蛋白質(zhì)SUMO化修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)研究述評(píng)

熊強(qiáng)強(qiáng)，屠 俊，李郡如，3，程金科，左建宏#，陳亞蘭#

1.南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究室，衡陽(yáng)421001；2.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子細(xì)胞生物學(xué)系，上海市腫瘤微環(huán)境與炎癥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200025；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院2016級(jí)臨床醫(yī)學(xué)八年制，上海200025

蛋白質(zhì)翻譯后修飾的存在極大豐富了蛋白質(zhì)的多樣性，而且為蛋白質(zhì)響應(yīng)刺激和發(fā)揮功能提供了精密的調(diào)控方式。細(xì)胞內(nèi)存在大量的磷酸化和乙酰化等化學(xué)修飾，這些修飾的供體主要是ATP 和乙酰輔酶A 等，它們是物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物；與此不同，泛素和類泛素家族屬于小分子蛋白質(zhì)，它們是由基因編碼的，并帶有特定的“使命”。目前已知，泛素化修飾與蛋白酶體降解途徑密切相關(guān)［1］，自噬相關(guān)蛋白質(zhì)12（autophagy related 12，ATG12）修飾則與自噬過程密切相關(guān)［2］。人體內(nèi)小分子泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）化修飾是由活化酶、接合酶和連接酶介導(dǎo)的，而SUMO 的成熟和去修飾過程則由6 種SUMO特異性蛋白酶（SUMO/sentrin-specific proteases，SENPs）催化完成［3］。SUMO 化修飾廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)各個(gè)組分，參與了基因表達(dá)、代謝調(diào)控、免疫應(yīng)答和腫瘤發(fā)生發(fā)展等諸多生理病理調(diào)控過程［4］，但目前對(duì)其主要“使命”尚不明確。對(duì)SUMO 化修飾蛋白質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)化鑒定和研究，有助于了解SUMO 化修飾的時(shí)空分布、響應(yīng)信號(hào)、作用機(jī)制和功能表型等，而這些都需要建立在掌握特定的SUMO 化修飾研究方法的基礎(chǔ)上。盡管SUMO 化修飾非常重要，但由于SUMO 本身的序列特征和修飾豐度問題，鑒定SUMO 化修飾位點(diǎn)一直是本領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本文對(duì)利用質(zhì)譜規(guī)?；芯坎溉閯?dòng)物中SUMO 化修飾的方法進(jìn)行總結(jié)，供開展相關(guān)研究的學(xué)者們參考。

1 SUMO化修飾的規(guī)?；b定概述

要從全局性角度觀察SUMO化修飾在特定細(xì)胞或組織中的狀態(tài)和變化，需要通過蛋白質(zhì)組學(xué)的手段規(guī)?；b定SUMO 化修飾位點(diǎn)。從2004 年到2019 年，已經(jīng)有近百篇涉及SUMO化修飾組學(xué)的文獻(xiàn)，其中大部分聚焦于哺乳動(dòng)物中的SUMO化修飾。此外，還有一些介紹植物或線蟲中的SUMO化修飾組學(xué)的研究［5-6］，在此不作討論。

