妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶血管生成相關(guān)基因表達(dá)的影響

彭思嘉 李鶴瓊 羅海玲 王 波 李 貞 王月君

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193)

胎兒生長發(fā)育的營養(yǎng)完全來自于母體，妊娠期母體營養(yǎng)不足會嚴(yán)重影響胎兒生長，多胎品種因胎兒數(shù)量的增加更易出現(xiàn)這一情況。湖羊作為我國特有的綿羊品種，具有早熟、多胎、早期生長快等特點。有研究表明，在湖羊妊娠后期持續(xù)供應(yīng)全價營養(yǎng)有利于胎兒的指數(shù)級生長[1]；綿羊在妊娠后期限飼，營養(yǎng)水平越低，胎兒受限越嚴(yán)重[2]。因此，保證妊娠期母體營養(yǎng)充足可以減少母體和胎兒出現(xiàn)不利情況，合理利用母畜生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)后代，提高生產(chǎn)效率。

葉酸參與核酸和蛋白質(zhì)的合成，在細(xì)胞分裂過程中起重要作用，也是胎盤發(fā)育、血管生成的必需條件[3]。葉酸可以通過減少胚胎死亡而提高動物的繁殖能力，對豬和綿羊等多胎動物的胚胎存活和胎兒發(fā)育至關(guān)重要[4-6]，不足時可能引發(fā)心血管疾病[4,7]。綿羊血清葉酸含量在妊娠期間呈先下降后上升的趨勢，并且這一現(xiàn)象在高產(chǎn)品種中更為明顯[6]。隨著飼養(yǎng)集約化程度的提高，飼糧的變化會影響動物的生長，因此推測高產(chǎn)母羊在妊娠期間對葉酸的需求量可能會增加，無法完全通過飼糧和瘤胃微生物合成來滿足。

胎盤作為妊娠期母體和胎兒之間運輸營養(yǎng)物質(zhì)、氣體和代謝產(chǎn)物的器官，其血管發(fā)育與胎盤本身的生長以及胎盤功能正常發(fā)揮都密切相關(guān)，這對胎兒正常生長和初生重至關(guān)重要[3,8-11]。胎盤血管功能不全是胎兒生長受限最常見的病因之一[12]，甚至引發(fā)胎兒或母體出現(xiàn)如宮內(nèi)生長受限、妊娠高血壓、子癇前期、流產(chǎn)、早產(chǎn)或死胎等現(xiàn)象[8]。

本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)，妊娠母羊飼糧添加過瘤胃葉酸可以顯著增加新生羔羊的初生重，提高促進(jìn)肌肉發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，降低抑制肌肉發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，并提高免疫力[13-14]；還能優(yōu)化新生羔羊小腸發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，使新生羔羊小腸發(fā)育獲得先天優(yōu)勢[15]，并且三羔較雙羔對母體葉酸添加更敏感。因為胎兒獲得的營養(yǎng)全部由胎盤通過血管運輸，推測葉酸可能通過影響胎盤發(fā)育和臍帶血管生成相關(guān)基因[血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)[12,16-17]、轉(zhuǎn)換生長因子-β3(transforming growth factor-beta 3，TGF-β3)[18-22]、血管生成素-1(angiopoietin-1，ANGPT-1)[8,23-24]]以及臍帶血管內(nèi)皮生長因子受體基因[血管內(nèi)皮生長因子受體-1(fms related tyrosine kinase-1，F(xiàn)LT-1)、血管內(nèi)皮生長因子受體-2(kinase-inserted domain containing receptor，KDR)[25-27]]等參與調(diào)控血管生成的關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的運輸和供給差異，最終影響不同出生類型新生羔羊的初生重。因此，本試驗旨在研究妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶血管生成相關(guān)基因VEGFA、TGF-β3、ANGPT-1、FLT-1和KDR表達(dá)的影響，為妊娠母羊飼糧添加葉酸影響不同出生類型新生羔羊臍帶血管生成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及飼糧

