乳腺癌易感基因1蛋白在腦膠質瘤中的表達及對替莫唑胺敏感性的影響

趙曉軍，喬志剛，梁挺宇，安艷玲

1.山西省腫瘤醫(yī)院神經外科，太原030013；2.山西衛(wèi)生健康職業(yè)學院護理學院，太原030619

腦膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)常見的原發(fā)性腫瘤，其生長方式呈浸潤性，具有極強的侵襲性，經手術切除后患者的復發(fā)率較高、預后較差［1］。乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）蛋白是一種組織特異性腫瘤抑制因子，能夠參與DNA 損傷修復過程，且與紫杉醇、鉑類及替莫唑胺等多種藥物的腫瘤耐藥性密切相關［2-4］。目前的研究顯示，BRCA1 表達異常與肺癌［5］、乳腺癌［6］等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。但有關其在腦膠質瘤中的表達情況，以及是否影響腦膠質瘤細胞對化學治療（化療）藥物的敏感性尚不清楚。因此，本研究通過檢測BRCA1 蛋白在腦膠質瘤中的表達，分析其與患者臨床病理特征之間的相關性，并進一步通過體外抑制BRCA1 的表達，分析其對腦膠質瘤細胞替莫唑胺（temozolomide，TMZ）敏感性的影響，從而探索BRCA1 是否可作為腦膠質瘤臨床治療的新靶點，以期為已對化療藥物產生耐藥性的腦膠質瘤患者提供新的治療手段。

1 對象與方法

1.1 研究對象、主要試劑與儀器

1.1.1 試驗對象 選擇2010 年1 月—2017 年12 月于山西省腫瘤醫(yī)院神經外科行手術切除的腦膠質瘤患者104 例作為研究組，同時選擇頭顱損傷行內減壓手術治療的患者30 例作為對照組。研究組的納入標準：①經組織病理學證實為腦膠質瘤。②首次發(fā)病，術前未接受放射治療（放療）、化療、免疫治療及手術治療等。③無其他神經系統(tǒng)疾病。排除標準：①臨床病例資料不全。②術前發(fā)生腫瘤卒中。③合并其他惡性腫瘤者。本研究已獲得山西省腫瘤醫(yī)院倫理委員會的審批（審批號：20150817-L），所有參與本研究的患者均已簽署知情同意書。

1.1.2 實驗細胞株 人腦膠質瘤細胞株U251購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.3 主要試劑與儀器 鼠抗人BRCA1 單克隆抗體（Santa Cruz，美國），羊抗鼠IgG聚合物（Proteintech，美國），DAB 顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），反轉錄試劑盒（Sigma，美國）；fDSP 彩色攝像系統(tǒng)（Biometra，美國），石蠟包埋機（Leica，德國），烤片機（沈陽恒松科技有限公司），全自動免疫組織化學染色機（Leica，德國），基因擴增儀（杭州博日科技股份有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 患者資料收集、組織標本獲取及處理 收集所有患者的年齡、性別等臨床資料；同時，收集研究組患者腦膠質瘤組織標本及對照組患者頭顱損傷腦組織標本，參考世界衛(wèi)生組織中樞神經系統(tǒng)腫瘤分級標準對研究組患者的病理組織進行分類和分級。本研究所有患者的臨床資料及病理組織標本均來自山西省腫瘤醫(yī)院病理科，所有組織在離體后迅速經10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后待檢。

1.2.2 免疫組織化學法檢測BRCA1蛋白表達 使用切片機將石蠟包埋后的2 組標本制成厚約4μm 的切片，經烤片、脫蠟、乙醇水化后用檸檬酸緩沖液高溫高壓行抗原修復，使用過氧化氫去除內源性過氧化物酶，滴加鼠抗人BRCA1 單克隆抗體稀釋液（1∶100），4 ℃孵育過夜，洗滌后滴加羊抗鼠IgG 聚合物稀釋液（1∶100），室溫下孵育30 min，洗滌后滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，室溫下孵育30 min 后行DAB 顯色。而后經蘇木精復染、中性樹膠封片后，于顯微鏡下觀察。

BRCA1 蛋白表達判定如下：在400 倍鏡下隨機選取每張切片的5 個視野，通過染色強度評分及BRCA1 陽性細胞計數進行綜合評估。染色強度為0～3 分：0 分為無染色，1 分為弱陽性，2 分為中陽性，3 分為強陽性。陽性細胞計數為0～4 分：0 分為陽性細胞百分比為0，1 分為1%～25%，2 分為26%～50%，3 分為51%～75%，4 分為76%～100%。將切片的2項得分累計相加，總分≤3分記為BRCA1陰性表達，總分＞3分記為陽性表達。

1.2.3 細胞培養(yǎng) 將U251 細胞置于含有10%胎牛血清、100μg/mL 青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。細胞密度達80%時，采用0.25%胰酶進行消化傳代。