在這16年的研究中，從研究成果的數(shù)量來看，2014年和2015 年的成果最多（圖1A）；從鑒定到的修飾蛋白質(zhì)和修飾位點(diǎn)來看，2017 年和2018 年的成果最豐（圖1B、C）。從總體研究趨勢(shì)來看，2004 年多篇人源細(xì)胞中SUMO 化修飾組學(xué)研究成果陸續(xù)被發(fā)表，數(shù)十個(gè)修飾蛋白質(zhì)被鑒定，但均未鑒定到修飾位點(diǎn)。2005—2008年，通過串聯(lián)親和純化技術(shù)富集SUMO 化修飾蛋白質(zhì)以及通過突變SUMO 蛋白鑒定修飾位點(diǎn)的技術(shù)路線逐步被建立［7-8］。2009—2013年，得益于細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記（stable-isotope labelling by amino acids in cell culture，SILAC）定量技術(shù)和高分辨率質(zhì)譜的廣泛應(yīng)用，SUMO化修飾組學(xué)的研究又開始逐漸增多。在此期間，研究人員針對(duì)SUMO 蛋白質(zhì)的C 端序列進(jìn)行改造，獲得了具體的修飾位點(diǎn)［9-10］。在2011 年和2013 年出現(xiàn)了針對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性SUMO 化修飾蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定的研究，但均未能鑒定到修飾位點(diǎn)［11-12］。在2014 年和2015 年，SUMO 化修飾組學(xué)的研究達(dá)到高潮，在此期間學(xué)者們對(duì)SUMO 蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行了多種改造，對(duì)富集和洗脫方法也進(jìn)行了優(yōu)化，鑒定到的修飾位點(diǎn)數(shù)目有了顯著增加。2016年出現(xiàn)了多篇綜述性論文［13-16］，但研究成果數(shù)量較少。在2017 年和2018 年，得益于SUMO 突變模式、刺激條件、富集方法、搜庫(kù)設(shè)置的成熟和Q-ExactiveTM等高性能質(zhì)譜的廣泛應(yīng)用，SUMO 化修飾蛋白質(zhì)和修飾位點(diǎn)的鑒定數(shù)目達(dá)到頂峰，且內(nèi)源性SUMO 化修飾也能鑒定出大量修飾位點(diǎn)［17］。在2019年，由于SUMO化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)相對(duì)成熟，規(guī)?；b定SUMO 化修飾蛋白質(zhì)和修飾位點(diǎn)被應(yīng)用在SUMO 化修飾的功能實(shí)驗(yàn)中［18-19］，而專門針對(duì)SUMO 化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的研究數(shù)量有所減少。下文我們主要從SUMO 蛋白質(zhì)改造和富集方法方面重點(diǎn)論述，并總結(jié)在細(xì)胞和組織水平進(jìn)行SUMO 化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究的最優(yōu)路線。

圖1 哺乳動(dòng)物中SUMO化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析Fig 1 Analysis of proteomic study on protein SUMOylation in mammals

2 通過改造SUMO以鑒定修飾位點(diǎn)

在人體中，SUMO存在5種旁系同源物［4，20-21］，研究較多 的 是SUMO1、SUMO2 和SUMO3，其 中SUMO2 和SUMO3 的成熟蛋白質(zhì)序列高度一致，難以區(qū)分，所以通常合并研究。這些SUMO的C端缺少賴氨酸或精氨酸，在經(jīng)過胰酶酶解后，SUMO1和SUMO2/3分別會(huì)在修飾底物上殘留包含19或32個(gè)氨基酸的長(zhǎng)鏈多肽，不利于質(zhì)譜鑒定修飾位點(diǎn)。因此，為方便質(zhì)譜鑒定，需要對(duì)SUMO進(jìn)行改造。目前，常用的改造模式為SUMO1-T95R［22］、SUMO2-K0Q87R［23］和SUMO3-Q87RQ88N［24］，這些突變改造都使SUMO1、SUMO2 或SUMO3 產(chǎn)生在胰酶酶解后便于質(zhì)譜鑒定的殘留序列，依次分別為GG-K、QQTGG-K 和NQTGG-K，據(jù)此可以鑒定修飾位點(diǎn)。當(dāng)谷氨酰胺在N 端時(shí)容易環(huán)化，QQTGG-K 轉(zhuǎn)變成pyroQQTGG-K［25-26］；而NQTGG-K 容易發(fā)生中性丟失產(chǎn)生TGG-K［27］，這些也是鑒定位點(diǎn)的搜庫(kù)指標(biāo)。我們注意到在這些研究工作中，SUMO1 和SUMO3 的序列計(jì)數(shù)包含了首位甲硫氨酸；而對(duì)SUMO2，研究者在計(jì)數(shù)其序列時(shí)去除了第一個(gè)甲硫氨酸，所以經(jīng)過胰酶酶解后得到的殘留肽段仍然是QQTGG。在SUMO2-K0Q87R 中，研究者們將SUMO2上所有的賴氨酸突變成了精氨酸，這樣用賴氨酸內(nèi)肽酶（Lys-C）進(jìn)行酶解后，SUMO2 不會(huì)受到任何切割，仍然保持完整性，因而可以利用其N 端帶的His tag再次純化，進(jìn)一步富集修飾肽段［23］。在SUMO3-Q87RQ88N 中，研究者將第88 位的谷氨酰胺突變成天冬氨酸，這樣可以避免N 端的谷氨酰胺在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)生改變［27］。上述突變?yōu)橘|(zhì)譜鑒定修飾位點(diǎn)提供了便利，然而由于突變位點(diǎn)靠近SUMO與靶蛋白質(zhì)的接合之處，且研究者們沒有對(duì)野生型SUMO 蛋白質(zhì)和突變型SUMO 蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合蛋白質(zhì)進(jìn)行全面細(xì)致的比較［10，23，27］，因而對(duì)于突變對(duì)SUMO本身修飾行為的影響難以進(jìn)行全面準(zhǔn)確的判定。盡管存在此類風(fēng)險(xiǎn)，但通過突變改變SUMO 的蛋白質(zhì)序列在樣品處理過程中操作便捷，鑒定位點(diǎn)的成功率高，受到大多數(shù)研究者的青睞；故此策略仍是當(dāng)前的主流研究方案。