試驗于2017年5—12月在江蘇省乾寶牧業(yè)有限公司進(jìn)行，提前對羊舍消毒。選用體重相近、年齡一致的經(jīng)產(chǎn)湖羊母羊120只，人工授精后隨機(jī)分為3組，分別飼喂添加0(C)、16(F16)和32 mg/kg DM(F32)葉酸的全混合日糧(TMR)。母羊分娩時記錄窩產(chǎn)仔數(shù)，從試驗中淘汰單胎和四胎出生的羔羊，選擇體重相近的新生羔羊根據(jù)出生類型和妊娠母羊葉酸添加水平分為6個組。試驗設(shè)計見表1。

表1 試驗設(shè)計

試驗使用的葉酸為包被葉酸，經(jīng)前期綿羊瘤胃瘺管半體內(nèi)試驗測得瘤胃通過率約為92.60%，小腸釋放率約為85.59%。試驗羊單欄飼養(yǎng)，每天07:00和17:00飼喂飼糧，自由飲水。試驗飼糧參照NRC(2007)配制，母羊妊娠前期和后期的TMR組成及營養(yǎng)水平如表2、表3所示。

表3 母羊妊娠后期TMR組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 樣品采集

母羊分娩后，收集胎盤，測量并記錄胎盤重量、子葉數(shù)；用生理鹽水去除胎盤血漬，剝離胎盤子葉，經(jīng)生理鹽水清洗后，保存胎盤樣品于液氮中，收集新生羔羊胎兒端臍帶樣品保存于液氮中，從6個組中每組隨機(jī)選取3個樣品，共18個臍帶樣品進(jìn)行后續(xù)測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA提取及cDNA合成

選用北京艾德萊生物科技有限公司的EASYspin纖維類組織RNA快速提取試劑盒(RN44)提取臍帶總RNA，使用微量核酸蛋白檢測儀NanoDrop2000分光光度計(Thermo Fisher，美國)測定RNA的濃度和純度并用瓊脂糖凝膠電泳檢驗其質(zhì)量。對提取的總RNA選用諾唯贊生物的HiScript III 1st Strand Cdna Synthesis Kit試劑盒(R312-01)，建立20 μL、500 ng體系反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，于-20 ℃保存。

1.3.2 血管生成相關(guān)基因的引物設(shè)計及實時熒光定量PCR檢測

參考文獻(xiàn)[18,28-29]及NCBI設(shè)計目標(biāo)基因引物序列，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，委托北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行引物合成，目標(biāo)基因引物序列信息如表4所示。

表4 引物序列信息

使用LineGene 964 BIOER熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(杭州博日科技有限公司)進(jìn)行實時熒光定量PCR，選用天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal熒光定量預(yù)混試劑(SYBR Green，F(xiàn)P205)，建立20 μL反應(yīng)體系，包括：10 μL 2×SuperReal PreMix Plus，正向、反向引物各0.6 μL，1 μL cDNA模板，RNase free ddH2O補齊至20 μL。采用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)，收集熒光信號。

試驗中每個模板每個基因做3個技術(shù)重復(fù)，結(jié)果取平均值，采用相對定量法分析數(shù)據(jù)，采用2-△△Ct法[30-31]計算目的基因在樣本中的相對表達(dá)水平，其中：

△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)-(Ct目的基因平均值-Ct內(nèi)參基因平均值)。

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用Excel 2016整理相關(guān)數(shù)據(jù)，導(dǎo)入SPSS 21.0軟件，用GLM進(jìn)行主效應(yīng)(出生類型和葉酸添加水平)分析，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗，結(jié)果以平均值表示。使用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊胎盤發(fā)育的影響

如表5所示，妊娠母羊飼糧添加葉酸對胎盤重、子葉數(shù)、胎盤效率均無顯著影響(P>0.05)。

表5 妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊胎盤發(fā)育的影響

2.2 妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶血管生成相關(guān)基因表達(dá)的影響