1.2.4 細胞轉染及分組 以3×103/孔將U251 細胞接種于6 孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行恒溫培養(yǎng)。待細胞生長至80%時，將U251 細胞隨機分為3 組，使用Lipofectamine 2000 試劑盒進行轉染實驗，即分別向3 組細胞轉染shRNA-BRCA1 沉默載體（sh-BRCA1 組）、shNC-BRCA1空表達載體（sh-NC 組）及空白對照磷酸鹽緩沖液（Blank組），而后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.5 反轉錄及定量聚合酶鏈反應檢測BRCA1 mRNA 表達 使用定量聚合酶鏈反應（quantitative PCR，qPCR）檢測轉染效果。使用TRIzol 提取3 組細胞的總RNA，使用反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄成cDNA，以β-肌動蛋白（β-actin）作為內參。按照qPCR 試劑盒說明書以cDNA為模板檢測BRCA1 mRNA 表達，引物序列如表1 所示。BRCA1 mRNA的相對表達量計算采用2-ΔΔCT方法。

表1 qPCR引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.2.6 CCK-8 法檢測細胞增殖活性及對TMZ 敏感性 收集轉染后的3組細胞，經胰酶消化后制成單細胞懸液。按照說明書步驟，將已轉染的細胞以3×103/孔接種至96 孔板中，每組（不同時間及濃度）均設置6個復孔。①細胞增殖活性檢測：于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48 和72 h 后，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育2 h后用酶標儀檢測各孔于450 nm處的吸光度D（450 nm）值。②TMZ敏感性檢測：于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)至細胞貼壁，加入10 μL 不同濃度的TMZ 使孔中的TMZ 終濃度分別為0、50、100 及200μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育2 h 后用酶標儀檢測各孔于450 nm處的吸光度D（450 nm）值。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 軟件對研究數據進行統(tǒng)計分析。定性資料采用率或百分比表示，采用χ2檢驗進行分析；定量資料以x±s 表示，采用One-way ANOVA 進行組間比較；采用Kaplan-Meier 法計算生存率，使用Log-Rank 法進行差異顯著性檢驗。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組患者一般資料比較

本研究共納入104 例腦膠質瘤患者，其中男性56 例、女性48例，年齡為18～67歲，平均年齡為（47.5±7.8）歲；病理組織分級顯示，62 例為Ⅰ～Ⅱ級，42 例為Ⅲ～Ⅳ級；病理組織類型顯示，30 例為膠質母細胞瘤，48 例為星形細胞瘤，26 例為少突膠質細胞瘤。本研究共納入30 例頭顱損傷患者，其中男性18 例、女性12 例，年齡為20～67歲，平均年齡為（45.2±8.1）歲。對患者的年齡及性別進行統(tǒng)計分析，結果顯示2組患者的年齡（P=0.321）、性別（P=0.690）間差異均無統(tǒng)計學意義。

2.2 2組患者BRCA1蛋白表達的比較

免疫組織化學法結果顯示，BRCA1 蛋白主要位于細胞質內，但在細胞核內也有一定表達。在30 例對照組組織中有23 例為BRCA1 陽性表達，陽性表達率為76.67%；而在104 例腦膠質細胞瘤組織中有33 例呈陽性，陽性表達率為31.73%；陽性表達率的組間差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.009，圖1）。

圖1 免疫組織化學法檢測BRCA1蛋白表達陰性和陽性的鏡下示例（×400）Fig 1 Microscopic examples of negative and positive BRCA1 protein expression detected by immunohistochemistry （×400）

2.3 BRCA1蛋白表達與研究組患者臨床病理特征之間的關系

BRCA1 蛋白表達與患者的年齡、性別及病理類型無顯著相關性，而在Ⅲ～Ⅳ級腦膠質瘤組織中BRCA1 的陽性表達率低于Ⅰ～Ⅱ級，且差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.022，表2）。

表2 BRCA1蛋白表達與研究組患者臨床病理特征之間的關系Tab 2 Relationship between BRCA1 protein expression and clinicopathological characteristics of the patients in the study group

2.4 BRCA1蛋白表達與研究組患者生存率的關系

Log-Rank 法分析結果（圖2）顯示，BRCA1 蛋白陽性表達患者的總生存率與陰性表達患者相比，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.109）。

2.5 BRCA1 mRNA細胞轉染效果

采用qPCR檢測細胞的轉染效果，結果（圖3）顯示，BRCA1 在U251 細胞中（即Blank 組）有一定的表達，且在sh-BRCA1 組中的表達量低于sh-NC 組（P=0.037）和Blank組（P=0.035），說明轉染成功。

圖3 細胞轉染后BRCA1 mRNA的表達水平Fig 3 Expression level of BRCA1 mRNA after transfection

2.6 抑制BRCA1表達對U251細胞增殖活性的影響

采用CCK-8 法檢測U251 細胞的增殖活性，結果（圖4）顯示，經培養(yǎng)48、72 h后，sh-BRCA1組細胞的增殖 活 性高于Blank 組（P=0.043，P=0.037）和sh-NC 組（P=0.046，P=0.037）；說明抑制BRCA1 表達能夠促進癌細胞增殖。