如果不對(duì)SUMO 進(jìn)行突變，則需要引入多酶進(jìn)行酶解。例如，對(duì)于SUMO1，Cai 等［28］采用Lys-C 和谷氨酸內(nèi)肽酶（Glu-C） 酶解，得到QTGG 殘留肽段；對(duì)于SUMO2/3，Hendriks 等［17］采用Lys-C 和天冬氨酸內(nèi)肽酶（Asp-N）酶解，得到DVFQQQTGG 殘留肽段；Lumpkin等［29］采用一種野生型α 裂解蛋白酶（WaLP）在蘇氨酸的C端進(jìn)行切割，從而使SUMO1/2/3都能產(chǎn)生GG殘留肽段；不過WaLP能夠在多種氨基酸附近進(jìn)行不同程度的切割，其特異性還需要提高，產(chǎn)生結(jié)果的準(zhǔn)確性還有待驗(yàn)證。多酶酶解方案既縮短了殘留片段以便于后續(xù)質(zhì)譜鑒定修飾位點(diǎn)，又不會(huì)影響體內(nèi)SUMO 本身的修飾行為，是未來很有前景的發(fā)展方向，特別是在鑒定內(nèi)源SUMO的修飾位點(diǎn)方面。未來需要在酶的特異性、有效性和經(jīng)濟(jì)性上進(jìn)行優(yōu)化，以提高鑒定位點(diǎn)的成功率和準(zhǔn)確性。

3 通過親和純化富集修飾的蛋白質(zhì)

在2004 年開展的研究中，研究者們?cè)赟UMO 上融合不同的標(biāo)簽，對(duì)修飾蛋白質(zhì)進(jìn)行富集。有的利用His tag在變性條件下進(jìn)行富集［30］，也有的利用Myc tag 或者HA tag在非變性條件下進(jìn)行富集［31-32］。His tag與Ni的相互結(jié)合不受尿素和鹽酸胍等變性溶液的影響，利用變性溶液可以消除大量非共價(jià)相互作用，從而去掉一些SUMO 相互作用蛋白質(zhì)，得到的共價(jià)接合的修飾蛋白質(zhì)相對(duì)更多。此外，變性溶液可以在一定程度上抑制去修飾酶SENPs和其他蛋白酶，從而減少蛋白質(zhì)提取過程中SUMO 修飾蛋白質(zhì)的降解或去修飾，增加修飾蛋白質(zhì)的鑒定率。然而，利用His tag 富集修飾蛋白質(zhì)的特異性不高，這主要是由于真核生物中有較多含poly-His的蛋白質(zhì)，這些都可能被Ni 富集下來，產(chǎn)生假陽(yáng)性。針對(duì)這一問題，可通過在蛋白質(zhì)結(jié)合過程中加入少量咪唑和在清洗過程中降低溶液的pH 值加以改善?；贖is tag 的理論優(yōu)勢(shì)和實(shí)際效果，研究人員在后續(xù)細(xì)胞水平的規(guī)?；芯恐写蟛糠植捎昧薍is tag。這樣，可以在蛋白質(zhì)富集過程中盡可能多地富集SUMO 化修飾蛋白質(zhì)，減少假陰性率，而在后續(xù)搜庫(kù)過程中，通過鑒定到具體修飾位點(diǎn)而減少假陽(yáng)性率。