如表6所示，妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶VEGFA基因的相對表達(dá)水平有顯著影響(P<0.05)，但對TGF-β3、ANGPT-1基因的相對表達(dá)水平無顯著影響(P>0.05)。0 mg/kg DM葉酸添加水平組的新生羔羊臍帶VEGFA基因的相對表達(dá)水平顯著低于16、32 mg/kg DM葉酸添加水平組(P<0.05)。三羔組的新生羔羊臍帶ANGPT-1基因的相對表達(dá)水平顯著高于雙羔組(P<0.05)。各基因的相對表達(dá)水平分析中，妊娠母羊飼糧葉酸添加水平和出生類型交互作用不顯著(P>0.05)。

表6 妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶血管生成相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.3 妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶血管內(nèi)皮生長因子受體基因表達(dá)的影響

如表7所示，妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶FLT-1、KDR基因的相對表達(dá)水平無顯著影響(P>0.05)。各基因的相對表達(dá)水平分析中，妊娠母羊飼糧葉酸添加水平和出生類型交互作用不顯著(P>0.05)。

表7 妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶血管內(nèi)皮生長因子受體基因表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 妊娠母羊飼糧添加葉酸對胎盤發(fā)育的影響

胎盤重指在分娩結(jié)束后排出的胎盤重量，子葉數(shù)指胎盤上的子葉個數(shù)[32]，胎盤效率這一概念由Wilson等[33]首次在豬上提出，即初生窩重與胎盤重的比值，被認(rèn)為是子宮容量的指標(biāo)。對豬[34]、薩?？搜騕35]的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，窩產(chǎn)仔數(shù)與胎盤效率密切相關(guān)，且產(chǎn)仔數(shù)越多胎盤效率越高。但也有研究表明，隨著產(chǎn)仔數(shù)的增加，綿羊的胎盤效率顯著降低[36]。前期研究發(fā)現(xiàn)，妊娠母羊飼糧添加葉酸可以顯著增加新生羔羊初生重[13-14]，但在本試驗中，妊娠母羊飼糧葉酸添加水平和出生類型對胎盤重、子葉數(shù)、胎盤效率均無顯著影響，這可能是由于物種或品種差異造成的研究結(jié)果不統(tǒng)一，還需要進(jìn)一步研究。雖然各組胎盤重均值不同，但胎盤的發(fā)育程度是有限的，而湖羊相比薩福克羊體型較小，體重較輕，胎盤的生長發(fā)育可能不會隨著胎兒數(shù)增多而持續(xù)增長。

3.2 妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶血管生成相關(guān)基因表達(dá)的影響

血管內(nèi)皮生長因子促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和遷移，主要調(diào)控血管生成，妊娠期間由胎盤組織產(chǎn)生并參與血管生成[16]。其中VEGFA作為血管形成和功能的主要調(diào)節(jié)因子，在血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞生長中起作用，能誘導(dǎo)血管通透性等，在胚胎發(fā)育過程不可或缺[12]。比如在兔后肢缺血模型中，添加VEGFA能通過促進(jìn)血管生成刺激血流灌注[37]；向糖尿病大鼠胚胎添加葉酸，檢測到VEGFA基因的相對表達(dá)水平增加，促進(jìn)血管生成以及血管形態(tài)正?；痆17]；而在宮內(nèi)生長遲緩豬胎盤中，VEGF基因的相對表達(dá)水平顯著降低[38]。這說明組織中VEGFA基因的相對表達(dá)水平增加可以促進(jìn)血管生成，發(fā)生在胎盤中時可能影響營養(yǎng)運輸。本試驗中，妊娠母羊飼糧添加葉酸顯著提高了VEGFA基因的相對表達(dá)水平，說明妊娠母羊補充葉酸可以可能促進(jìn)了臍帶血管生成，影響母體和胎兒間的營養(yǎng)物質(zhì)運輸。

