細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子通過Toll樣受體-4信號通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞自噬水平

趙嫦清，王志明，梁星，郭瑞威，楊麗霞*，王先梅，石燕昆

(1聯(lián)勤保障部隊(duì)第920醫(yī)院心血管內(nèi)科，昆明 650100；2江蘇省蘇州市第九人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 蘇州 215000)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作為一種復(fù)雜的慢性血管炎癥性疾病，多種細(xì)胞因子、炎癥通路及相關(guān)降解機(jī)制均參與其調(diào)節(jié)，粥樣斑塊的突然破裂誘發(fā)急性心血管事件。近年發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN)[1]、Toll樣受體-4(Toll like receptor 4,TLR4)/核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)炎性通路[2]、自噬[3]均調(diào)節(jié)AS。

EMMPRIN又稱CD147，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移至內(nèi)膜，改變斑塊組成，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，增加斑塊脆性，在巨噬細(xì)胞表面大量表達(dá)[4]。TLR-4信號通路作為經(jīng)典的炎癥通路，可激活NF-κB通路，啟動炎癥鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[2]。在AS部位和斑塊中可發(fā)現(xiàn)NF-κB蛋白的大量表達(dá)，而在正常血管中很少檢測到[5]。自噬，即自我吞噬過程，是細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)的溶酶體降解途徑。其作為炎癥的負(fù)調(diào)節(jié)劑，可清除受損的細(xì)胞器和抑制促炎復(fù)合物的形成，減緩炎癥反應(yīng)[6]?；A(chǔ)水平的自噬可減輕炎癥反應(yīng)，及時清除功能失調(diào)的線粒體及受損的細(xì)胞器，對細(xì)胞起保護(hù)作用。但過度自噬則導(dǎo)致正常細(xì)胞死亡，斑塊纖維帽變薄，炎癥因子高表達(dá)，加劇斑塊破裂。自噬標(biāo)志一般包括LC3-Ⅱ、Beclin1和P62，當(dāng)發(fā)生過度自噬時LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá)增加，而P62蛋白的表達(dá)量與時間相關(guān)，較短時間內(nèi)P62的表達(dá)可不變或者降低，超過24 h或48 h后可能升高。EMMPRIN在巨噬細(xì)胞中可激活NF-κB信號通路[7]，同時EMMPRIN也可上調(diào)細(xì)胞自噬水平[8]，具體通路還有待進(jìn)一步研究。TLR4和NF-κB通路的激活均可上調(diào)細(xì)胞自噬水平[9]。所以我們推測EMMPRIN、TLR-4信號通路和自噬三者之間存在一定關(guān)系。為證實(shí)這一假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)通過建立人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系(human monocytic leukemia cell line, THP-1)巨噬細(xì)胞模型，用EMMPRIN刺激及TAK-242抑制TLR4信號通路，觀察TLR4、NF-κB及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，以說明三者之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及主要試劑

人THP-1單核細(xì)胞購于中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會上海細(xì)胞庫。1640培養(yǎng)基購于美國HyClone公司，胎牛血清購于美國Gibco公司。佛波酯(phorbol myristate acetate, PMA)、4%多聚甲醛均購于北京索萊寶公司。EMMPRIN購于美國Kalang公司，TAK-242購于美國MCE公司。兔抗人TLR-4、NF-κB、Beclin1抗體及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)鼠抗均購于美國Abcam公司。P62小鼠抗人、LC3B兔抗人抗體及羊抗兔IgG抗體、羊抗兔熒光二抗、羊抗小鼠熒光二抗、DAPI均購于美國Cell Signaling Technology公司。羊抗小鼠IgG抗體購于武漢塞維爾生物公司，3%戊二醛購于北京酷萊搏公司。

1.2 人THP-1巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)及分組

肉眼觀察人THP-1單核細(xì)胞清亮透明，鏡下細(xì)胞呈圓形，大小均一，懸浮生長，生長量達(dá)70%～80%、計(jì)數(shù)達(dá)1×106個/ml時，用5 ng/ml的PMA誘導(dǎo)48 h。將其分為空白對照組(僅有RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的人THP-1巨噬細(xì)胞)、EMMPRIN組(1 ng/ml EMMPRIN刺激6 h)及TAK-242組[5 μmol/L TAK-242刺激4 h后，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)清洗3次，再加1 ng/ml EMMPRIN刺激6 h]。

1.3 蛋白印跡法檢測各組TLR4、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin1、P62蛋白表達(dá)水平

