環(huán)狀RNA在成骨分化中的作用

董惠賢，鐘嘉琳，江千舟

1. 廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科（廣州 510182）

2. 廣州市口腔再生醫(yī)學基礎與應用研究重點實驗室（廣州 510182）

環(huán)狀核糖核酸（circular RNAs，CircRNAs）首次在類病毒中被發(fā)現(xiàn)[1], 被認為是異常剪接的副產(chǎn)品。CircRNAs通過5’端和3’端的反向剪接，形成環(huán)狀RNA結構[2]，這種獨特的環(huán)狀結構可以抵抗核糖核酸酶的消化，并且相對穩(wěn)定，半衰期可以超過48小時[3]，隨著高通量測序技術的發(fā)展，在眾多的細胞系和不同的物種中已經(jīng)有效地識別出了大量的CircRNAs[4-5]，大量證據(jù)表明它們在器官和疾病發(fā)育過程中的基因調控中扮演著不同的角色，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥以及干細胞的發(fā)育、干性維持及多向分化調控和調節(jié)分化的生物學活動中發(fā)揮關鍵作用[6-9]。其中， CircRNAs在成骨過程中的變化提示，CircRNAs在成骨過程中可能發(fā)揮作用[10-13]。本文介紹在不同組織細胞中CircRNAs成骨分化的作用（圖1），將CircRNAs在成骨分化過程中生物學功能的研究現(xiàn)狀作一綜述。

圖1 CircRNAs在成骨分化中的作用Figure 1. The role of CircRNAs in osteogenic differentiation

1 CircRNAs的特點

CircRNAs是一類新的非編碼RNA，是在轉錄過程中RNA轉錄片段端到端連接而產(chǎn)生的閉環(huán)RNA。根據(jù)基因組起源，CircRNAs分為三類：僅由內含子組成的內含子CircRNAs（CiRNAs）；僅由外顯子組成的外顯子CircRNAs（EcircRNAs）；由外顯子和內含子共同形成的外顯子-內含子 CircRNAs（EIcircRNAs）[14]。目前普遍認為CircRNAs的環(huán)化方式主要有套索驅動環(huán)化、內含子配對驅動環(huán)化和RNA結合蛋白驅動環(huán)化3種[3,14-15]。套索驅動環(huán)化指當mRNA前體（premRNA）進行GU/AG剪切時，可以跨外顯子進行剪切，形成含有外顯子和內含子的套索中間體，然后加工形成CircRNAs。內含子配對驅動環(huán)化指某些外顯子兩側的內含子序列中含有反向互補序列，它們之間互補配對形成RNA雙鏈，促進CircRNAs的形成。而RNA結合蛋白驅動環(huán)化則指一些RNA結合蛋白可以結合到外顯子側翼的內含子序列上，促進CircRNAs的形成。

因為缺少RNA酶介導的降解的自由端[16]，所以與lncRNAs和miRNAs相比，CircRNAs在哺乳動物細胞中具有更高的穩(wěn)定性和序列保守性[17]。也有研究發(fā)現(xiàn)，CircRNAs具有種屬特異性、組織特異性、疾病特異性以及與發(fā)育階段相關的特異性[18-20]。同時一個基因可以產(chǎn)生多種不同類型的CircRNAs，甚至有些CircRNAs表達量比其相對應的線性RNAs還要豐富。盡管有這些發(fā)現(xiàn)，CircRNAs的許多特征仍不清楚。

2 干細胞中CircRNAs的成骨分化作用

近年來，細胞治療特別是間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在骨缺損的治療中顯示出良好的應用前景。MSCs是一種多潛能干細胞，具有自我更新和多向分化的特點。它們幾乎存在于所有組織中，并在組織修復和再生中發(fā)揮重要作用[21]。常用于骨組織工程的MSCs主要包括：骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）、脂肪源性間充質干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）、牙髓干細胞（dental pulp stem cells, DPSCs）、胚胎干細胞、臍血間充質干細胞、誘導多能干細胞等[22]。近年來許多關于非編碼RNA調控成骨分化的研究主要集中在BM-MSCs、ADSCs、DPSCs、牙周韌帶干細胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）等細胞系上，且許多研究已表明CircRNAs在這類細胞成骨分化過程中發(fā)揮重要作用。

