谷物膳食纖維對(duì)高膽固醇飲食小鼠脂質(zhì)代謝及腸道菌群的影響

付南燕 吳正平 周林華 韓曉群 楊 婧 周智興

(宜春學(xué)院醫(yī)學(xué)院，宜春 336000)

肥胖是由能量攝入和能量消耗之間的不平衡引起的，并且是脂質(zhì)代謝破壞的危險(xiǎn)因素[1]。與脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)的代謝綜合征增加了患心血管疾病和2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。脂質(zhì)代謝紊亂包括膽固醇和甘油三酯(TG)含量異常，膽固醇代謝失常通常表現(xiàn)為總膽固醇(TC)含量增高和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量降低等。此外，膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2(SREBP-2)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)、X受體α(LXRα)和膽固醇7α-羥化酶(Cyp7a1)等均為膽固醇蓄積中的關(guān)鍵酶。代謝綜合征是一個(gè)日益嚴(yán)重的社會(huì)問題，盡管其病因?qū)W涉及遺傳和環(huán)境因素之間的復(fù)雜相互作用，但飲食被認(rèn)為是重要原因[4]。因此，開發(fā)對(duì)脂質(zhì)代謝破壞具有預(yù)防作用的食品材料引起了廣泛的關(guān)注。目前，谷物膳食纖維(DF)已被證實(shí)影響糖尿病、血脂異常、非酒精性脂肪肝疾病和心血管疾病等[5]。研究證實(shí)，每1 kg飼糧中添加5 g DF可以緩解肝臟脂質(zhì)蓄積造成的脂質(zhì)代謝紊亂[6]。已提出DF對(duì)肥胖的影響機(jī)制可能與其抑制腸道內(nèi)攝取膽固醇和膽汁重吸收有關(guān)[5]。此外，DF可以增加糞便中膽汁酸的排泄，并增強(qiáng)膽固醇到膽汁酸的轉(zhuǎn)化，可能會(huì)被結(jié)腸菌群發(fā)酵，產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFA)，提示SCFA可抑制肝膽固醇的合成[7]。大多數(shù)膳食纖維在小腸中不被消化，而是被大腸中的微生物群代謝[8]。目前尚未見DF對(duì)小鼠生長性能、血清和糞便生化指標(biāo)、膽固醇蓄積相關(guān)蛋白表達(dá)以及腸道菌群影響的報(bào)道。因此，本研究旨在評(píng)估飲食中DF對(duì)小鼠脂質(zhì)代謝指標(biāo)和膽固醇蓄積的作用，從而為其在動(dòng)物飼養(yǎng)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

嚙齒動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)配方飼糧(Research diets D10001)；45%高脂飼糧(D12451，美國Researchdiets公司)；小麥膳食纖維(山西奧特福食品科技有限公司)；TC、TG、HDL-C含量及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；總膽汁酸(TBA)含量測定試劑盒(廈門慧嘉生物科技有限公司)。

1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)與DF處理

6周齡的雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠30只(體重18～20 g)購自上海斯萊克公司[許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-002]，小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)在相對(duì)濕度(55±5)%、溫度22 ℃和12 h明暗循環(huán)的環(huán)境中。所有小鼠適應(yīng)環(huán)境1周，并根據(jù)體重隨機(jī)分為4組，分別飼喂實(shí)驗(yàn)室嚙齒動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)配方飼糧(基礎(chǔ)飼糧，對(duì)照，CO組，n=8)、基礎(chǔ)飼糧+5 g/kg DF(CO+DF組，n=8)、高脂高膽固醇飼糧(45%高脂飼糧+1%膽固醇)(HF組，n=7)及高質(zhì)高膽固醇飼糧+5 g/kg DF(HF+DF組，n=7)。試驗(yàn)期8周。飼養(yǎng)8周后收集新鮮糞便，禁食不禁水12 h后，采用含有肝素鈉的真空取血管，眼球取血，冰浴靜止2 h后4 ℃、3 000 r/min離心15 min取上清液，于-80 ℃保存待用。取血完畢后，頸椎脫臼處死小鼠，摘取肝臟，萃取肝臟中的脂肪進(jìn)行測定[9]。

1.3 血清和肝臟樣品的生化分析

分別根據(jù)試劑盒制造商的說明，使用酶標(biāo)儀M680型(美國Bio-Rad)測定血清TG、TG和TC含量以及AST和ALT活性。

1.4 糞便中TC含量的測定

取經(jīng)冷凍干燥的糞便1.00 g，加入5倍的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH=7.4)，制成勻漿液，靜止1 h，混勻后離心取上清液，按試劑盒要求測定糞便TC含量。