收集各實(shí)驗(yàn)組人THP-1巨噬細(xì)胞，加1 ml蛋白裂解液在冰上裂解15 min, 4 ℃下13 000 轉(zhuǎn)/min離心15 min后收集上清液，100 ℃變性5 min，根據(jù)所測蛋白分子量配膠。膠上每孔上樣30 μl蛋白懸液,100 V電泳3 h后切膠、轉(zhuǎn)膜[聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜]，Tris緩沖液(TBS+Tween,即Tris-HCl+NaCl+Tween20三種物質(zhì)，TBST)洗膜3次，每次10 min，隨后37 ℃下脫脂奶粉封閉1 h。分別用兔抗人TLR-4(1～3 μg/ml)、NF-κB(1∶50 000～1∶100 000)、LC3-Ⅱ(1∶1 000)、Beclin1(1∶2 000)、鼠抗人P62(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)抗體4 ℃孵育過夜。TBST清洗后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體(1∶3 000～1∶5 000)、羊抗兔IgG抗體(1∶1 000～1∶3 000)室溫避光孵育1 h，TBST清洗后用化學(xué)發(fā)光試劑(electrochemiluminescence，ECL)顯色液避光顯色3 min，Tamon MP顯影儀顯示灰度值，并計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量(目的蛋白與GAPDH蛋白的比值)。

1.4 免疫熒光檢測各組LC3-Ⅱ、Beclin1、P62蛋白熒光表達(dá)水平

將各組人THP-1巨噬細(xì)胞消化離心后爬片于蓋玻片上，4%多聚甲醛固定30 min，然后PBS清洗3次，每次5 min。加50～100 μl破膜工作液，室溫孵育10 min，結(jié)束后PBS清洗，隨后滴加山羊血清封閉30 min。加相應(yīng)二抗避光室溫孵育50 min，PBS清洗后去除PBS，加細(xì)胞核染色液[2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine, DAPI]染液避光室溫孵育10 min。PBS清洗后，封片劑將玻片封固在載玻片上，正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 人THP-1巨噬細(xì)胞模型的成功建立

5 ng/ml的PMA刺激人THP-1單核細(xì)胞48 h，建立人THP-1巨噬細(xì)胞模型。光學(xué)顯微鏡下人THP-1單核細(xì)胞懸浮生長，大小均一，呈圓形或類圓形(圖1A,B)；PMA誘導(dǎo)6 h后開始貼壁，細(xì)胞變?yōu)椴灰?guī)則，胞體逐漸增大(圖1C)；PMA誘導(dǎo)48 h后細(xì)胞基本貼壁生長，呈長梭形或棘形，部分伸出偽足(圖1D)。

圖1 人THP-1單核細(xì)胞和人THP-1巨噬細(xì)胞形態(tài)Figure 1 Morphology of human THP-1 monocytes and human THP-1 macrophagesA: human THP-1 monocytes (×40); B: human THP-1 monocytes (×100); C: human THP-1 macrophages after 6 h of PMA induction (×100); D: human THP-1macrophages after 48 h of PMA induction (×100). THP-1: human monocytic leukemia cell line; PMA: phorbol myristate acetate.

2.2 EMMPRIN及TAK-242對人THP-1巨噬細(xì)胞中TLR4、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin1、P62蛋白表達(dá)的影響

EMMPRIN可上調(diào)人THP-1巨噬細(xì)胞中TLR4、NF-κB、LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)，抑制P62蛋白的表達(dá)(P<0.05)，對Beclin1蛋白表達(dá)的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TAK-242可抑制人THP-1巨噬細(xì)胞中TLR4、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)P62蛋白表達(dá)(P<0.05；圖2)。

圖2 EMMPRIN及TAK-242對人THP-1巨噬細(xì)胞中TLR4、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin1、P62蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effects of EMMPRIN and TAK-242 on TLR4, NF-κB, LC3-Ⅱ, Beclin1, P62 protein expression in human THP-1 macrophagesA: Western blotting; B: Statistical analysis. EMMPRINL: extracellular matrix metalloproteinase inducer; TLR-4: Toll-like receptor-4; NF-κB：nuclear factor-κB; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Compared with control group，*P<0.05； compared with EMMPRIN group，#P<0.05.