2.1 骨髓間充質干細胞

BM-MSCs是一種多能干細胞，具有高成骨潛能，被廣泛用于組織工程研究及應用。BM-MSCs是成骨細胞的主要來源，可以促進缺損區(qū)骨修復[22]。BM-MSCs的成骨分化受一系列編碼和非編碼RNA調控[23-25]。目前已經(jīng)有不少研究表明CircRNAs對BM-MSCs成骨分化過程具有調控作用，例如：在骨質疏松研究中，circRNA_0076906、circVANGL1、circRNA_0011269、circRNA_0016624、circRUNX2、circ_0076690、circ_0024097及 circ_0006393在人BM-MSCs中起到促進成骨分化，抑制骨質疏松發(fā)展的作用[26-33]。circRNA_1983在硅酸氫鈣微粒誘導BM-MSCs成骨分化和骨缺損修復中具有促進作用[34]。circDAB1、circRNA_33287、circRNA_0074834、circ-SLC8A1的抑制降低了BMSCs的礦化結節(jié)形成已經(jīng)被證明能夠促進人BMMSCs的成骨分化[11,34-36]。另外有研究表明，除了正向調控作用外，CircRNAs對BM-MSCs成骨分具有負向調控影響，例如：circIGSF11、circRNA_0127781可能參與抑制人BM-MSCs的成骨分化[37]。Kuang等人揭示，在糖皮質激素引起的股骨頭壞死中circUSP45在BM-MSCs的成骨分化過程中起負調控作用[38]。

此外，Zhang等證實在股骨頭壞死的BMMSCs中 circRNA_0000219、circRNA_0004588、circRNA_0005936等CircRNAs的表達與BMMSCs的增殖和成骨能力呈潛在的正相關[37]。在鈦表面機械研磨促進人BM-MSCs成骨分化的研究中發(fā)現(xiàn)circRNA_0032600對人BM-MSCs中晚期成骨分化也有調節(jié)作用[39]。

2.2 牙髓干細胞

DPSCs來源于牙髓組織，可從牙髓組織中獲取，具有來源廣泛、較高的安全性、高增殖潛能及較強的克隆能力、可自我更新性和多向分化性等特性，已成為組織工程及再生醫(yī)學領域的種子細胞[40]。DPSCs的成牙本質向分化是牙體組織自我防御及修復的關鍵，已有研究證實circRNA可參與調控DPSCs的成牙本質向分化過程，例如研究表明circRNA_0015260、circRNA_0006984在誘導成牙本質分化的人牙髓細胞中表達上調，并證明其具有促進人牙髓細胞的成牙本質分化的功能[41]。

在不同的誘導條件下，DPSCs可以分化為神經(jīng)性、成骨性和肌源性細胞系[34]。來自活體研究和動物模型的實驗證據(jù)表明，DPSCs具有產(chǎn)生適當血管化的板層骨的能力[42]。因此，越來越多學者將DPSCs用于骨再生的研究中。其中不少學者對CircRNAs在DPSCs成骨分化過程的作用進行研究。如體內外研究發(fā)現(xiàn)在人DPSCs成骨分化過程中，circRNA_0026827的表達顯著增加，且體內異位骨模型研究也發(fā)現(xiàn)circRNA_0026827過表達在促進異位骨形成中起重要作用[43]；另外circRNA_124534、circSIPA1L1也被證實能促進DPSCs向成骨細胞分化[44-45]。