1.5 蛋白質(zhì)印跡

將肝臟組織樣品在蛋白酶抑制劑混合物中勻漿，使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Thermo Fisher Scientific)測定蛋白質(zhì)濃度。將等量的蛋白質(zhì)(20 μg)加載到4%～12%的鈉十二烷基的硫酸鹽(SDS)聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠上，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。用SREBP-2(ab30682，1∶1 000)、HMGR(ab174830，1∶1 000)、LXRα(ab176323，1∶2 000)、Cyp7a1(ab65596，1∶1 000)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)(ab8226，1∶5 000)(均購自Abcam)以及與微管相關(guān)的蛋白1輕鏈3-Ⅰ/-Ⅱ(LC3-Ⅰ/-Ⅱ，12741，1∶1 000)(購自Cell Signaling Technology公司)抗體在4 ℃下孵育過夜，在25 ℃下與抗兔免疫球蛋白G-辣根過氧化物酶標(biāo)記(IgG-HRP)二抗(ab6721，1∶2 000)或抗小鼠IgG-HRP二抗(ab6789，1∶5 000)孵育1 h。使用Pierce ECL Western blotting底物(Thermo Fisher Scientific)觀察信號(hào)，使用β-actin為內(nèi)參化。

1.6 SCFA定量

根據(jù)先前的研究[10]，使用氣相色譜(GC)法分析了糞便中的SCFA含量。GC儀器由GC系統(tǒng)(7890B；安捷倫科技公司)、毛細(xì)管柱DB-WAXetr(內(nèi)徑：30 m×0.25 mm，厚度：0.25 μm，安捷倫技術(shù)公司)和保護(hù)柱DB-WAXetr(內(nèi)徑：5 m×0.25 mm，厚度：0.25 μm，安捷倫科技公司)組成。

1.7 腸道菌群分析

收集糞便樣品并根據(jù)說明書使用FastPIN SPIN試劑盒(MP Biomedicals)從冷凍樣品中提取糞便DNA[11]。采用細(xì)菌16S rDNA V3～V4區(qū)通用引物(341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′；806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)通過PCR擴(kuò)增。根據(jù)制造商的說明，使用Illumina Miseq測序系統(tǒng)(Illumina)進(jìn)行測序。使用Metagenome@KIN軟件對(duì)確定的16S rDNA序列進(jìn)行同源性搜索，用于鑒定在門和屬水平的微生物[12]。此外，從分類和確定的數(shù)量中計(jì)算出門和屬水平微生物的相對(duì)豐度。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)DF與各自的對(duì)照組之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立t檢驗(yàn)，使用單因素方差分析和Tukey HSD事后檢驗(yàn)進(jìn)行各試驗(yàn)組間的分析，數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 DF對(duì)小鼠生長參數(shù)的影響

由圖1可知，CO組和CO+DF組體重在0～4周無顯著差異(P>0.05)，而CO+DF組的最終體重顯著低于CO組(P<0.05)，HF+DF組的第4周和最終體重均顯著低于HF組(P<0.05)；與CO組相比，HF組第4周和最終體重均顯著升高(P<0.05)。

與CO組相比，*表示P<0.05，與HF組相比，#表示P<0.05。下同圖。Compared with CO group, *mean P<0.05, and compared with HF group, # mean P<0.05。The same as below.

由表1可知，CO+DF組和HF+DF組攝食量與CO組和HF組相比沒有顯著差異(P>0.05)。與CO組相比，CO+DF組的攝食效率沒有顯著差異(P>0.05)，但與HF組相比，HF+DF組顯著降低(P<0.05)。CO組和CO+DF組之間的肝臟重量沒有顯著差異(P>0.05)，與HF組相比，HF+DF組中的肝臟重量和脂肪重量顯著減少(P<0.05)，與CO組相比，HF組中的肝臟重量和脂肪重量顯著增加(P<0.05)

表1 DF對(duì)小鼠生長參數(shù)的影響

2.2 DF對(duì)小鼠血清、肝臟和糞便生化指標(biāo)的影響

由表2可知，CO+DF組血清TC、TG含量及AST和ALT活性以及肝臟TC和TG含量顯著低于CO組(P<0.05)，HF+DF組顯著低于HF組(P<0.05)，與CO組相比，HF組顯著升高(P<0.05)。HF組糞便TC含量顯著高于CO組，HF+DF組顯著低于HF組(P<0.05)。所有組之間的血清TBA和總蛋白含量無顯著差異(P>0.05)。

