飼糧添加地衣芽孢桿菌對(duì)4～7月齡黑毛驢生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)及直腸菌群多樣性的影響

司華哲 馮培祥 王 卓 南韋肖 金春愛(ài) 姜桂苗 趙付偉 李光玉 劉晗璐*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112；2.國(guó)家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，東阿阿膠股份有限公司，東阿 252201)

我國(guó)的毛驢養(yǎng)殖歷史悠久，存欄量曾長(zhǎng)期居于世界首位[1]。但隨著農(nóng)業(yè)機(jī)械化的程度不斷提高，毛驢役用價(jià)值的喪失導(dǎo)致其存欄量不斷下降，據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局《2018年中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒》顯示，從1998年到2016年，我國(guó)毛驢存欄量從955.8萬(wàn)頭持續(xù)下降至259.3萬(wàn)頭，以年均6.5%的速度在不斷萎縮。近年來(lái)，隨著全民保健意識(shí)的增強(qiáng)，毛驢的皮、肉和奶的商用化價(jià)值持續(xù)走高，供需矛盾進(jìn)一步加劇[2]。對(duì)比傳統(tǒng)的養(yǎng)殖，規(guī)?；B(yǎng)殖可更好地滿足原料品質(zhì)的均一性，但同時(shí)也加大毛驢感染性或傳染性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。一個(gè)基于49個(gè)規(guī)?；H場(chǎng)腹瀉病的調(diào)查顯示，驢駒腹瀉的發(fā)病率約為23.1%[4]，而幼齡驢駒免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，常規(guī)的抗生素治療對(duì)驢駒腹瀉治療效果甚微[5]。目前，微生態(tài)制劑作為一種潛在的抗生素替代品受到愈來(lái)愈多的飼料企業(yè)和養(yǎng)殖戶的關(guān)注，微生態(tài)制劑不僅可以提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，且對(duì)維持動(dòng)物腸道菌群平衡效果良好[6-7]。目前研究以豬、雞等單胃動(dòng)物或牛、羊等反芻動(dòng)物居多[8-10]，但在毛驢上的相關(guān)研究較少。我國(guó)已將地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)納入《中國(guó)飼料添加劑品種目錄(2013)》中，地衣芽孢桿菌可以分泌多種淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶，這些酶可將宿主自身難以消化的飼料成分分解，再次被宿主吸收利用，提高動(dòng)物飼糧利用率[11-12]。地衣芽孢桿菌在豬、家禽及水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖上已廣泛應(yīng)用。李寧等[13]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.15%的地衣芽孢桿菌可提高仔豬的抗氧化能力、免疫力和生長(zhǎng)性能。袁慧坤[14]在北京鴨上同樣發(fā)現(xiàn)飼糧添加1×106CFU/g地衣芽孢桿菌可有效改善北京鴨的生長(zhǎng)性能和免疫指標(biāo)。楊帆[15]和李曉斌[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1×109CFU/g枯草芽孢桿菌可顯著提高馬駒的體增重。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼糧添加地衣芽孢桿菌對(duì)黑毛驢生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)及直腸菌群多樣性的影響，以期為地衣芽孢桿菌在驢駒生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種

試驗(yàn)用地衣芽孢桿菌是本實(shí)驗(yàn)室前期從健康成年驢盲腸中分離鑒定保藏的。經(jīng)凍干后，復(fù)蘇并使用MRS培養(yǎng)基計(jì)數(shù)，按1×109CFU/g添加量(參考楊帆[15]和李曉斌[16]在馬駒上的試驗(yàn)結(jié)果)逐級(jí)稀釋到精料補(bǔ)充料中。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

選取4～7月齡體況良好的雌性驢駒10頭，平均體重(111.80±15.69)kg，隨機(jī)分為2組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中添加1×109CFU/g地衣芽孢桿菌。預(yù)試期7 d，正試期60 d。

