法舒地爾聯(lián)合過表達(dá)趨化因子受體5的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的治療作用

李艷花，閆亞平，劉曉琴，席國萍，宋國斌，肖保國，馬存根，4

1. 山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，神經(jīng)炎癥及變性疾病基礎(chǔ)與應(yīng)用研究山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大同037009；2. 陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安710062；3.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，上海200040；4.山西中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點(diǎn)研究室，神經(jīng)生物學(xué)研究中心，晉中030619

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種好發(fā)于青壯年的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）自身免疫性疾病，在我國發(fā)病率逐年提高［1］。目前大部分藥物只能暫時(shí)緩解癥狀，并不能達(dá)到治愈的目的。干細(xì)胞移植作為一項(xiàng)新的治療方法，已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)［2］。有研究［3］將過表達(dá)趨化因子受體5（C-C chemokine receptor type 5，CCR5）的神經(jīng)干細(xì)胞，通過靜脈給予實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）小鼠，發(fā)現(xiàn)CCR5能夠增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞向CNS炎癥部位遷徙的能力。盡管表達(dá)CCR5的神經(jīng)干細(xì)胞可以改善EAE的臨床癥狀，但癥狀改善程度仍不理想［3］；可能是CNS的微環(huán)境特別是炎癥細(xì)胞因子及神經(jīng)再生抑制因子的存在，影響了外源性神經(jīng)干細(xì)胞的存活、分化和內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的動(dòng)員，從而影響了療效。我們的前期研究［4］顯示，Rho激酶（Rho-kinase，ROCK）抑制劑法舒地爾（fasudil）具有減輕CNS炎癥反應(yīng)、抑制神經(jīng)再生抑制因子信號(hào)通路、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)入CNS 等作用，可提升神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)帕金森病模型小鼠的治療效果。但fasudil聯(lián)合過表達(dá)CCR5的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是否能夠提升對(duì)MS的治療效果，目前未見報(bào)道。本研究以小鼠EAE模型作為研究人類MS的動(dòng)物模型，將fasudil 作為MSCs 移植的伴侶，探討fasudil 聯(lián)合過表達(dá)CCR5 的MSCs（CCR5-MSCs）對(duì)EAE 的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白第35～55位肽片段（myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide fragment 35-55，MOG35-55；Genscript，美 國），弗 氏 完 全 佐 劑（Sigma，美國），百日咳毒素（Enzo Life Sciences，美國），包埋劑（櫻花，日本），抗神經(jīng)巢蛋白（nestin）抗體、抗神經(jīng)/膠質(zhì)抗原2（nerve/glial antigen 2，NG2）抗體、抗甘油 醛 -3- 磷 酸 脫 氨 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（Cell Signaling，美國），抗腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF） 抗體（Epitomics，美國），抗神經(jīng)營養(yǎng)因子3（neurotrophin-3，NT-3）抗體、抗神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）抗體（Abcam，美國），抗膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）抗體（Epitomics，美國），辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠、抗兔、抗大鼠二抗（Thermo Scientific，美國），熒光素（Alexa Fluor?405、Alexa Fluor?647 和Alexa Fluor?594） 標(biāo) 記 的二抗（Jackson ImmunoResearch，美國），聚偏二氟乙烯膜（Millipore，美國），脫脂奶粉（BD，美國），化學(xué)發(fā)光試劑盒（Millipore，美國），透明質(zhì)酸（Sigma，美國），fasudil（天津紅日藥業(yè)有限公司贈(zèng)送），NheⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶（Thermo Scientific，美國），慢病毒轉(zhuǎn)染試劑盒、慢病毒滴度檢測(cè)試劑盒（SBI，美國）。

1.1.2 主要儀器 低溫高速離心機(jī)（Sigma，美國），熒光顯微鏡（Olympus，日本），酶標(biāo)儀（BioTek，美國），超聲波破碎儀（Wiggens，德國），SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳及轉(zhuǎn)印裝置、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、PCR 儀、流式細(xì)胞儀（Bio-Rad，美國）。