除了利用融合標(biāo)簽進(jìn)行富集外，還有研究者利用SUMO 的抗體富集內(nèi)源性SUMO 的修飾蛋白質(zhì)，這對(duì)于難以進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作的組織樣品非常重要［17，28］。在最初的研究中，利用SUMO1 或SUMO2/3 抗體富集的是修飾蛋白質(zhì)而非修飾肽段，不僅富集效率低，得到的非修飾肽段多，而且難以鑒定到修飾位點(diǎn)。2017 年本課題組首次報(bào)道了規(guī)?；b定內(nèi)源性SUMO 的修飾位點(diǎn)的方法［28］。在此方法中，我們合成了將SUMO1 的C 端連接在靶蛋白賴氨酸ε-NH3 上的支鏈肽段，以此為抗原制備了SUMO1的多克隆抗體（TC）。利用此抗體，我們可以富集經(jīng)過Lys-C 酶解后的SUMO1 修飾肽段，并經(jīng)過Glu-C 酶解后鑒定到具體修飾位點(diǎn)。此后，又有研究者設(shè)計(jì)制備了抗NQTGG 的抗體［27］，或直接利用商業(yè)化的識(shí)別SUMO2/3 C 端的抗體（8A2）富集修飾肽段，并用Asp-N 酶解鑒定到了具體修飾位點(diǎn)［17］。值得一提的是，利用商業(yè)化的GG-K 抗體也能有效富集SUMO 化修飾肽段［22，33］，這種方法可以整合在標(biāo)簽純化和抗體純化過程中［27］，從而增加純度，有利于提高修飾位點(diǎn)的鑒定率。

綜上，對(duì)于能夠轉(zhuǎn)染的細(xì)胞而言，最有效便捷的富集方式還是使用His tag；而對(duì)于不便轉(zhuǎn)染的組織樣品，使用SUMO 的C 端抗體富集修飾肽段則是首選之策。此外，這2種方法還可以結(jié)合起來，增加樣品純度以提高修飾位點(diǎn)的鑒定率。

4 細(xì)胞樣品的SUMO化修飾組學(xué)研究

細(xì)胞是研究SUMO 化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)最便捷的樣品，可以通過轉(zhuǎn)染操作進(jìn)行過表達(dá)，還可以對(duì)SUMO 序列進(jìn)行改造，因而鑒定得到更多的修飾位點(diǎn)。通過對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞樣品的SUMO 化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究的方法和結(jié)果進(jìn)行分析和比較，我們發(fā)現(xiàn)了針對(duì)SUMO1、SUMO2 和SUMO3最有效的研究策略（圖2）。

圖2 細(xì)胞樣品中鑒定SUMO修飾位點(diǎn)示意圖Fig 2 Sketch map of identification of SUMOylation sites in cell samples

對(duì)于SUMO1，首先在細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染6His-SUMO1-T95R，根據(jù)需要進(jìn)行刺激或直接收集細(xì)胞。用含有鹽酸胍和多種蛋白酶抑制劑的變性裂解液提取蛋白質(zhì)，并用Ni-NTA磁珠富集SUMO1修飾蛋白質(zhì)。利用咪唑洗脫后再用胰酶酶解得到肽段，將這些肽段用GG-K試劑盒進(jìn)行第2輪富集，而后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。最初用Ni-NTA一步富集只能鑒定得到14個(gè)SUMO1修飾位點(diǎn)［9］，而研究者們進(jìn)一步采用GG-K 富集后可以鑒定得到295個(gè)SUMO1修飾位點(diǎn)，近期用此方法將鑒定位點(diǎn)數(shù)目進(jìn)一步擴(kuò)大到了1 428 個(gè)修飾位點(diǎn)［22，34］。由此可見，2 輪富集得到的效果可能更好。如果起始樣品很多，可以在質(zhì)譜鑒定前使用強(qiáng)陽(yáng)離子交換或高pH 色譜預(yù)分離，以鑒定到更多的修飾蛋白質(zhì)和修飾位點(diǎn)［17，27］。在質(zhì)譜選擇上，現(xiàn)在通常需要Q-Exactive或更高級(jí)別的質(zhì)譜，以增強(qiáng)掃描速度和識(shí)別精度。在搜庫(kù)中，通過設(shè)置GG-K可變修飾來鑒定修飾位點(diǎn)。