本研究動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)于2018年10月10日至2018年12月10日山東省聊城市東阿縣黑毛驢繁育中心進(jìn)行。每頭每天10：00和16：30各飼喂1次，先精后粗，精料補(bǔ)充料添加量固定為初始體重的1.3%，粗飼料自由采食，自由飲水。精料補(bǔ)充料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。粗飼料為豆秸，其營(yíng)養(yǎng)水平為：粗蛋白質(zhì)(CP)8.75%，粗脂肪(EE)1.17%，有機(jī)物(OM)90.03%，中性洗滌纖維(NDF)72.75%，酸性洗滌纖維(ADF)54.63%，鈣(Ca)1.26%，磷(P)0.17%，消化能7.61 MJ/kg[消化能計(jì)算參照NRC(2007)[17]馬營(yíng)養(yǎng)需要]。

表1 精料補(bǔ)充料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 樣品采集

試驗(yàn)第45天，晨飼前麻醉動(dòng)物，頸靜脈采血10 mL，3 500×g、4 ℃離心10 min，收集血清，-20 ℃保存，用于后續(xù)血清相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。試驗(yàn)第50天，通過(guò)直腸采集內(nèi)容物5 g用于微生物總DNA的提取。試驗(yàn)樣品的檢測(cè)在吉林省長(zhǎng)春市中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所進(jìn)行

1.4 指標(biāo)的測(cè)定及方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能的測(cè)定

試驗(yàn)第1、15、30、45、60天晨飼前稱量動(dòng)物體重，計(jì)算平均日增重(average daily gain，ADG)和總增重(total weight gain，TWG)。每隔3 d對(duì)每頭驢精飼料補(bǔ)充料和粗飼料的投食量和剩食量進(jìn)行記錄，用于精確計(jì)算試驗(yàn)期間每頭驢的干物質(zhì)采食量(dry matter intake，DMI)和料重比(feed/gain，F(xiàn)/G)。

1.4.2 飼糧營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

飼糧的干物質(zhì)(DM)含量采用GB/T 6435—2014方法測(cè)定；粗蛋白質(zhì)含量參照GB/T 6432—2018采用凱氏定氮法測(cè)定；粗脂肪含量參照GB/T 6433—2006采用索氏抽提法測(cè)定；中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量參照GB/T 20806—2006采用范氏(Van Soest)纖維分析法測(cè)定；鈣含量參照GB/T 6436—2018采用乙二胺四乙酸(EDTA)絡(luò)合滴定法測(cè)定；磷含量參照GB/T 6437—2018采用釩鉬酸銨比色法測(cè)定。

血清甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、葡萄糖(glucose，GLU)、尿素(urea，UREA)、總蛋白(total proteins，TP)、白蛋白(albumin，ALB)含量及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspertate aminotransferase，AST)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性均使用Beckman AU 480全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，試劑盒采購(gòu)于中生北控生物科技有限公司。球蛋白(globulin，GLOB)含量采用TP與ALB含量的差值表示。血清免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)和免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)含量均使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)測(cè)定。

1.4.4 微生物總DNA的提取

直腸內(nèi)容物使用Fast DNA spin kit for feces試劑盒[安諾倫(北京)生物科技有限公司]進(jìn)行微生物總DNA提取。提取后的DNA送到北京諾禾致源公司使用MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)細(xì)菌基因組的16S rRNA V3～V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2013整理后采用SPSS 22.0軟件中獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(independent-samplesttest)進(jìn)行均值的差異性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著。微生物測(cè)序結(jié)果通過(guò)Flash v1.3.0軟件融合雙末端序列。采用Prinseq-lite 0.19.5軟件截掉質(zhì)量低的數(shù)據(jù)，按照97%相似性將序列聚類操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)。OTU聚類采用的軟件為Uclust v1.1.579，采用RDP classifier軟件進(jìn)行物種分類。使用QIIME 1.9.0軟件對(duì)菌群進(jìn)行α多樣性分析、主坐標(biāo)分析(PCoA)和Adonis分析[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加地衣芽孢桿菌對(duì)黑毛驢生長(zhǎng)性能影響

如表2所示，對(duì)照組和試驗(yàn)組第15、30、45和60天體重均無(wú)顯著差異(P>0.05)，對(duì)照組和試驗(yàn)組的總增重、平均日增重、干物質(zhì)采食量和料重比也無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 飼糧添加地衣芽孢桿菌對(duì)黑毛驢生長(zhǎng)性能影響