表2 DF對(duì)小鼠血清、肝臟和糞便生化指標(biāo)的影響

2.3 DF對(duì)小鼠肝臟膽固醇和膽汁酸相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

由圖2可知，DF對(duì)肝臟SREBP-2、HMGR、LXRα、LC3-I和LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)沒有顯著影響(P>0.05)。CO+DF組肝臟Cyp7a1的蛋白表達(dá)水平顯著低于CO組(P<0.05)，但HF組和HF+DF組之間沒有顯著差異(P>0.05)。

SREBP-2：膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2 sterol regulatory element binding protein-2；HMGR：3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase；LXRα：肝臟X受體α liver X receptor α；LC3-Ⅰ：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅰ microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅰ；LC3-Ⅱ：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ；Cyp7a1：膽固醇7α-羥化酶 cholesterol 7α-hydroxylase；β-actin：β-肌動(dòng)蛋白。

2.4 DF對(duì)小鼠糞便中SCFA含量的影響

由表3可知，HF+DF組糞便SCFA和丙酸鹽含量顯著高于HF組(P<0.05)。糞便乙酸鹽含量在各組之間未觀察到顯著差異(P>0.05)。與相應(yīng)的對(duì)照組相比，CO+DF組和HF+DF組糞便丁酸鹽含量顯著增加(P<0.05)。

表3 DF對(duì)小鼠糞便中SCFA含量的影響

2.5 DF對(duì)小鼠腸道菌群的影響

由圖3可知，在門水平上，DF減少了厚壁菌門(Firmicutes)相對(duì)豐度。CO組和CO+DF組擬桿菌門(Bacteroidetes)相對(duì)豐度沒有變化，而與HF組相比，HF+DF組中Bacteroidetes相對(duì)豐度增加。與其他組相比，僅在CO+DF組中，疣微菌門(Verrucomicrobia)相對(duì)豐度有所增加。

Deferribacteres：脫鐵桿菌門；Others:其他；Proteobacteria：變形菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Anaerostipes：厭氧菌屬；Roseburia：羅氏菌屬；Bifidobacterium：雙歧桿菌屬；Coprococcus：糞球菌屬；Ruminococcus：瘤胃球菌屬；Anaerotruncus：厭氧棍狀菌屬；Desulfovibrio：脫硫弧菌屬；Alloprevotella：擬普雷沃菌屬；Clostridium：梭狀芽孢桿菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Eubacterium：真桿菌屬；Akkermansia：阿克曼菌屬；Lactococcus：乳球菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬。

在屬水平上，梭狀芽孢桿菌屬Ⅳ(ClostridiumⅣ)相對(duì)豐度沒有顯著變化(P>0.05)，而梭狀芽孢桿菌屬Ⅺ(ClostridiumⅪ)相對(duì)豐度在HF組顯著升高(P<0.05)。梭狀芽孢桿菌屬ⅪⅤa(ClostridiumⅪⅤa)相對(duì)豐度在CO+DF組和HF+DF組中增加。此外，與其他組相比，僅HF+DF組中的阿克曼菌屬(Akkermansia)相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05)。

3 討 論

膳食纖維具有多種健康特性，包括減弱血糖反應(yīng)并降低膽固醇含量，可能有助于體重控制[7]。Tucker等[13]進(jìn)行了一項(xiàng)研究調(diào)查纖維攝入量的變化是否會(huì)影響體重，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多吃膳食纖維含量高的食物可以降低體重增加的風(fēng)險(xiǎn)。同樣，張薇等[6]在小鼠試驗(yàn)中提示DF顯著降低脂代謝紊亂小鼠的體重、血脂、血糖及肝組織TG含量。本試驗(yàn)結(jié)果與張薇等[6]的結(jié)果相似，其還報(bào)道了小鼠在正常飲食條件下飼喂DF減少了體重增加，提示DF可能通過降低正常飲食和高膽固醇飲食喂養(yǎng)的小鼠脂肪組織重量來降低體重。飲食中膳食纖維防止膽固醇飼喂動(dòng)物的血清TC含量升高[6]，而血清ALT活性升高表明肝損傷的誘導(dǎo)。據(jù)報(bào)道，水溶性膳食纖維消除小鼠血清AST和ALT活性的升高[14]，這些結(jié)果與本研究結(jié)果類似。在整個(gè)試驗(yàn)過程中監(jiān)測了所有小鼠的健康狀況，沒有腹瀉或行為異常的跡象。此外，本研究提示飲食中的DF可以降低肝臟和血清TG的含量。

