電子煙氣溶膠暴露對小鼠肺功能的影響

顧建軍 龔道輝 馮婷婷 閔凌峰

揚州大學臨床醫(yī)學院蘇北人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,揚州225001

吸煙是導致COPD 最主要的危險因素,給個人及社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔[1]。COPD 是一種以持續(xù)性呼吸道癥狀和氣流受限為特征的疾病[2]。肺功能檢測是判斷氣流受限的重要指標。眾多研究顯示,吸煙者的肺功能較不吸煙者明顯下降[3-5]。隨著人們對香煙煙霧危害的認識加深,全球范圍內(nèi)的吸煙率在不斷減少[6]。越來越多的煙草公司也在積極推廣新的吸煙裝置去替代傳統(tǒng)香煙[7]。

IQOS是菲利普莫里斯國際公司開發(fā)的一種新型電子煙,主要成分尼古丁,它的特點是不用燃燒,通過一種加熱裝置產(chǎn)生氣溶膠[8-9]。因不產(chǎn)生煙霧,許多有害化學物質(zhì)大大減少,因此他們聲稱抽吸IQOS比傳統(tǒng)香煙更安全,是傳統(tǒng)香煙很好的替代品,且IQOS已被美國食品與藥物安全局批準上市[10]。然而近來的一些研究顯示IQOS 并不安全,如Li等[11]通過對3R4F 香煙煙霧和IQOS熱解產(chǎn)物分析,發(fā)現(xiàn)IQOS中尼古丁和焦油的含量與3R4F中尼古丁和焦油的含量相當,尼古丁成癮同樣值得注意。Salman等[12]研究同樣發(fā)現(xiàn)IQOS釋放的游離堿和尼古丁含量與傳統(tǒng)香煙相近。St等[13]對IQOS產(chǎn)生的氣溶膠與3R4F香煙煙霧成分進行了分析,發(fā)現(xiàn)IQOS氣溶膠中有22種物質(zhì)高出3R4F 200%,7 種物質(zhì)高出3R4F 1 000%。Glantz等[14]發(fā)現(xiàn)IQOS中潛在的24種有害的生物標志物與傳統(tǒng)香煙差異無統(tǒng)計學意義。這些結(jié)果都提示IQOS替代傳統(tǒng)香煙并不是個好策略。

然而,目前關(guān)于長期吸食電子煙IQOS對肺功能是否會產(chǎn)生不利影響尚不明確,故本研究特建立24周小鼠氣溶膠暴露模型,以評估其對小鼠肺功能的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1·1 實驗材料及儀器 萬寶路牌紅香煙 (1.2 mg尼古丁,美國菲利普莫里斯煙草公司),萬寶路牌加熱棒(1.29 mg尼古丁,美國菲利普莫里斯煙草公司)。電子煙IQOS加熱器 (美國菲利普莫里斯煙草公司)。儀器與設(shè)備:染毒箱 (自制有機玻璃箱,90 cm×40 cm×30 cm)。光學顯微鏡 (德國卡爾·蔡司股份公司)、肺功能儀 (flexiVent,加拿大賽睿克生物技術(shù)有限公司)。

1·2 動物分組 選取8～10 周齡SPF 級近交系C57BL/6J雄性小鼠24 只,體質(zhì)量24～27 g,購自北京維通利華實驗動物中心 [許可證號:SCXK(京)2016-0006],隨機分成對照組、香煙組、IQOS組,每組8只,于揚州大學動物中心清潔房飼養(yǎng),溫度21～23℃,濕度50%～60%,晝夜12 h節(jié)律,自由進食、飲水。實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。所有動物研究經(jīng)揚州大學動物倫理委員會(YXYLL-2018-80)批準。

1·3 動物處理 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后開始造模。實驗時將各組小鼠分別放入自制的染毒箱(90 cm×40 cm×30 cm)。參考加拿大深度抽吸方法:每次抽吸持續(xù)2 s,間隔30 s,每次抽吸達55 ml。為了匹配尼古丁濃度參考Leigh 等[15]的研究:一支萬寶路牌紅香煙抽吸8次,一支萬寶路牌加熱棒抽吸12次。香煙組及IQOS組小鼠分別暴露于香煙煙霧、IQOS氣溶膠中30 min,5支/次,間隔4 h,2次/d,5 d/周,共處理24周。對照組小鼠給予呼吸新鮮空氣。

1·4 小鼠一般情況及體質(zhì)量測量 觀察各組小鼠一般情況,每周稱量各組小鼠體質(zhì)量,動態(tài)觀察各組小鼠體質(zhì)量變化。

1·5 小鼠肺功能測定 24周實驗結(jié)束后,2%戊巴比妥鈉 (50 mg/kg)腹腔麻醉小鼠,固定,備皮、消毒后,剪開皮膚,輕柔鈍性分離暴露氣管,在氣管軟骨環(huán)之間水平剪開氣管,插入插管針并連接小動物肺功能儀進行肺功能測定,記錄氣道阻力、組織阻尼、組織彈性、第50毫秒用力呼氣容積(forced expiratory volume at 50 ms,FEV0.05)和FVC。小鼠肺功能檢測在揚州大學醫(yī)學院機能實驗中心進行,為保證肺功能數(shù)據(jù)質(zhì)量,操作均由同一人進行。