TGF-β3同樣具有調(diào)節(jié)血管系統(tǒng)的作用，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長過程和血管生成，是重要的內(nèi)源性微血管生成調(diào)節(jié)因子[19]。在人和小鼠上的研究表明，TGF-β缺失時可能因為血管缺陷而具有胚胎致死性[20]。向體外培養(yǎng)牛和大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中添加TGF-β3時，可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成[21]；在大鼠的脂肪干細(xì)胞和卵巢的自體移植中，檢測到TGF-β3基因的相對表達(dá)水平上升，血管密度增加[18,22]。但本試驗中，妊娠母羊飼糧添加葉酸和出生類型對TGF-β3基因的相對表達(dá)水平均無顯著影響，可能由于體內(nèi)試驗與細(xì)胞試驗的內(nèi)環(huán)境存在較大差異造成的。

ANGPT-1可以與血管內(nèi)皮生長因子協(xié)同作用并增強其作用，誘導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)育健全和穩(wěn)定進(jìn)行血管生成[23]。ANGPT-1對脈管系統(tǒng)成熟和重塑非常重要，缺乏時會引發(fā)功能不全[24]，胚胎缺乏ANGPT-1表現(xiàn)出心血管缺陷并在妊娠中期死亡[8]。ANGPT-1和血管生成素-2(angiopoietin-2，ANGPT-2)都是在胎盤中表達(dá)的血管生成生長因子，它們競爭相同受體——內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞特異性酪氨酸激酶受體-2(Tie-2)；前者是Tie-2受體的主要激動劑，后者則有可能是Tie-2的拮抗劑或部分激動劑[24]。本試驗中，妊娠母羊飼糧添加葉酸對ANGPT-1基因的相對表達(dá)水平無顯著影響，推測ANGPT-1會與ANGPT-2競爭Tie-2受體[23]，引起三者表達(dá)的變化，還需結(jié)合ANGPT-2和Tie-2基因的相對表達(dá)水平作進(jìn)一步研究分析；但三羔組臍帶ANGPT-1基因的相對表達(dá)水平顯著高于雙羔組，可能有利于多羔臍帶血管生成，說明不同出生類型可能影響胎盤臍帶向胎兒運輸更多營養(yǎng)物質(zhì)。

3.3 妊娠母羊飼糧添加葉酸對不同出生類型新生羔羊臍帶血管內(nèi)皮生長因子受體基因表達(dá)的影響

血管發(fā)育過程中，血管內(nèi)皮生長因子主要通過與FLT-1和KDR結(jié)合發(fā)揮生理作用[37]。FLT-1主要在胚胎發(fā)育過程中作為VEGFA功能的負(fù)調(diào)控因子，降低VEGFA對KDR的可用性，防止信號過度轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]，可溶性FLT-1可以與血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合并抑制其活性[9]。而KDR作為血管內(nèi)皮生長因子的主要受體，主要介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而提高血管通透性[25-26]，僅激活KDR就足以激活參與有絲分裂和細(xì)胞遷移的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，也可以通過封閉KDR抑制血管內(nèi)皮生長因子活性，影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖[27]。本試驗中，妊娠母羊飼糧添加葉酸和出生類型對FLT-1、KDR基因的相對表達(dá)水平均無顯著影響，與前人關(guān)于小鼠病理性血管模型中FLT-1、KDR基因的相對表達(dá)水平上調(diào)的研究結(jié)果[25]不一致，可能是因為葉酸添加水平或者物種差異引起的。但無論是雙羔還是三羔，16、32 mg/kg DM葉酸添加水平組FLT-1基因的相對表達(dá)水平與0 mg/kg DM葉酸添加水平組相比有下降的趨勢，與VEGFA基因表達(dá)的變化趨勢相反，因為FLT-1負(fù)調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子功能，推測隨著FLT-1基因的相對表達(dá)水平下降，VEGFA能更大程度上發(fā)揮其促進(jìn)血管生成的生理功能。

4 結(jié) 論

妊娠母羊飼糧添加葉酸對胎盤發(fā)育沒有顯著影響，但是顯著提高了新生羔羊臍帶VEGFA基因的相對表達(dá)水平，有利于新生羔羊臍帶血管生成。同時，新生羔羊三羔臍帶ANGPT-1基因的相對表達(dá)水平顯著高于雙羔，有利于多羔臍帶血管生成。