2.3 脂肪源性間充質干細胞

ADSCs位于脂肪組織的基質-血管段，由于其具有來源豐富、自體來源容易等特點，逐漸成為骨再生醫(yī)學研究的重點。然而，有限的成骨分化潛能和天然的向成脂細胞分化的傾向極大地阻礙了其在骨修復中的臨床應用發(fā)展[44]。ADSCs的成骨分化涉及包括非編碼RNA在內的多種因素的復雜調控，而且在很大程度上還沒有確定[45]。部分研究已證實CircRNAs在ADSCs成骨分化過程中具有調控作用，例如circRNAvgl13能顯著促進ADSCs的成骨分化[46]；circRFWD2和circINO80可以與miR-6817-5p相互作用，從而抑制ADSCs成骨作用[47]。

2.4 牙周韌帶干細胞

PDLSCs已被證明能產(chǎn)生典型的牙周韌帶樣組織，以再生牙周炎損傷的組織。此外PDLSCs具有巨大的再生能力潛力，這有助于其自我更新和多向分化，尤其是成骨方向分化[48]。例如，Li等觀察到circCDR1as在PDLSCs成骨分化過程中顯著上調，并發(fā)現(xiàn)circCDR1as能促進其成骨分化[49]。而Gu等人通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)circBANP、circRNA_4214、circRNA_3140和 circITCH對PDLSCs成骨分化具有調控作用[48]。此外circRNA_432、circRNA_126、circRNA_4045、circRNA_4251、circRNA_5331、circRNA_3140、circRNA_436和circRNA_4045等CircRNAs被檢測對機械力刺激下的PDLSCs的成骨分化具有調控作用[50]。

2.5 小鼠胚胎成骨細胞前體細胞

小鼠胚胎成骨細胞前體細胞（MC3T3-E1）是一種成骨細胞樣細胞系，是研究成骨細胞增殖和分化，以探討骨質疏松分子機制的有用模型[51]。有報道稱在小鼠胚胎成骨細胞前體細胞中circRNA_19142和circRNA_5846與成骨細胞分化相關[12]。mm9_circ_009056能夠正向誘導小鼠胚胎成骨細胞前體細胞成骨分化[52]。另外，在氧化應激誘導小鼠胚胎成骨細胞前體細胞的細胞凋亡和成骨的研究中表明，circ_0001843具有成骨促進作用[53]。而在微重力作用下的MC3T3-E1細胞成骨過程circ_010383、circ_014154和circ_014977的差異表達較明顯，且生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，circ_014154靶向miR-145a-5p和let-7a-5p，另外GO和KEGG分析表明circ_014154參與成骨細胞分化的正調控[54]。在小鼠胚胎成骨細胞前體細胞研究中發(fā)現(xiàn)，circAFF4能夠促進股骨骨折愈合[55]。此外circFGFR2被證實能促進大鼠牙囊細胞成骨分化[10]。

3 CircRNAs在成骨分化調控中的信號通路研究

Wnt/β-catenin信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）通路、Notch信號通路和核因子-κB（NF-κB）信號通路等在組織成骨分化過程中發(fā)揮著不可替代的作用。隨著對CircRNAs研究的深入，CircRNAs是否參與或影響重要信號通路的調控受到了廣泛的關注。

3.1 Wnt/β-catenin通路

Wnt/β-catenin信號通路（稱為經(jīng)典Wnt通路）廣泛存在于多細胞動物中，是一條在物種進化中高度保守的信號通路，其構成主要包括Wnt、卷曲蛋白、β-catenin、低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6、GSK-3β、T細胞因子/淋巴增強因子等[56]。目前，靶向Wnt/β-catenin信號通路已經(jīng)成為維持骨內穩(wěn)態(tài)、促進骨修復、治療骨骼疏松的重要途徑之一[57]。

已有大量研究證實，CircRNAs可通過靶向廣泛的miRNA對Wnt/β-catenin信號通路的調控作用產(chǎn)生影響。據(jù)報道，沉默circIGSF11可以促進BMSCs的成骨過程，并且與miR-199b-5p呈負相關[37]。而miR-199b-5p可以通過靶向糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）刺激成骨細胞分化，其中GSK-3β可以通過誘導β-catenin進入細胞核，從而激活Wnt信號通路[58]。此外有報道表明，源自YAP1的circ_0024097使miR-376b-3p上調了YAP1的水平，從而激活Wnt /β-catenin途徑，進一步促進了BMSC和MC3T3-E1細胞的成骨分化[32]。