2.3 EMMPRIN及TAK-242對人THP-1巨噬細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin1、P62蛋白熒光表達(dá)影響

EMMPRIN可促進(jìn)人THP-1巨噬細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin1的表達(dá)(P<0.05)，對P62蛋白熒光表達(dá)的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TAK-242可促進(jìn)人THP-1巨噬細(xì)胞中P62蛋白的表達(dá)(P<0.05)，對LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白熒光表達(dá)的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖3 EMMPRIN及TAK-242對人THP-1巨噬細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin1、P62蛋白熒光表達(dá)的影響Figure 3 Effect of EMMPRIN and TAK-242 on fluorescence expression of LC3-Ⅱ, Beclin1, P62 protein in human THP-1 macrophages.A: fluorescence expression of LC3-Ⅱ protein. RFP-LC3-Ⅱ refers to red fluorescence expression of LC3-Ⅱ protein. B: fluorescent expression of Beclin1 protein. GFP-Beclin1 refers to green fluorescent expression of Beclin1 protein. C: fluorescence expression of P62 protein. GFP-P62 refers to green fluorescent expression of P62 protein. DAPI is 20 times microscope staining of nuclear nuclei. D: statistical analysis of cumulative fluorescence optical density. EMMPRINL: extracellular matrix metalloproteinase inducer; DAPI 2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine. Compared with control group，*P<0.05；compared with EMMPRIN group，#P<0.05.

3 討 論

AS作為一種慢性血管疾病，圍繞巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化開始[10]。EMMPRIN在AS中大量表達(dá)，在人THP-1巨噬細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，EMMPRIN可介導(dǎo)NF-κB活化，促進(jìn)MMP-9、IL-6和TNF-α的表達(dá)，抑制EMMPRIN后，NF-κB信號通路的活性被抑制[7]。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，CD147通過促進(jìn)IKK/IκB/NF-κB通路的激活抵抗TNF介導(dǎo)的細(xì)胞壞死[11]。由此可見EMMPRIN可上調(diào)NF-κB信號通路。而TLR4通路作為NF-κB信號通路的上游通路，EMMPRIN是否同時上調(diào)TLR4/NF-κB通路少有研究。

自噬作為一種保護(hù)性機(jī)制，EMMPRIN可激活下游絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)通路，其中MAPK1和MAPK14可上調(diào)細(xì)胞自噬水平[8]。同時MAPK可激活5-單磷酸激活蛋白激酶[12], 并導(dǎo)致mTOR活性降低，自噬增加[13]。研究也證實(shí)Ⅲ型PI3K/Atk/mTOR通路可正向調(diào)節(jié)自噬[14]。

據(jù)報(bào)道，巖藻糖化抗原修飾的CD147[15]及CD147核定位片段(CD147-ICD)[16]均可增強(qiáng)細(xì)胞自噬水平。上述研究雖然自噬水平上調(diào)，但是否發(fā)生過度自噬仍不清楚。

在下頜下腺炎相關(guān)研究[17]及Fujita等[18]的研究中均發(fā)現(xiàn)TLR4的激活上調(diào)自噬水平。而Qin等[19]關(guān)于大腦白質(zhì)缺血性損傷的研究發(fā)現(xiàn)，TLR基因的敲除可抑制LC3 Ⅱ及Beclin-1蛋白的上調(diào)，并增加腦白質(zhì)中p62蛋白的表達(dá)。同樣NF-κB信號通路的激活也上調(diào)細(xì)胞自噬水平，阻斷NF-κB通路后，自噬標(biāo)志Beclin1、LC3-Ⅱ同時降低、P62則大量積累[20]。說明TLR4信號通路的激活可上調(diào)自噬水平。而TLR4信號通路是否參與EMMPRIN對自噬的調(diào)節(jié)少有研究。

本實(shí)驗(yàn)通過建立巨噬細(xì)胞模型，初步探討了EMMPRIN刺激及TAK-242阻斷TLR4通路對巨噬細(xì)胞自噬的影響。EMMPRIN刺激后TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平均明顯升高，說明EMMPRIN可能正向調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB通路。而EMMPRIN刺激后，Western blot和免疫熒光檢測均發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，說明EMMPRIN可能導(dǎo)致巨噬細(xì)胞過度自噬；當(dāng)抑制TLR4通路后，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)降低，進(jìn)一步說明EMMPRIN可能通過TLR4信號通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞過度自噬。

綜上，本研究雖說明了EMMPRIN可能通過TLR-4通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞過度自噬，但有一定局限性。EMMPRIN作為大分子物質(zhì)，活性很難檢測，進(jìn)入細(xì)胞的量無法控制，且EMMPRIN下游通路眾多，刺激濃度及時間不同，激活的下游通路可能也不同，其詳細(xì)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。