2.2 飼糧添加地衣芽孢桿菌對(duì)黑毛驢血清生化指標(biāo)的影響

如表3所示，對(duì)照組的血清ALB含量顯著高于試驗(yàn)組(P<0.05)，對(duì)照組和試驗(yàn)組的血清TP和GLOB含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。對(duì)照組和試驗(yàn)組的肝功相關(guān)指標(biāo)(血清ALP、ALT、AST、LDH活性)和脂肪代謝相關(guān)指標(biāo)(血清TG、HDL-C、LDL-C、TC含量)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)組的血清GLU和UREA含量較對(duì)照組有所降低，但無(wú)顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)組的血清IgG含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，對(duì)照組和試驗(yàn)組的血清IgA和IgM含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 飼糧添加地衣芽孢桿菌對(duì)黑毛驢血清生化指標(biāo)影響

2.3 飼糧添加地衣芽孢桿菌對(duì)黑毛驢直腸菌群多樣性的影響

如表4所示，對(duì)照組和試驗(yàn)組的覆蓋度指數(shù)均高于0.995，說(shuō)明測(cè)序深度足夠，結(jié)果可呈現(xiàn)99.5%以上的菌群組成。試驗(yàn)組的香農(nóng)(Shannon)和辛普森(Simpson)指數(shù)均高于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)。對(duì)照組的Chao1和ACE指數(shù)均高于試驗(yàn)組，但差異不顯著(P>0.05)。這表明飼糧添加地衣芽孢桿菌對(duì)黑毛驢直腸內(nèi)容物菌群α多樣性無(wú)顯著影響。

表4 飼糧添加地衣芽孢桿菌對(duì)黑毛驢直腸內(nèi)容物菌群α多樣性的影響

飼糧添加地衣芽孢桿菌對(duì)黑毛驢直腸微生物組成門(mén)水平相對(duì)豐度的影響如圖1所示，2組中相對(duì)豐度較高的前3種細(xì)菌門(mén)分別為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)。其中，試驗(yàn)組的擬桿菌門(mén)和螺旋體門(mén)相對(duì)豐度明顯高于對(duì)照組，而對(duì)照組中2個(gè)重復(fù)的變形菌門(mén)相對(duì)豐度高達(dá)36.46%～48.45%，這表明飼糧添加地衣芽孢桿菌會(huì)提高黑毛驢的擬桿菌門(mén)和螺旋體門(mén)相對(duì)豐度，可能會(huì)抑制變形菌門(mén)相對(duì)豐度。

Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅰ3、Ⅰ4、Ⅰ5為對(duì)照組的5個(gè)重復(fù)，Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ5為試驗(yàn)組的5個(gè)重復(fù)。圖2同。

飼糧添加地衣芽孢桿菌對(duì)黑毛驢直腸微生物組成屬水平相對(duì)豐度的影響如圖2所示，對(duì)照組中的變形菌門(mén)相對(duì)豐度較高的2個(gè)重復(fù)，其不動(dòng)桿菌屬相對(duì)豐度亦較高，達(dá)34.35%～48.12%。2組中其他相對(duì)豐度較高的細(xì)菌分別為土壤芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、未鑒定梭菌目、未鑒定瘤胃球菌科。

圖2 屬水平相對(duì)豐度

如圖3所示，PCoA顯示，2個(gè)坐標(biāo)軸相加已解釋77.75%的變量組成。結(jié)合圖中所示和Adonis分析結(jié)果(P=0.078)，均表明飼糧添加地衣芽孢桿菌對(duì)黑毛驢直腸內(nèi)容物細(xì)菌組成無(wú)顯著影響。