對(duì)于SUMO2，首先在細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染10His-SUMO2-K0Q87R，可以通過熱休克和蛋白酶體抑制劑MG132 刺激增強(qiáng)修飾，然后收集細(xì)胞并在變性條件下利用Ni-NTA磁珠富集SUMO2 修飾蛋白質(zhì)。洗脫后用Lys-C 酶解并再次用Ni-NTA 磁珠富集SUMO2 修飾肽段，經(jīng)過胰酶酶解后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。色譜和質(zhì)譜選擇同上述SUMO1鑒定方案。在搜庫(kù)中，通過設(shè)置QQTGG-K 和pyroQQTGG-K 鑒定修飾位點(diǎn)［35］。

對(duì)于SUMO3，首先在細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染6His-SUMO3-Q87RQ88N。由于SUMO3 和SUMO2 均能響應(yīng)熱休克和MG132 刺激而增加修飾，因而可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行這2 種刺激。收集細(xì)胞后用Ni-NTA 磁珠富集SUMO3 修飾蛋白質(zhì)。洗脫后通過胰酶酶解產(chǎn)生NQTGG殘留肽段，這些修飾肽段依次用GG-K 抗體和NQTGG-K 抗體富集，然后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，色譜和質(zhì)譜選擇同上。在搜庫(kù)中，通過設(shè)置NQTGG-K和TGG-K鑒定修飾位點(diǎn)［27］。

5 組織樣品的SUMO 化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究

對(duì)于來源于小鼠或人的組織樣本，難以進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，需要鑒定內(nèi)源SUMO 的修飾位點(diǎn)。通過分析已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合本課題組的近期研究，提出組織樣品的SUMO1 和SUMO2/3 的修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法（圖3）。我們前期在SUMO1修飾最豐富的小鼠睪丸中開展了首次鑒定組織樣品內(nèi)源SUMO 化修飾位點(diǎn)的工作［28］，其技術(shù)路線也可以應(yīng)用在其他組織樣品中。首先提取組織蛋白質(zhì)，在變性條件下用Lys-C 酶解。然后，用制備的SUMO1 抗體（TC） 富集SUMO1 修飾肽段，再經(jīng)過Glu-C 酶解后即可進(jìn)行色譜分離和質(zhì)譜鑒定，通過QTGG-K 和pyroQTGG-K 鑒定修飾位點(diǎn)。需要指出的是，我們當(dāng)初的工作中并未考慮通過pyroQTGG-K 鑒定修飾位點(diǎn)，但基于我們近期的研究測(cè)試，pyroQTGG-K 在SUMO1 的修飾位點(diǎn)鑒定中也廣泛存在，故提出將此加入可變修飾設(shè)置中。對(duì)SUMO2/3 的研究與此類似，差異在于需要用SUMO2/3 抗體（8A2）富集SUMO2/3 修飾肽段，在經(jīng)過Asp-N 酶解后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定［17］。由于Asp-N酶解特異性問題和切割位置，產(chǎn)生的肽段較長(zhǎng)且具有多種中性丟失和切割模式，在搜庫(kù)時(shí)均需考慮。在搜庫(kù)軟件上，除了可以使用傳統(tǒng)的MaxQuant 和Mascot 外，pLink非常適合這種發(fā)生修飾的“交聯(lián)肽”的鑒定［28］。

圖3 組織樣品中鑒定SUMO修飾位點(diǎn)示意圖Fig 3 Sketch map of identification of SUMOylation sites in tissue samples

6 總結(jié)和展望

當(dāng)前，隨著SUMO 突變模式和富集技術(shù)的完善，色譜質(zhì)譜技術(shù)的日益發(fā)展以及搜庫(kù)軟件的不斷更新，在全局水平鑒定蛋白質(zhì)的SUMO 化修飾位點(diǎn)的方法已經(jīng)比較成熟，這些方法也已經(jīng)廣泛應(yīng)用在功能研究中，為揭示SUMO 的主要功能提供了支持。值得注意的是，當(dāng)前絕大部分的研究還是基于過表達(dá)和點(diǎn)突變策略來鑒定修飾位點(diǎn)，而鑒定內(nèi)源野生型SUMO 的修飾位點(diǎn)和定量變化則是未來的趨勢(shì)。另外，在個(gè)體化鑒定內(nèi)源SUMO 化修飾位點(diǎn)的研究中，減少細(xì)胞用量、簡(jiǎn)化操作流程、增加鑒定成功率和陽(yáng)性率將是未來努力的方向。