1.1.3 動(dòng)物、菌株和細(xì)胞 8～9周齡雌性健康C57BL/6小鼠32只，體質(zhì)量18～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0008，使用許可證號(hào)SYXK（晉） 2018-0002。結(jié)核分枝桿菌H37Ra（Difco，美國），人胚腎293TN細(xì)胞（SBI，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EAE模型制備及動(dòng)物分組 所有小鼠后頸部皮下注射0.2 mL MOG35-55乳化液（包含弗氏完全佐劑100 μL、MOG35-55300 μg、滅活的結(jié)核分枝桿菌400 μg），完成免疫。免疫當(dāng)日和48 h 后，每只小鼠腹腔注射百日咳毒素250 ng。自免疫后次日開始進(jìn)行小鼠體質(zhì)量檢測(cè)和臨床癥狀評(píng)分。癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為國際通用5分評(píng)分制：0分，無癥狀；1分，尾部張力消失；2分，一側(cè)后肢無力；3分，雙后肢癱瘓；4分，被動(dòng)翻身后不能恢復(fù)；5分，瀕臨死亡或死亡。動(dòng)物飼養(yǎng)和處理符合山西大同大學(xué)動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定。

建模成功后，按體質(zhì)量將EAE 模型小鼠隨機(jī)分為EAE 模型組（腹腔注射生理鹽水）、fasudil 干預(yù)組（腹腔注射fasudil）、CCR5-MSCs 干預(yù)組（鼻腔給予CCR5-MSCs）、fasudil 聯(lián) 合CCR5-MSCs 干 預(yù) 組（鼻 腔 給 予CCR5-MSCs，并腹腔注射fasudil），每組8 只。CCR5-MSCs給予方法：在MOG35-55免疫后的第12 日，將CCR5-MSCs 干預(yù)組和fasudil 聯(lián)合CCR5-MSCs 干預(yù)組小鼠麻醉后，手持小鼠使其鼻腔與頸部連線垂直地面，每鼻孔給予3 μL 透明質(zhì)酸（含100 個(gè)活性單位）；之后緩慢給予12 μL CCR5-MSCs（細(xì)胞總數(shù)為1.5×105），期間允許小鼠主動(dòng)吸入細(xì)胞懸液。fasudil給予方法：在MOG35-55免疫后的第14～27 日，fasudil 干預(yù)組和fasudil 聯(lián)合CCR5-MSCs干預(yù)組腹腔注射fasudil 400 μg，每日1次。EAE模型組以同樣方式給予生理鹽水作為對(duì)照。

1.2.2 MSCs 獲取 將小鼠無痛斷頸處死，70%乙醇消毒，無菌條件下分離后肢，去除肌肉組織；于關(guān)節(jié)處斷開股骨，5 mL注射器吸取4 mL培養(yǎng)液，從股骨一端吹出骨髓組織，清洗2次；37 ℃、5%CO2條件下，以含2%B27無血清添加劑、20 ng/mL表皮生長因子、20 ng/mL堿性成纖維生長因子的DMEM/F-12 培養(yǎng)液培養(yǎng)。按照1×106/mL的密度將細(xì)胞種植于25 mL培養(yǎng)瓶，每4 d換液1次。2周后，獲取MSCs細(xì)胞球。細(xì)胞球經(jīng)Accutase細(xì)胞消化液消化成單細(xì)胞懸液，1︰3 稀釋傳代，每3 d 傳代1 次，直到第5～10代，細(xì)胞球被消化成單細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。

