紫外線、減少外來機(jī)械損傷、降低低溫傷害、抵御細(xì)菌真菌入侵、防止昆蟲侵食等抵抗生物與非生物脅迫中起著重要作用[16]，同時兼具影響葉片和果實著色、防止果實開裂和植株育性等生理功能[17]。

1.2.1 抗低溫脅迫 低溫脅迫易引起植物酶活性降低、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞失水、代謝紊亂等，對植物生長發(fā)育造成多種負(fù)面影響[18]。倪郁等[19]發(fā)現(xiàn)：4 ℃低溫脅迫下擬南芥生長發(fā)育緩慢、葉色變深，蠟質(zhì)晶體的分布密度、大小、形態(tài)等發(fā)生改變。唐帥等[20]發(fā)現(xiàn)：4 ℃低溫脅迫下擬南芥葉片表皮蠟質(zhì)成分增加，烷烴、脂肪酸、醛、初級醇和酮相對含量分別增加54.34%、29.61%、54.40%、24.07%和137.80%；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測顯示蠟質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著提高，說明擬南芥通過提高蠟質(zhì)含量來緩解低溫脅迫，預(yù)防低溫對植物內(nèi)部組織的傷害。

1.2.2 抗紫外線脅迫 紫外線中UV-B波長為280～315 nm，可對植物表面造成損傷。PRUDNIKOVA等[21]發(fā)現(xiàn)：過量UV-B處理會造成植株干質(zhì)量降低，葉面積減小，凈光合速率下降及花期變短等。宋超[14]發(fā)現(xiàn)：UV-B脅迫下擬南芥蠟質(zhì)相對含量明顯增加，蠟質(zhì)相關(guān)基因CER3、CER4、KCS1表達(dá)量顯著提高，其中CER4基因的相對表達(dá)增加了13.80倍，CER1和WIN1表達(dá)量降低。此外，UV-B脅迫下擬南芥蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生熔融，晶體由桿狀變成片狀，蠟質(zhì)覆蓋面積增加，蒸騰作用減少，從而達(dá)到反射更多紫外線的效果。

1.2.3 抗干旱脅迫 植物蠟質(zhì)作為疏水屏障，在限制非氣孔水分散失中扮演重要角色[22?23]。柴凌燕[24]發(fā)現(xiàn)：擬南芥過量表達(dá)蠟質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子WIN1可提高蠟質(zhì)合成量，調(diào)節(jié)表皮滲透性，增強植株耐旱性。Lü等[25]發(fā)現(xiàn)：擬南芥CER9編碼一種與植物抗旱性相關(guān)的決定因子，該因子缺失可以增加蠟質(zhì)合成，阻塞更多的氣孔，抑制蒸騰作用。周燕等[26]發(fā)現(xiàn)：甘藍(lán)型油菜中BnWIN2C01的特異性表達(dá)影響了葉片蠟質(zhì)合成，從而影響植株水分平衡。

1.2.4 抗敗育 花粉發(fā)育異常會導(dǎo)致植株減產(chǎn)或雜交不育，蠟質(zhì)是花粉表面含油層的重要成分，在植物生殖發(fā)育方面發(fā)揮重要作用。KOCH等[27]發(fā)現(xiàn)：蠟質(zhì)不僅影響植物葉片和果實的形態(tài)、發(fā)育，還影響植株花粉的發(fā)育情況。劉艷艷等[28]發(fā)現(xiàn)：FAX1基因缺失會抑制擬南芥營養(yǎng)生長，造成植株矮小、莖纖細(xì)、花粉稀少、角果短小等，同時還影響花粉壁的發(fā)育與花粉的育性，進(jìn)而影響授粉過程。徐法青[29]發(fā)現(xiàn)：擬南芥CER3基因參與花粉脂質(zhì)的合成或轉(zhuǎn)運，該脂質(zhì)的缺失會影響花粉與柱頭的識別，阻斷水合作用，最終導(dǎo)致雄性不育。