1·6 肺組織病理形態(tài)及平均肺泡直徑 取右下肺組織并置于4%中性多聚甲醛固定液中進行固定,石蠟包埋、切片,行HE染色。光學顯微鏡下觀察肺組織病理形態(tài),每張切片在光學顯微鏡下隨機選取3個視野,用IPP6.0測量其直徑,取平均值。

1·7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理,所有實驗均獨立重復3次,計量資料均以±s 表示,2 組間比較采用t 檢驗,P <0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2·1 各組一般情況及體質(zhì)量變化情況 對照組小鼠至實驗結(jié)束后均無明顯異常,毛發(fā)光澤,活潑好動,食欲正常,呼吸平穩(wěn)。IQOS組及香煙組小鼠逐漸出現(xiàn)體型減小,毛發(fā)枯燥,精神萎靡,活動減少,食欲下降,弓背卷縮,出現(xiàn)打噴嚏,呼吸急促。實驗過程中無小鼠死亡。實驗結(jié)束后對照組小鼠體質(zhì)量明顯增加,而IQOS組及香煙組小鼠體質(zhì)量較同時間點對照組降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P 值均<0.05)。電子煙IQOS 組體質(zhì)量與香煙組比較,差異無統(tǒng)計學意義 (t =0.537,P >0.05)。見表1。

2·2 小鼠肺功能 24周實驗結(jié)束后給予常規(guī)麻醉小鼠,氣管切開插管測量FEV0.05/FVC、組織阻尼、組織彈性、FVC及氣道阻力。結(jié)果顯示IQOS組和香煙組小鼠FEV0.05/FVC、組織阻尼和組織彈性均低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義 (P 值均<0.05),見圖1～3。IQOS 組及香煙組小鼠FVC及氣道阻力均比對照組顯著增加,差異均有統(tǒng)計學意義 (P 值均<0.05),見圖4、5。然而IQOS組小鼠的FEV0.05/FVC、組織阻尼、組織彈性、FVC和氣道阻力與香煙組小鼠比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P 值均>0.05)。見圖1～5。

表1 各組小鼠實驗前后體質(zhì)量比較 (±s)

表1 各組小鼠實驗前后體質(zhì)量比較 (±s)

注:與對照組比較,a P <0.05

組別鼠數(shù)體質(zhì)量 (g)處理前處理后對照組8 28.36±1.11 36.59±1.82香煙組8 28.53±1.15 33.37±1.99a IQOS組8 28.49±1.19 33.83±1.45a F 值0.002 7.780 P 值0.998 0.003

圖1 各組小鼠第50毫秒用力呼吸容積/用力肺活量

圖2 各組小鼠組織阻尼

2·3 肺組織病理形態(tài)及肺泡平均線性截距 24周實驗結(jié)束后取各組小鼠肺組織行病理切片HE 染色。IQOS組及香煙組均可見肺泡腔擴大、部分肺泡間隔斷裂、肺泡腔融合、肺氣腫形成;對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整 (圖6)。香煙組小鼠平均線性截距(44.6±1.8)μm,IQOS組(41.6±1.6)μm、對照組(31.5±1.6)μm (圖7)。IQOS組與香煙組小鼠平均線性截距均較對照組擴大,差異均有統(tǒng)計學意義(P 值均<0.05)。IQOS組與香煙組平均線性截距差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05)。

圖3 各組小鼠組織彈性

圖4 各組小鼠用力肺活量

3 討論

眾所周知,香煙煙霧是威脅人類健康的主要問題,每年在全球造成約600萬例死亡病例[16-17]。香煙煙霧中含有超過4 700種化學物質(zhì),其中69種被證實可導致肺癌[18]。最近出現(xiàn)的新型電子煙IQOS是一種加熱不燃燒的煙草產(chǎn)品[19],因為加熱溫度遠低于傳統(tǒng)香煙,不產(chǎn)生煙霧,減少了許多有害化合物產(chǎn)生,被認為是安全的,也因此越來越受青年人青睞[20]。Tabuchi等[21]在日本開展的互聯(lián)網(wǎng)調(diào)查研究也發(fā)現(xiàn)IQOS在年輕人中抽吸比率呈上升趨勢。但是目前關(guān)于長期吸食電子煙是否會對肺功能產(chǎn)生不利影響知之甚少,因此本文進行了為期24周的小鼠煙霧/氣溶膠暴露實驗,旨在探究其對小鼠肺功能的影響。