2.7 TMZ對U251細胞增殖活性的影響

經不同濃度的TMZ 處理后，采用CCK-8 法檢測3 組U251細胞的增殖活性，結果（圖5）顯示TMZ對U251細胞均有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性；當TMZ 濃度為100、200 μmol/L 時，sh-BRAC1 組的細胞活性顯著高于sh-NC 組（P=0.041，P=0.040）和Blank 組（P=0.038，P=0.042）。

圖4 抑制BRCA1表達對3組U251細胞增殖活性的影響Fig 4 Effect of inhibition of BRCA1 expression on proliferation activity of U251 cells in the three groups

圖5 不同濃度TMZ對3組U251細胞增殖活性的影響Fig 5 Effects of different concentrations of TMZ on proliferation activity of U251 cells in the three groups

3 討論

腦膠質瘤惡性程度較高，約占原發(fā)性顱內腫瘤的50%［7］。近年來，腦膠質瘤的發(fā)病率和死亡率呈逐漸上升趨勢，嚴重影響人類的生命健康。目前，手術切除、化療和放療是腦膠質瘤的主要治療手段，但患者的5年生存率仍低于5%［8］。有報道指出，BRCA1 在乳腺［6］、卵巢癌［9］等多種腫瘤中呈低表達，推測其可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。進一步研究［10-11］表明，BRCA1蛋白能夠調控細胞周期，參與DNA 損傷修復過程，且具有抑制惡性腫瘤生長的作用。研究［12］顯示，消化系統(tǒng)腫瘤細胞的細胞質中BRCA1 和BRCA2 的低表達水平與腫瘤晚期淋巴結轉移密切相關，而細胞質中高表達BRCA1 和BRCA2 的患者預后較好。另有研究［13-14］表明，BRCA1在多種腫瘤中表達異常，且與患者的臨床病理特征存在一定相關性。本研究采用免疫組織化學法檢測了對照組及研究組的BRCA1 蛋白表達情況，結果發(fā)現研究組BRCA1蛋白陽性表達率低于對照組，即BRCA1在腦膠質瘤中呈低表達，推測其可能與膠質瘤的發(fā)生發(fā)展有關。隨后，本研究分析了BRCA1 蛋白表達與膠質瘤患者臨床病理特征之間的關系，結果顯示BRCA1 的表達與患者的年齡、性別、病理類型無顯著相關性，但與腫瘤病理分級顯著相關，說明BRCA1 可能與腫瘤的惡性程度相關；但進一步對BRCA1 與患者生存率之間的關系分析發(fā)現，BRCA1 陽性表達患者的總生存率與陰性表達患者間差異無統(tǒng)計學意義。上述結果表明BRCA1 可能在腦膠質的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了一定作用。

目前，臨床上惡性腦膠質瘤的主要治療手段為手術并輔以TMZ化療及放療，但由于患者易對TMZ產生耐藥性，因此其治療效果并不理想。TMZ 主要通過干擾DNA復制、損傷DNA 來抑制腫瘤細胞增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。既往研究［15-16］顯示BRCA1 在DNA 損傷修復、調節(jié)細胞周期及促進細胞增殖過程中發(fā)揮重要作用，因此我們推測其可能參與了膠質瘤患者TMZ 耐藥性產生的過程。Ding 等［17］研究發(fā)現BRCA1 是引起TMZ 誘導的P53 野生型膠質母細胞瘤細胞死亡的潛在靶點，抑制BRCA1能夠誘導神經膠質瘤sphere-forming細胞凋亡，增強細胞對化療藥物TMZ的敏感性，提示BRCA1可能成為治療神經膠質瘤的新靶點。本研究首先從臨床患者組織中證實了BRCA1 在腦膠質瘤中低表達且與患者臨床病理特征具有一定的相關性，但是BRCA1 是否參與調控腦膠質瘤對化療藥物敏感性尚不清楚。因此，本研究通過體外細胞水平探索了抑制BRCA1表達對腦膠質瘤細胞TMZ敏感性的影響，通過構建BRCA1 低表達腦膠質瘤U251細胞模型，觀察不同濃度TMZ對腦膠質瘤U251細胞增殖活性的影響，結果發(fā)現抑制BRCA1 表達能夠降低腦膠質瘤細胞U251 對TMZ 的敏感性，推測其在膠質瘤TMZ 化療耐藥中可能發(fā)揮了重要作用。

目前，關于BRCA1 蛋白在腦膠質瘤中的表達及其對腦膠質瘤耐藥性的影響報道較少，本研究初步探究了BRCA1 在腦膠質瘤組織中的表達及其與患者臨床病理特征的關系，同時在細胞水平上初步觀察了BRCA1 對腦膠質瘤TMZ敏感性的影響，為進一步探究BRCA1在腦膠質瘤中的作用提供了一定的數據基礎。本研究尚存在一定的局限性：由于納入的樣本量較少，僅通過檢測細胞活性來觀察BRCA1 表達對U251 細胞TMZ 敏感性的影響，未進行深入的機制研究，使得本研究結果僅具有一定的代表性。因此，在今后的研究中我們仍需要繼續(xù)收集病理數據，擴大樣本量及研究范圍，從分子及細胞水平深入探究BRCA1 在腦膠質細胞瘤中可能的作用機制，從而為腦膠質細胞瘤的臨床治療提供一定的參考。