1.2.5 抗病蟲害 蠟質(zhì)可以減少葉片表面水分，減少病菌停留和降低病菌入侵。JU等[30]發(fā)現(xiàn)：蠟質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)可促使水分形成水滴以便滑落，并帶走葉片表面的灰塵、污染物和病菌等。SURVILA等[31]發(fā)現(xiàn)：相較于正常植株，擬南芥蠟質(zhì)缺失植株表面細(xì)菌更多，更易發(fā)生病害。蠟質(zhì)在植物抵抗蟲害方面也起著重要作用，它可通過光的反射，改變植物表現(xiàn)出的顏色，影響昆蟲視覺，減少昆蟲取食和產(chǎn)卵。BOHINC等[32]以8種基因型甘藍(lán)為對象進(jìn)行田間試驗，發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)對甘藍(lán)跳甲Phyllotretaspp.和菜椿Eurydemaspp.的生存有抑制作用，且蠟質(zhì)含量越高，植株上甘藍(lán)跳甲和菜椿越少。

2 十字花科植物蠟質(zhì)遺傳特性

十字花科植物蠟質(zhì)缺失表型明顯，表面無蠟質(zhì)覆蓋的植株呈現(xiàn)葉色亮綠等性狀，包括單基因隱性遺傳、單基因顯性遺傳和雙基因隱性遺傳等3種遺傳特性。

2.1 單基因隱性遺傳

ANSTEY等[33]在青花菜Brassica oleraceavar.italica中發(fā)現(xiàn)了十字花科植物中第1個符合單基因隱性遺傳規(guī)律的蠟質(zhì)缺失突變體。劉澤洲等[34]發(fā)現(xiàn)：甘藍(lán)蠟粉缺失突變體10Q-961符合單基因隱性遺傳規(guī)律。李紅蓮等[7]對無蠟質(zhì)紅菜薹與有蠟質(zhì)紅菜薹雜交建立6世代群體并進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)缺失突變體符合隱性遺傳規(guī)律。王燦潔等[15]發(fā)現(xiàn)紅菜薹自交系13S106蠟質(zhì)缺失性狀受隱性單基因控制。

2.2 單基因顯性遺傳

蒲媛媛等[35]發(fā)現(xiàn)：甘藍(lán)型油菜光葉突變體GL的蠟質(zhì)缺失性狀受單個顯性基因控制。劉東明[36]發(fā)現(xiàn)：甘藍(lán)10Q-974亮綠性狀符合單基因顯性遺傳規(guī)律，突變基因BoGL1位于8號染色體177 kb的區(qū)間內(nèi)，與基因Bol018504的表達(dá)相關(guān)。

2.3 雙基因隱性遺傳

周熙榮等[37]發(fā)現(xiàn)：甘藍(lán)型油菜雜交F2中出現(xiàn)少數(shù)蠟質(zhì)缺失的植株，其無蠟質(zhì)性狀由2對隱性基因控制。莫鑒國等[38]對加拿大引進(jìn)的無蠟質(zhì)甘藍(lán)型油菜種質(zhì)材料‘Nilla’進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其蠟質(zhì)缺失性狀也是受2對隱性基因控制。

3 十字花科植物蠟質(zhì)合成分子機(jī)制

3.1 蠟質(zhì)合成途徑

十字花科植物蠟質(zhì)合成C16～C18脂肪酸合成、C20～C34超長鏈脂肪酸合成、超長鏈脂肪酸衍生物合成等3個途徑(圖1)。合成相關(guān)酶如表1所示。

圖1 擬南芥蠟質(zhì)生物合成途徑[11]Figure 1 Wax biosynthesis pathway in Arabidopsis thaliana

3.1.1 C16～C18脂肪酸合成 C16～C18脂肪酸在質(zhì)體中合成，初始反應(yīng)物乙酰輔酶A在乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合成酶的作用下，以每次增加2個碳原子的方式延長碳鏈，形成C16～C18的酰基載體蛋白[39]，然后在酰基載體蛋白硫酯酶(FAT)作用下水解生成C16～C18脂肪酸[40]。脂肪酸經(jīng)長鏈?；枷〢合成酶(LACS)催化后以脂肪酰輔酶A的形式進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[41]，進(jìn)行下一步反應(yīng)。ZHAO等[42]發(fā)現(xiàn)：擬南芥的9個LACS基因中，LACS1和LACS2參與蠟質(zhì)的合成。Lü等[43]和JESSEN等[44]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)：LACS1和LACS4參與花粉外被長鏈脂肪酸的合成。