1.2.3 載體構(gòu)建及質(zhì)粒獲取 根據(jù)小鼠Ccr5 基因（NM_009917）的蛋白編碼序列（coding sequence，CDS）設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為5'-AAAGCTAGCATGGATTTTCAAGGGTCAGTTC-3'，下游引物序列為5'-AAAGCGGCCGCTCATAAACCAGTAGAAACTTCAT-3'。從反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，擴(kuò)增得到Ccr5 的CDS，通過中間載體（pGEM-T）進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。隨后通過NheⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶將Ccr5 的CDS 連入表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-cop-GFP。使用質(zhì)粒抽提試劑盒獲取高純度pCDH-CMVMCS-EF1-cop-CCR5-GFP質(zhì)粒，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 慢病毒制備及轉(zhuǎn)染 依據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，將293TN 細(xì)胞按照7×106～8×106/mL 的密度種植于15 cm 培養(yǎng)皿，培養(yǎng)18～24 h 待細(xì)胞達(dá)到60%～80%的融合度。將45 μL包裝質(zhì)?；旌弦海╬PACKH1）和4.5 μg目的質(zhì)粒加入1.0～1.6 mL 無血清DMEM 培養(yǎng)液中，混勻，再加入55 μL轉(zhuǎn)染試劑（PureFection），渦旋10 s，室溫孵育15 min。將其均勻懸滴于293TN細(xì)胞培養(yǎng)液中，混勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h 并換液。轉(zhuǎn)染后48 h 和72 h 收集上清液到50 mL無菌離心管中，3 000×g室溫離心15 min。轉(zhuǎn)移上清液到250 mL離心管中，加入1/4體積預(yù)冷的慢病毒濃縮液（PEG-it Virus Precipitation），4 ℃冰箱中放置至少12 h。1 500×g、4 ℃離心30 min，收集慢病毒顆粒沉淀；同時(shí)收集上清液，1 500×g、4 ℃離心5 min，獲得全部慢病毒顆粒沉淀。以1/100～1/10的比例重懸慢病毒沉淀于預(yù)冷的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）中，分裝后保存于-80 ℃冰箱中。使用慢病毒滴度檢測(cè)試劑盒進(jìn)行滴度測(cè)定。

將5×104MSCs 種植于24 孔板。次日，吸去培養(yǎng)液，補(bǔ)加500 μL 含2.5 μL 1×TransDux 溶液的培養(yǎng)液，按照不同感染復(fù)數(shù)加入慢病毒，以未轉(zhuǎn)染的MSCs作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染后72 h，在熒光顯微鏡下檢測(cè)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達(dá)情況。收集含有綠色熒光的細(xì)胞球，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)分析 CCR5-MSCs 細(xì)胞球經(jīng)Accutase細(xì)胞消化液消化成單細(xì)胞懸液，PBS 洗1 次，4%多聚甲醛固定10 min，之后PBS 洗1 次。加入通透液稀釋的抗nestin 抗體和抗CCR5 抗體，4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜。PBS洗1 次后，加入熒光素（Alexa Fluor?405 和Alexa Fluor?647）標(biāo)記的二抗孵育1.5 h，之后PBS 洗1 次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)nestin+CCR5+細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 脊髓組織處理 于免疫后第28 日，向小鼠腹腔注射0.2 mL 0.3%戊巴比妥鈉溶液，待成功麻醉后將其斷頸處死。經(jīng)心臟依次灌注40 mL 生理鹽水和40 mL 4%多聚甲醛，分離脊柱，去除椎骨，2%多聚甲醛室溫固定4 h。10%、20%、30%蔗糖溶液梯度脫水各4 h，包埋劑包埋組織，于液氮中快速冷凍。冷凍切片機(jī)切片，厚度為10 μm，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 固藍(lán)染色 冰凍切片經(jīng)室溫晾干后，放入固藍(lán)（luxol fast blue，LFB）染色液中，57 ℃恒溫?fù)u床溫育24 h。經(jīng)90%、70%乙醇溶液梯度復(fù)水，然后在0.05%碳酸鋰溶液和70%乙醇中反復(fù)浸泡，進(jìn)行分化。最后乙醇、50%二甲苯和100%二甲苯梯度脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察髓鞘完整性。使用Image-Pro Plus 軟件分析脫髓鞘面積和脊髓總面積，計(jì)算脫髓鞘面積占脊髓總面積的百分比。