圖5 各組小鼠氣道阻力

圖6 各組小鼠肺組織行病理切片 HE ×400 A:對照組;B:香煙組;C:電子煙組

圖7 各組小鼠肺泡平均線性截距

本實驗采用全身暴露的方法讓小鼠分別暴露于氣溶膠及煙霧中24 周以模擬人長期吸煙的過程。因為小鼠的壽命為1.5～2 年,我們給予24 周暴露,時間相對足夠長,以便更好地反映長期IQOS氣溶膠暴露對小鼠肺功能的影響。我們在實驗中觀察到經(jīng)過24周的暴露,IQOS組及香煙組小鼠均出現(xiàn)精神萎靡,食量降低,活動減少,打噴嚏、咳嗽等情況;對照組小鼠精神佳,食量正常,活潑好動,呼吸勻暢。且IQOS組及香煙組小鼠體質(zhì)量均較同時間點對照組小鼠下降,這與Albanes等[22]的研究發(fā)現(xiàn)吸煙者較不吸煙者體質(zhì)量減輕結(jié)果相一致。同時我們還發(fā)現(xiàn)IQOS組小鼠體質(zhì)量較香煙組差別不大,說明長期IQOS暴露同樣會對小鼠一般狀況產(chǎn)生影響。

吸煙可加速肺功能減退[23-24],且肺功能是評價肺部健康的重要指標,因此我們通過氣管切開的方法測量各組小鼠肺功能情況[25]。我們選用了目前世界上普遍采用的flexiVent技術(shù) (強迫震蕩法)測量各組小鼠的氣道阻力、組織阻尼、組織彈性、FEV0.05和FVC[26]。我們發(fā)現(xiàn),IQOS組及香煙組小鼠組織阻尼、組織彈性、FEV0.05/FVC 均較對照組小鼠降低,差異均有統(tǒng)計學意義 (P 值均<0.05);氣道阻力和FVC 均較對照組小鼠增加(P 值均<0.05);但是IQOS 組小鼠組織阻尼、組織彈性、氣道阻力、FEV0.05/FVC 均與香煙組差異無統(tǒng)計學意義(P 值均>0.05)。同時我們還發(fā)現(xiàn)IQOS 組小鼠FEV0.05/FVC<70%,達到人COPD 診斷標準,說明長期IQOS暴露可導致小鼠COPD 形成。此外,我們還發(fā)現(xiàn)IQOS暴露小鼠和傳統(tǒng)香煙暴露小鼠一樣,存在氣道阻力增加,肺組織彈性和肺組織阻尼減少,符合COPD 氣道阻塞,氣流受限,肺氣腫特征。Moazed等[27]研究發(fā)現(xiàn)吸食傳統(tǒng)香煙的那些人即使轉(zhuǎn)吸IQOS,肺功能并沒有明顯的提升,進一步說明長期吸食電子煙并不是一個很好的替代方案。

HE染色更能反應(yīng)IQOS氣溶膠對小鼠肺組織的病理變化。肺功能測量結(jié)束后,剪取各組小鼠肺組織并給予HE染色。我們發(fā)現(xiàn)IQOS組和香煙組小鼠均較對照組肺泡腔擴大、肺泡間隔破壞,部分肺泡融合、肺氣腫形成。肺泡平均線性截距能夠反應(yīng)肺組織破壞程度,我們通過測量肺泡平均線性截距發(fā)現(xiàn)IQOS組及香煙組較對照組明顯增大,這與我們發(fā)現(xiàn)小鼠IQOS 暴露后肺功能下降結(jié)果相符合;然而IQOS組小鼠肺泡平均線性截距較香煙組差異無統(tǒng)計學意義,說明長期吸食電子煙IQOS同樣也會造成肺氣腫的產(chǎn)生,從而影響肺功能,對肺部帶來不利影響。

目前有研究顯示,IQOS 還能促進肺部炎癥,損傷肺組織。如Moazed 等[27]研究發(fā)現(xiàn),暴露于IQOS氣溶膠中的大鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子增加、上皮細胞增生;Leigh等[15]發(fā)現(xiàn)IQOS氣溶膠會損害支氣管上皮細胞。Sohal等[28]也發(fā)現(xiàn)IQOS與傳統(tǒng)香煙比較,同樣會增加氣道上皮細胞促炎因子、膠原蛋白Ⅰ和纖維連接蛋白釋放,可能會增加慢性肺部疾病的發(fā)生。此外,還有研究發(fā)現(xiàn)IQOS還能對其他系統(tǒng)產(chǎn)生危害,如Chun等[29]研究發(fā)現(xiàn)暴露于IQOS氣溶膠中的大鼠轉(zhuǎn)氨酶升高,可能具有肝毒性;Nabavizadeh等[30]動物研究發(fā)現(xiàn)IQOS并不一定能避免傳統(tǒng)香煙對心血管的不良影響。這些研究都表明IQOS危害性并不一定比傳統(tǒng)香煙小,因此對待IQOS還需要慎重考慮。

本研究是基于動物水平檢測長期IQOS氣溶膠暴露對小鼠肺功能的影響,還需檢測長期吸食電子煙IQOS人群的肺功能,進一步說明其對肺功能的損害。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突