已提出DF對(duì)肥胖的影響機(jī)制可能與其抑制腸道內(nèi)攝取膽固醇和膽汁酸(BA)吸收有關(guān)[5]。通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子SREBP-2的活性可能可以維持肝臟膽固醇含量，從而調(diào)節(jié)HMGR蛋白表達(dá)，SREBP-2和自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)也呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[15]。此外，LXRα是核受體，調(diào)節(jié)Cyp7a1的蛋白表達(dá)，而Cyp7a1是BA合成的限速酶。先前的研究表明，攝入燕麥膳食纖維會(huì)增加小鼠的小腸組織LXR-α的蛋白表達(dá)[16]，但在本研究中DF對(duì)LXR-α的蛋白表達(dá)無顯著影響，但Cyp7a1的蛋白表達(dá)顯著降低，說明LXR-α還受其他因素的影響。

飲食對(duì)腸道菌群的組成、多樣性和豐富度有重大影響，膳食纖維是盲腸和結(jié)腸菌群的重要能源，通過提供微生物生長的底物來改變腸道的生態(tài)環(huán)境[17]。一些腸道細(xì)菌控制宿主的能量代謝，在遺傳性或飲食誘發(fā)性肥胖的動(dòng)物中，F(xiàn)irmicutes/Bacteroides比例較高[18]。先前發(fā)現(xiàn)，各種膳食纖維材料在肥胖的試驗(yàn)動(dòng)物模型中降低了這一比例[19]。與此一致，本研究中，DF減少Firmicutes相對(duì)豐度，增加Bacteroides相對(duì)豐度。此外，Bacteroides(ClostridiumⅪ和ⅪⅤa和Bacteroidetesfragilis)負(fù)責(zé)初級(jí)膽汁的脫氫，從而導(dǎo)致了次級(jí)BA的產(chǎn)生[20]。本研究中HF+DF組的ClostridiumⅪ和ⅪⅤa相對(duì)豐度是HF組的0.4倍，表明其存在可能有助于次級(jí)BA產(chǎn)生的腸道菌群。腸道菌群可產(chǎn)生SCFA并對(duì)宿主有益，SCFA在維持健康、能量代謝和預(yù)防某些疾病中起著重要的作用。由纖維產(chǎn)生的SCFA可能可以預(yù)防飲食引起的肥胖癥并改善能量穩(wěn)態(tài)，腸道中纖維的微生物發(fā)酵主要SCFA產(chǎn)物為乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽，其中，丙酸鹽對(duì)膽固醇的合成具有抑制作用[21]。膳食纖維攝入量低不僅會(huì)導(dǎo)致微生物多樣性降低和SCFA產(chǎn)生，還不利于腸道微生物的新陳代謝。盡管DF促進(jìn)了糞便中的丙酸鹽的產(chǎn)生，但DF未能抑制膽固醇的積累和小鼠膽固醇合成中涉及的蛋白表達(dá)。因此，本研究提示丙酸鹽含量的上調(diào)可能不足以降低膽固醇的合成。據(jù)報(bào)道，ClostridiumⅪ和ⅪⅤa屬厚壁菌門，產(chǎn)生丁酸鹽，并有助于維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)。在本研究中，飲食中的DF增加了ClostridiumⅪ和ⅪⅤa的相對(duì)豐度，提示它們部分促進(jìn)了丁酸鹽的增加。一項(xiàng)研究表明，攝入膳食纖維會(huì)增加動(dòng)物盲腸和糞便中的丁酸鹽含量。在Akkermansia中，Akkermansiamuciniphila是唯一存在的腸道細(xì)菌，它使用黏蛋白產(chǎn)生乙酸鹽和丙酸鹽[22]。有報(bào)道認(rèn)為，將乙酸鹽轉(zhuǎn)化為丁酸鹽的腸道細(xì)菌是糞便中SCFA含量升高的原因之一，由于丁酸鹽可抑制炎癥[23]，DF可能是因SCFA含量上調(diào)而引起次級(jí)BA減少，進(jìn)而改變腸道菌群組成的食品材料。

4 結(jié) 論

每千克飼糧添加5g DF，可降低飼喂含脂45%飼糧小鼠的體重和肝臟脂肪含量，降低血清TC、TG含量及AST和ALT活性以及肝臟TC和TG含量，降低膽固醇合成相關(guān)蛋白Cyp7a1的表達(dá)水平，提高總SCFA含量、腸道有益菌群和優(yōu)勢菌群相對(duì)豐度。