1.2.8 免疫熒光染色 冰凍切片經(jīng)PBS浸洗，用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS 封閉。加入抗nestin 抗體、抗NG2 抗體（用含1% BSA 和0.3% Triton X-100 的PBS 稀釋），4 ℃孵育過夜。PBS 洗3 次，加入熒光素Alexa Fluor?594 標(biāo)記的二抗和DAPI 染液（1 μg/mL），室溫孵育1.5 h，PBS 洗3 次。以未加一抗的樣品作為陰性對(duì)照。50%甘油水溶液封片，熒光顯微鏡采集數(shù)據(jù)，使用Image-Pro Plus 軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。收集經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的MSCs 細(xì)胞球，使用抗CCR5 抗體和Alexa Fluor?594 標(biāo)記的二抗進(jìn)行免疫熒光染色。

1.2.9 Western blotting 小鼠新鮮脊髓組織經(jīng)超聲破碎，獲取蛋白質(zhì)溶液。蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜，封閉，抗BDNF 抗體、抗NT-3 抗體、抗NGF 抗體、抗GDNF 抗體、抗GAPDH抗體分別孵育；用含0.3% Triton X-100 的PBS 洗滌后，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色。使用ImageLab 4.0軟件分析各蛋白條帶灰度值相對(duì)于內(nèi)參GAPDH 的比值，計(jì)算各組蛋白含量相對(duì)于EAE模型組的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Graphpad Prism 5 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，定量數(shù)據(jù)采用x±s表示。臨床癥狀評(píng)分和體質(zhì)量的比較采用雙因素方差分析（two way ANOVA）；其他數(shù)據(jù)2 組間比較使用韋爾奇校正的非配對(duì)t 檢驗(yàn)，3 組或以上的比較使用Tukey多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCR5-MSCs的鑒定

熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染慢病毒的MSCs細(xì)胞球同時(shí)表達(dá)GFP蛋白和CCR5蛋白，表明轉(zhuǎn)染成功。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示nestin+CCR5+細(xì)胞數(shù)達(dá)83.5%，表明CCR5-MSCs具有神經(jīng)干細(xì)胞的特點(diǎn)（圖1）。

2.2 Fasudil聯(lián)合CCR5-MSCs對(duì)EAE臨床癥狀的緩解作用

從免疫后第18 日開始，fasudil 干預(yù)組、CCR5-MSCs干預(yù)組、fasudil聯(lián)合CCR5-MSCs 干預(yù)組EAE 臨床癥狀評(píng)分較EAE 模型組明顯降低（圖2A）。Fasudil 聯(lián)合CCR5-MSCs 干預(yù)比fasudil 或CCR5-MSCs 單獨(dú)干預(yù)能夠更加明顯地減輕EAE臨床癥狀，顯示了fasudil與CCR5-MSCs的疊加效果。MOG35-55免疫導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量下降。免疫后第22～24日，fasudil干預(yù)組和fasudil聯(lián)合CCR5-MSCs干預(yù)組小鼠體質(zhì)量有所恢復(fù)，與EAE 模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B）。在其他時(shí)間點(diǎn)各組體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 Fasudil聯(lián)合CCR5-MSCs對(duì)髓鞘的保護(hù)作用

脊髓冰凍切片LFB染色結(jié)果顯示，MOG35-55免疫導(dǎo)致明顯的脫髓鞘現(xiàn)象，fasudil 干預(yù)、CCR5-MSCs 干預(yù)、fasudil 聯(lián)合CCR5-MSCs 干預(yù)均能抑制髓鞘脫失，并且fasudil 聯(lián)合CCR5-MSCs 干預(yù)比其他單獨(dú)干預(yù)能夠更明顯地減輕脫髓鞘現(xiàn)象，顯示了fasudil 與CCR5-MSCs 疊加的髓鞘保護(hù)效果（圖3）。