3.1.2 C20～C34超長鏈脂肪酸合成 C20～C34超長鏈脂肪酸合成場所是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。C16～C18脂肪酰輔酶A與丙二酰輔酶A通過脂肪酸延伸酶復(fù)合物(FAE)進(jìn)行合成，每次循環(huán)增加2個碳原子，多次循環(huán)延伸碳鏈，最終形成C20～C34超長鏈脂肪酸，其中丙二酰輔酶A由乙酰輔酶A于細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)過乙酰輔酶A羧化酶催化形成。該反應(yīng)中的FAE屬于多酶復(fù)合體，包括β-酮酰輔酶A合成酶(KCS)，β-酮酰輔酶A還原酶(KCR)，反式烯酰輔酶A還原酶(ECR)和β-羥酰-酰基輔酶A脫水酶(HCD)4種酶，其中KCS是該反應(yīng)的關(guān)鍵酶，對反應(yīng)底物具有特異性。QUIST等[45]發(fā)現(xiàn)：擬南芥KCS基因分為FAE1類和ELO類，前者包含F(xiàn)AE1、CER6、KCS1和FDH等4個亞組，而ELO類基因功能還未見報道。SUH等[46]發(fā)現(xiàn)：擬南芥與蠟質(zhì)相關(guān)的基因有KCS1、KCS2、KCS13、KCS10、KCS20和CER6等；擬南芥中的KCR基因有KCR1和KCR2等2種，KCR1沒有功能，KCR2參與超長鏈脂肪酸的合成。ZHAO等[47]發(fā)現(xiàn)：相比野生型，cer10突變體器官小，蠟質(zhì)少；CER10基因在表皮和種子中有ECR功能活性，參與超長鏈脂肪酸合成。目前對HCD的研究較少，BACH等[48]發(fā)現(xiàn)：pas2-1突變體的蠟質(zhì)含量明顯少于野生型，PAS2基因功能完全喪失會最終導(dǎo)致胚死亡，推測PAS2在超長鏈脂肪酸合成和生物發(fā)育中起到非常關(guān)鍵的作用。ROUDIER等[49]發(fā)現(xiàn)：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的PAS1和PAS2，KCR和ECR存在蛋白互作，并認(rèn)為PAS1在多酶復(fù)合體中扮演分子構(gòu)架的角色。

3.1.3 超長鏈脂肪酸衍生物合成 同位素示蹤和氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)驗證了超長鏈脂肪酸通過?；€原途徑和脫羰基途徑衍生出其他蠟質(zhì)成分。?；€原途徑也叫醇合成途徑，超長鏈脂肪酰輔酶A經(jīng)脂肪酰輔酶A還原酶(FAR)還原產(chǎn)生初級醇，初級醇與C16～C18脂肪酸輔酶A經(jīng)蠟酯合成酶(WS)縮合產(chǎn)生蠟酯。擬南芥通過酰基還原途徑產(chǎn)生的蠟質(zhì)相對含量約為20%。CER4基因編碼的酰基輔酶A還原酶在該途徑中起到關(guān)鍵作用，主要將擬南芥表皮和根部脂肪酸還原成初級醇。ROWLAND等[50]發(fā)現(xiàn)：擬南芥cer4突變體莖中醇與蠟酯含量顯著降低。LI等[51]發(fā)現(xiàn)：擬南芥wsd1突變體蠟酯含量明顯少于野生型。脫羰基途徑也叫烷烴合成途徑，超長鏈脂肪酰輔酶A經(jīng)脂肪酰輔酶A還原酶(FAR)還原產(chǎn)生的醛經(jīng)醛脫羰酶脫羰產(chǎn)生烷烴，經(jīng)中鏈烷烴羥化酶(MAH)1次羥化產(chǎn)生次級醇，再次羥化生成酮。擬南芥約80%的蠟質(zhì)組分由該途徑產(chǎn)生。BERNARD等[52]發(fā)現(xiàn)：擬南芥cer3突變體中醛含量減少，說明CER3基因在產(chǎn)生醛的過程起著重要作用。OSHIMA等[53]和劉秀林[54]發(fā)現(xiàn)：擬南芥cer1突變體莖表皮蠟質(zhì)組分中烷烴含量減少，而醛含量增加，說明CER1編碼的酶參與烷烴產(chǎn)生。GREER等[55]發(fā)現(xiàn)：MAH1是烷烴羥化酶，擬南芥mah1突變體中次級醇和酮的含量顯著減少。