Qian等發(fā)現(xiàn)，circRNA_5846與小鼠胚胎成骨細胞前體細胞成骨分化相關[12]，且生物信息學分析表明circRNA_5846與miR-432之間存在相互作用。同時有研究表明，miR-432可能通過下調Wnt/β-catenin信號通路來抑制人肝癌細胞的增殖[59]。但是否存在circRNA_5846/miR-432/Wnt/β-catenin途徑調節(jié)成骨仍有待研究。

3.2 絲裂原活化蛋白激酶通路

MAPKs是普遍存在于各種哺乳動物細胞中的一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能被多種外環(huán)境所激活，通過三級酶促級聯(lián)反應進行信號轉導，參與細胞生長、分化、凋亡等多種生理過程[60]，尤其在BM-MSCs的成骨過程中起著重要作用。據(jù)報道，在HNGF6A處理后的小鼠胚胎成骨細胞前體細胞中，circRNA_0001843可靶向結合miR-214，進而抑制p38和JNK的磷酸化。此外，circRNA_0001843過表達和miR-214敲低均顯著降低了HNGF6A的細胞保護和成骨促進作用。因此證明了HNGF6A通過靶向circRNA_0001843/miR-214通路及其下游激酶p38和JNK，保護成骨細胞免受氧化應激誘導的凋亡和成骨細胞表型抑制[53]。

此外報道，circRNA_4214在成骨誘導的牙周膜干細胞中表達顯著上調，并通過調控miR-21及MAPKs信號通路促進成骨[51]。同時circBANP、circITCH分別與miR-34a和miR-146a相互作用，通過MAPKs信號通路調節(jié)人牙周膜干細胞的成骨分化[48]。

3.3 Notch信號通路

Notch信號抑制MSCs向成骨細胞系的分化，但在早期促進干細胞的增殖，在后期Notch激活促進干細胞成骨向分化[57]。有研究揭示，miR-199b-5p過表達抑制C3H10T1/2細胞的生長，而促進了轉化生長因子-β3誘導C3H10T1/2細胞向軟骨細胞分化，增強軟骨細胞特異性標志物SOX9、aggrecan和II型膠原（Col2a1）的基因和蛋白表達[61]。而沉默circIGSF11被證實可以上調miR-199B-5p的表達[37]，因此推測circIGSF11/miR-199b-5p/JAG1軸可能具有調控C3H10T1/2細胞軟骨向分化的潛能。

另外，Notch途徑中重要的轉錄因子kappa J區(qū)重組信號結合蛋白（RBPJ）與DAB1啟動子相互作用，而不與circDAB1結合。circDAB1過表達可導致RBPJ與DAB1啟動子結合增強。circDAB1通過結合 和miR-944上調RBPJ的表達水平。過表達circDAB1可促進BM-MSCs的增殖和成骨分化。因此表明circDAB1通過Noch/RBPJ途徑促進BMSCs增殖和成骨分化[62]。

3.4 其他信號通路

PI3K/AKT信號通路由Pl3K和下游效應器AKT構成，參與調控細胞存活、增殖、生長、分化等生理過程。有報道circAFF4/miR-7223-5p/PIK3R1軸在骨折愈合過程中具有促進作用[55]。

此外有學者發(fā)現(xiàn)circRNA_3140與Toll樣受體信號通路和NF-κB信號通路相關。circRNA_3140可作為miR-21的分子海綿， 間接靶向激活素受體IIB在機械力誘導PDLSCs成骨分化中發(fā)揮關鍵作用[50]。