圖1 表達(dá)CCR5的慢病毒在MSCs中的轉(zhuǎn)染效率Fig 1 Transfection efficiency of CCR5 lentivirus in MSCs

圖2 Fasudil聯(lián)合CCR5-MSCs對(duì)EAE臨床癥狀的影響Fig 2 Effect of fasudil combined with CCR5-MSCs on the clinical symptoms of EAE

圖3 Fasudil聯(lián)合CCR5-MSCs對(duì)脫髓鞘的抑制作用Fig 3 Inhibitory effect of fasudil combined with CCR5-MSCs on demyelination

2.4 Fasudil 聯(lián)合CCR5-MSCs 對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的動(dòng)員

脊髓冰凍切片免疫熒光染色結(jié)果顯示，在EAE 模型組、CCR5-MSCs 干預(yù)組中均沒有nestin+細(xì)胞（神經(jīng)干細(xì)胞） 和NG2+細(xì)胞（少突膠質(zhì)前體細(xì)胞） 出現(xiàn)，但在fasudil 干預(yù)組、fasudil 聯(lián)合CCR5-MSCs 干預(yù)組中出現(xiàn)大量的nestin+細(xì)胞和NG2+細(xì)胞，而且fasudil 聯(lián)合CCR5-MSCs干預(yù)組中nestin+細(xì)胞和NG2+細(xì)胞數(shù)目比單獨(dú)fasudil干預(yù)組明顯增多（圖4）。

2.5 Fasudil聯(lián)合CCR5-MSCs對(duì)髓鞘再生的促進(jìn)作用

Western blotting結(jié)果顯示，EAE模型組中神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、GDNF、NGF 和NT-3的表達(dá)量均較低，fasudil干預(yù)組中NGF 和NT-3 的表達(dá)明顯增加，CCR5-MSCs 干預(yù)組各神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)沒有明顯變化，fasudil 聯(lián)合CCR5-MSCs 干預(yù)使得BDNF、GDNF、NGF 和NT-3 的表達(dá)量明顯升高（圖5）。

3 討論

EAE 是國際上公認(rèn)的研究MS 的一種動(dòng)物模型。經(jīng)MOG35-55免疫后，小鼠脊髓組織可出現(xiàn)明顯的脫髓鞘現(xiàn)象。骨髓中存在的MSCs具有自我更新、高度增殖和多系分化能力，同時(shí)具有取材方便、可進(jìn)行自體移植、容易體 外 擴(kuò) 增 的 優(yōu) 點(diǎn)［5］。Karussis 等［6］使 用MSCs 治 療 了15 例MS 和19 例肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS），6～25個(gè)月的隨訪結(jié)果顯示MSCs能夠逃避宿主免疫應(yīng)答，到達(dá)腦膜、蛛網(wǎng)膜下腔和脊髓組織，能明顯降低臨床癥狀評(píng)分，對(duì)MS和ALS顯示出良好的治療效果，且具有較高的安全性。MSCs可能通過免疫調(diào)節(jié)作用治療EAE［7-9］。