3.2 蠟質(zhì)轉(zhuǎn)運途徑

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上經(jīng)過各種酶加工修飾合成的蠟質(zhì)成分會先轉(zhuǎn)運到細(xì)胞膜，再通過轉(zhuǎn)運蛋白進(jìn)行跨膜運輸，最后經(jīng)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白跨細(xì)胞壁轉(zhuǎn)運到角質(zhì)層，轉(zhuǎn)運途徑及轉(zhuǎn)運蛋白見圖2和表2。

圖2 擬南芥蠟質(zhì)轉(zhuǎn)運途徑[36]Figure 2 Wax transport pathway in Arabidopsis thaliana

表2 擬南芥參與蠟質(zhì)轉(zhuǎn)運的蛋白Table 2 Waxy transport proteins in Arabidopsis thaliana

3.2.1 細(xì)胞內(nèi)的蠟質(zhì)轉(zhuǎn)運 目前對蠟質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運到質(zhì)膜有2種推測：①蠟質(zhì)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與質(zhì)膜內(nèi)側(cè)接觸的部分直接進(jìn)行運輸；②蠟質(zhì)先進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌的囊泡，再經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運到細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)[56]。

3.2.2 蠟質(zhì)的跨膜運輸 蠟質(zhì)到達(dá)質(zhì)膜后利用相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白進(jìn)行跨膜運輸。ABCG11和ABCG12是擬南芥中2個蠟質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)的半分子轉(zhuǎn)運蛋白，LUO等[57]發(fā)現(xiàn)：ABCG11通過與另1個ABCG11結(jié)合形成同源二聚體或是與其他半分子轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合形成異源二聚體來轉(zhuǎn)運蠟質(zhì)分子。BIRD等[58]發(fā)現(xiàn)：abcg11突變體生長速度減緩，表皮蠟質(zhì)含量減少。QUILICHINI等[59]發(fā)現(xiàn)：ABCG12基因編碼定位在質(zhì)膜上的ABC轉(zhuǎn)運蛋白，ABCG12基因的缺失導(dǎo)致擬南芥表皮部位的蠟質(zhì)顯著減少，而細(xì)胞內(nèi)蠟質(zhì)總含量并沒有顯著變化，說明該基因缺失只影響了質(zhì)膜中的蠟質(zhì)轉(zhuǎn)運過程，而細(xì)胞內(nèi)蠟質(zhì)合成并沒有受阻。

3.2.3 蠟質(zhì)轉(zhuǎn)移到角質(zhì)層 到達(dá)細(xì)胞膜外的蠟質(zhì)由脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(LTPs)轉(zhuǎn)運到角質(zhì)層。LTPG1是一種脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白，包含8個保守的半胱氨酸，形成疏水囊泡。DeBONO等[60]發(fā)現(xiàn)：ltpg1突變體的莖和角果表皮蠟質(zhì)C29烷烴含量減少，但其他蠟質(zhì)成分不存在顯著差異，說明突變體缺失的蛋白可能對C29烷烴轉(zhuǎn)移具有專一性。孫偉[61]發(fā)現(xiàn)：Th-nsLTP是一個非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白，通過參與小鹽芥表皮蠟質(zhì)轉(zhuǎn)移過程，使表皮蠟質(zhì)含量減少，晶體結(jié)構(gòu)從桿狀轉(zhuǎn)為柱狀。

4 展望

十字花科植物蠟質(zhì)形成分子機(jī)制極其復(fù)雜，今后可從以下幾個方面深入探究。①當(dāng)前對蠟質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)與成分含量的研究都是獨立的，若能尋找不同蠟質(zhì)成分形成晶體過程中的空間折疊規(guī)律，將有助于探明蠟質(zhì)成分與蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣性背后的具體對應(yīng)關(guān)系。②目前在蠟質(zhì)合成與轉(zhuǎn)運方面研究較多，但在外界環(huán)境條件如低溫、干旱或光照強度對蠟質(zhì)合成影響方面的研究較少，需要更多的相關(guān)研究闡明環(huán)境影響蠟質(zhì)合成的機(jī)制。③培育蠟質(zhì)過量的新品種對于研究蠟質(zhì)形成分子機(jī)制及抗病育種都具有重要意義。