4 CircRNAs對成骨相關因子和蛋白的調控作用

4.1 矮小相關基因RUNX

矮小相關轉錄因子，又稱RUNX因子，蛋白質定位于亞核區(qū)域，并在基因啟動子調控復合物的形成過程整合細胞信號[61]。哺乳動物的RUNX轉錄因子由RUNX1、RUNX2和RUNX3組成，其中RUNX2在胚胎發(fā)育和骨骼發(fā)育過程中起著至關重要的作用[63]。已有大量研究表明CircRNAs能通過miRNA海綿作用調控RUNX因子參與組織成骨分化過程，例如：circRUNX2通過拮抗miR-203，間接促進RUNX2的表達，從而發(fā)揮正向調控成骨分化的生物學功能[30]。在BMP2誘導的BM-MSCs成骨分化過程中circRNA_33287作為miR-214-3p的分子海綿，miR-214-3p可靶向RUNX3的3’端非編碼區(qū)來調控表達[11]。Xu等研究發(fā)現(xiàn)，circ_0011269在骨質疏松癥患者標本中低表達，并驗證了circRNA_0011269/miR-122和miR-122/RUNX2的靶向關系，證實了circRNA_0011269可以通過miR-122調控RUNX2的表達水平[28]。同樣，Han等發(fā)現(xiàn)circ_0076690可通過靶向miR-152調控RUNX2，進而促進BMSCs的成骨分化[31]。

另外，在硅酸氫鈣微粒誘導的BM-MSCs中敲低circRNA_1983的表達水平后，miR-6931表達水平上調，其靶基因Gas7和RUNX2的表達水平下降，成骨分化受到抑制[34]。circRNA_0026827通過miR-188-3p的分子海綿，間接調控下游BECLIN 1和RUNX1信號通路，進而促進人DPSCs向成骨細胞分化[43]。Yang等證實，人BM-MSCs中 circ-VANGL1通過靶向miRNA-217來調節(jié)RUNX2的表達，從而促進其成骨分化進程[27]。

4.2 骨形態(tài)發(fā)生蛋白

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號通路在許多物種中高度保守，其在骨骼系統(tǒng)模式形成中具有重要性。BMP信號通路的紊亂會導致嚴重的骨缺損。這一途徑是通過BMP配體與BMP受體I型和II型結合，進一步激活細胞內的Smads（Smad1、Smad5和Smad8）蛋白，Smads磷酸化可以與co-Smad4結合形成復合物，該復合物可以移位到細胞核并觸發(fā)骨相關基因的表達[64]。

在降鈣素基因相關肽誘導的小鼠胚胎成骨細胞前體細胞（MC3T3）中，mm9_circ_009056的表達上調，而miR-22-3p的表達明顯降低。沉默mm9_circ_009056可增加miR-22-3p的表達，降低BMP7、RUNX2的基因和蛋白水平。后續(xù)實驗進一步證實mm9_circ_009056可作為miR-22-3p的分子海綿調控BMP7、RUNX2的表達，進而發(fā)揮促進小鼠胚胎成骨細胞前體細胞成骨分化的生物學作用[52]。此外，Ge等報道circSIPA1L1通過吸附miR-617影響下游靶基因Smad3的表達水平，進而促進DPSCs成骨[65]。

Chen等發(fā)現(xiàn)在大鼠牙囊細胞成骨分化過程中，circFGFR2和BMP6表達增加，miR-133表達降低。在此之前已有研究發(fā)現(xiàn)circFGFR2可以通過用靶向結合海綿miR-133a-5p和miR-29b-1-5p促進骨骼肌增殖和分化[66]。因此猜想circFGFR2/miR-133/BMP6可能在牙齒再生和骨形成過程中發(fā)揮重要作用[10]。

4.3 人源重組蛋白

人源重組蛋白（Nell-1）是一種分泌型成骨生長因子。circRFWD2和circINO80可以調節(jié)Hsa-miR-6817-5p的表達，并影響重組NELL-1誘導的人脂肪干細胞的成骨分化[47]。骨不連患者的BM-MSCs中circRNA_0074834的表達降低。circRNA_0074834可作為ceRNA 靶向miR-942-5p調控ZEB1和VEGF的表達，進而促進BM-MSCs的成骨分化和骨缺損的修復[35]。