雖然大量研究顯示MSCs治療EAE/MS 有效，但治療效果仍不夠理想。其原因可能包括：①經(jīng)靜脈注射的MSCs通過血液循環(huán)進(jìn)入并分布于全身多個(gè)器官，最終進(jìn)入CNS 所需的時(shí)間長、效率低。②EAE/MS 損傷過程中，CNS 出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和大量的神經(jīng)再生抑制因子，從而抑制了MSCs 的存活、增殖和功能發(fā)揮。因此，為提高M(jìn)SCs 移植的療效，需要綜合考慮干細(xì)胞移行、CNS 微環(huán)境等諸多因素。Yang 等［3］將表達(dá)CCR5 的慢病毒轉(zhuǎn)入神經(jīng)干細(xì)胞，然后靜脈給予EAE 小鼠，增強(qiáng)了神經(jīng)干細(xì)胞向CNS 炎癥部位遷徙的數(shù)量和速度，治療效果明顯優(yōu)于單純用神經(jīng)干細(xì)胞的對(duì)照組；該研究認(rèn)為過表達(dá)CCR5 的神經(jīng)干細(xì)胞在EAE 發(fā)病早期進(jìn)入CNS，通過其有效的免疫調(diào)節(jié)作用，減輕了CNS 的炎癥反應(yīng)，從而阻止了髓鞘和神經(jīng)元的損傷，同時(shí)也有利于髓鞘再生。另外，也有研究［10］顯示鼻腔給予成體神經(jīng)干細(xì)胞可以降低EAE 的臨床癥狀；細(xì)胞經(jīng)嗅部黏膜吸收進(jìn)入腦脊液，繞過血腦屏障直接進(jìn)入CNS，也可以通過血液循環(huán)或淋巴系統(tǒng)、三叉神經(jīng)、視神經(jīng)等間接通路進(jìn)入腦內(nèi)，有效地發(fā)揮治療作用。相較于尾靜脈、腹腔和腦立體定位注射途徑，細(xì)胞經(jīng)鼻腔途徑進(jìn)入CNS 的速度更快，數(shù)量更多，治療效果也更好［11］，因此被廣泛應(yīng)用于CNS 疾病治療的研究［12-14］。

本研究通過鼻腔途徑，將CCR5-MSCs于EAE發(fā)病初期給予小鼠，發(fā)現(xiàn)其能明顯地降低EAE的臨床癥狀評(píng)分，減少髓鞘的丟失；但是EAE 發(fā)病過程中，CNS 內(nèi)的不良微環(huán)境可能限制MSCs發(fā)揮更好的治療作用。小分子化合物干預(yù)在干細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用已成為生命科學(xué)領(lǐng)域 的 熱 點(diǎn)［12］。ROCK 抑 制 劑，如Y-27632、fasudil、pyrintegin 和thiazovivin，具有促進(jìn)干細(xì)胞增殖、存活和抑制干細(xì)胞分化的作用［12，15］。課題組前期使用fasudil 聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞治療EAE 和帕金森病模型小鼠的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)給予fasudil能明顯增加神經(jīng)干細(xì)胞在CNS內(nèi)的數(shù)量，提升神經(jīng)干細(xì)胞抗炎、抗氧化能力，從而達(dá)到良好的治療效果［4，16］。

本研究中，在給予CCR5-MSCs 之后給予fasudil，EAE 的臨床癥狀評(píng)分更低，髓鞘丟失更少。單獨(dú)給予CCR5-MSCs時(shí)內(nèi)源性nestin+和NG2+干細(xì)胞未被動(dòng)員，聯(lián)合fasudil 干預(yù)之后nestin+和NG2+干細(xì)胞動(dòng)員能力明顯強(qiáng)于單獨(dú)fasudil 干預(yù)組，說明fasudil 激發(fā)了CCR5-MSCs 的神經(jīng)干細(xì)胞動(dòng)員和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞動(dòng)員的能力。另外，單獨(dú)給予CCR5-MSCs 并沒有促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、GDNF、NGF 和NT-3 的表達(dá)，單獨(dú)給予fasudil 也僅僅增加了NGF 和NT-3 的表達(dá)，但是兩者聯(lián)合卻使得BDNF、GDNF、NGF 和NT-3 的表達(dá)量極大地提升，再次說明fasudil能明顯促進(jìn)CCR5-MSCs的神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，fasudil聯(lián)合鼻腔途徑給予過表達(dá)CCR5 的MSCs，可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和促髓鞘再生的作用，明顯提升EAE的治療效果。