圖3 主坐標(biāo)分析圖

3 討 論

本試驗(yàn)中，飼糧添加1×109CFU/g地衣芽孢桿菌對(duì)黑毛驢生長(zhǎng)性能并無(wú)顯著影響，這與楊帆[15]、李曉斌[16]在馬駒上的研究結(jié)果并不一致，原因可能是本試驗(yàn)養(yǎng)殖試驗(yàn)處于冬季，黑毛驢飼養(yǎng)于室外，溫度較低。研究發(fā)現(xiàn)，冷應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的降低[19]，且低溫環(huán)境下動(dòng)物采食的飼糧優(yōu)先用于產(chǎn)熱維持體溫，這對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能影響較大[20]。綜合前人和本試驗(yàn)研究結(jié)果，低溫環(huán)境飼養(yǎng)下的黑毛驢，益生菌的添加水平需要增高，才可獲得與常溫條件相似的促生長(zhǎng)性能，但這一推測(cè)仍需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組的血清IgG含量顯著高于對(duì)照組，這與郭軍蕊[21]、Elzey等[22]在其他動(dòng)物上的試驗(yàn)結(jié)果一致。IgG約占血清免疫球蛋白總含量的75%，是機(jī)體最主要的抗感染球蛋白，其含量可以表示免疫功能的強(qiáng)弱[14]，這一指標(biāo)的升高可為地衣芽孢桿菌對(duì)驢駒腹瀉的預(yù)防起到重要作用。

已有大量研究證明添加益生菌可以改善動(dòng)物腸道菌群組成及促進(jìn)腸道健康[23-25]。本試驗(yàn)中，黑毛驢直腸內(nèi)容物門(mén)水平下優(yōu)勢(shì)細(xì)菌組成與Liu等[26]在驢糞便中的研究結(jié)果類似。但Liu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌屬水平上優(yōu)勢(shì)微生物分別是艾克曼菌屬、Sporobacter和密螺旋體屬，這與本試驗(yàn)結(jié)果并不一致。原因可能是Liu等[26]試驗(yàn)采集的是排出的糞便，與本試驗(yàn)直腸采集的內(nèi)容物環(huán)境有一定差異，此外，動(dòng)物的飼糧和養(yǎng)殖環(huán)境均會(huì)對(duì)直腸微生物組成造成影響[27]。本試驗(yàn)中，優(yōu)勢(shì)的微生物菌屬有土壤芽孢桿菌和鏈球菌屬，這些細(xì)菌都被大量的發(fā)現(xiàn)于土壤與環(huán)境中[28]，直腸位于消化道末端，這為外界細(xì)菌在直腸內(nèi)的定植帶來(lái)了機(jī)會(huì)[29]。對(duì)照組2個(gè)重復(fù)的直腸內(nèi)不動(dòng)桿菌屬相對(duì)豐度較高，且不動(dòng)桿菌屬可引起動(dòng)物胃腸炎的發(fā)生[30]，試驗(yàn)組并未發(fā)現(xiàn)這樣的個(gè)體，這也從側(cè)面證明了地衣芽孢桿菌可在一定程度上維持腸道穩(wěn)態(tài)。對(duì)照組動(dòng)物直腸微生物組成中，鏈球菌屬和不動(dòng)桿菌屬相對(duì)豐度較高，這類條件致病菌的存在提示我們，驢駒的規(guī)?；曫B(yǎng)所面臨的腹瀉疾病與動(dòng)物腸道健康息息相關(guān)。飼糧添加地衣芽孢桿菌提高了擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度，擬桿菌門(mén)的細(xì)菌主要對(duì)類固醇、膽汁酸及多糖起代謝作用，從而促進(jìn)多糖的吸收以及蛋白質(zhì)的合成[31]。飼糧添加地衣芽孢桿菌并未顯著改變黑毛驢直腸微生物組成，Zhou等[32]和Wang等[33]在獺兔上研究均發(fā)現(xiàn)，益生菌的添加對(duì)其小腸菌群結(jié)構(gòu)組成的影響效果優(yōu)于大腸。這可能與單胃草食類動(dòng)物發(fā)達(dá)的盲腸和結(jié)腸結(jié)構(gòu)與豐富的微生物組成有關(guān)。

4 結(jié) 論

飼糧添加地衣芽孢桿菌并未顯著提高黑毛驢的生長(zhǎng)性能和顯著影響黑毛驢直腸細(xì)菌組成，但提高了黑毛驢血清IgG的含量，同時(shí)降低其直腸內(nèi)容物中不動(dòng)桿菌屬相對(duì)豐度，對(duì)動(dòng)物的腸道健康有積極作用。