4.4 整合素5

有報道稱circRNA-vgll3通過直接靶向miR-326-5p調控ADSCs的成骨分化，miR-326-5p通過抑制整合素5（integrin alpha5，ITGA5 ）的翻譯而阻斷成骨分化。ITGA5屬于整合素受體家族，介導細胞粘附。在研究中，circRNA-vgll3可以顯著促進ITGA5的表達，因此，過表達circRNA-vgll3的ADSCs可能具有更強的細胞粘附能力，包括歸巢效應和骨祖細胞募集。此外，ITGA5與骨形成過程密切相關。在體內實驗中，將ADSCs附載于 CPC支架上，在過表達circRNA-vgll3組中缺損區(qū)新骨形成水平顯著增加，證實circRNA-vgll3可增強骨的粘附、增加骨祖細胞募集和促進成骨分化[46]。

4.5 骨糖蛋白

骨糖蛋白（Osteoglycin, OGN）也被稱為骨誘導因子或Mimecan，是一種分泌到細胞外基質中的富含亮氨酸的小蛋白多糖，最初是從牛骨中分離出來的，作為基質礦化的誘導劑，在調節(jié)骨骼對改變能量平衡的適應性反應中起著關鍵作用[67]。Wen等發(fā)現(xiàn)，circ_0076906可以結合miR-1305并調節(jié)其靶基因OGN的表達，從而調節(jié)人BMMSCs的成骨分化，減緩骨質疏松的進展[26]。

4.6 A激酶錨定蛋白2

A激酶錨定蛋白2（A-kinase anchoring protein 2，AKAP2）可能參與信號通路中的極性形成或參與構建PKA-RII效應物復合物，以捕獲、擴增和聚焦彌散性跨細胞cAMP信號傳導系統(tǒng)[68]。許多研究揭示AKAP2的突變與骨疾病有關，其被鑒定為中國特發(fā)性脊柱側彎家庭突變的新基因[68]。Lin等發(fā)現(xiàn)，抑制circ-SLC8A1可降低BMSCs礦化結節(jié)的形成，其機制主要是circ-SLC8A1可以充當ceRNA，通過miRNA海綿作用調節(jié)miR-516b-5p進一步調節(jié)AKAP2的表達，進而促進BMSCs的成骨分化[36]。

4.7 FoXO1因子

FoXO1是FOXO的O類成員，是骨骼中酶抗氧化防御的主要調節(jié)劑，在成骨細胞中敲除FoXO1會降低骨量和成骨細胞，而在成骨細胞中FoXO3或FoXO4不會影響骨量，研究表明FoXO1是預防和治療骨質疏松癥的潛在靶標，F(xiàn)oXO1通過調節(jié)成骨細胞的增殖和氧化還原平衡來促進骨形成[69]。在糖皮質激素誘發(fā)的骨質疏松癥研究中發(fā)現(xiàn)， circ_0006393通過調控miR-145-5p并上調FoXO1來提高骨重塑過程中成骨基因的表達水平，進而促進細胞成骨分化，GioP小鼠模型也證實了circ_0006393的促成骨潛能[33]。

5 結語

目前骨缺損和骨質疏松等骨疾病的診斷及治療方法仍在不斷的更新迭代中，近年來CircRNAs在生物礦化中所發(fā)揮的生物學作用已受到廣泛研究及關注，但在基因表達及調控方面尚待解決的問題還有很多，例如在不同細胞系之間CircRNAs-miRNAs調控網(wǎng)絡是否成立；在CircRNAs調控網(wǎng)絡中，各通路之間是否存在一定的協(xié)同作用；CircRNAs-miRNAs-mRNAs軸在成骨過程中調控方式以及其相互作用的具體分子機制。與此同時，CircRNAs能否通過翻譯蛋白或直接結合蛋白來調控成骨還有待研究。對CircRNAs在成骨分化中的進一步深入研究將為骨缺損和骨質疏松等骨疾病的診斷和治療提供新的思路。